一种毛囊祖细胞的注射药剂的制作方法

本发明属于毛发再生领域，尤其涉及一种毛囊祖细胞的注射药剂。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：脱发是指头发脱落的现象。正常脱落的头发都是处于退行期及休止期的毛发，由于进入退行期与新进入生长期的毛发不断处于动态平衡，故能维持正常数量的头发。病理性脱发是指头发异常或过度的脱落，其原因很多：(1)雄激素性脱发，为常染色体显性遗传,其遗传特征需在雄激素作用下才表现出来；(2)神经性脱发，精神压力过大时常常出现脱发增多，在精神压力的作用下，人体立毛肌收缩、头发直立，植物神经或中枢神经机能发生紊乱，毛囊毛乳头发生改变和营养不良，从而导致毛发生长功能抑制，毛发进入休止期而出现脱发；(3)内分泌脱发，毛发生长受多种内分泌激素的影响，所以当发生内分泌异常时多引起脱发疾病，如产后、更年期脱发；(4)营养性脱发，毛发是身体状况的外在表现，机体营养不良和新陈代谢异常可引起发质和发色的改变，严重营养不良甚至导致弥漫性脱发；(5)物理性脱发，常见的引起脱发的物理性因素包括机械性刺激和接触放射性物质；(6)化学性脱发，化学因素可以导致毛发颜色改变甚至脱发；(7)感染性脱发，各种病原体的感染是毛发疾病中一类重要因素，主要包括细菌、病毒、真菌、螺旋体、寄生虫等感染；(8)症状性脱发，某些系统性或局部疾病都可伴发脱发；(9)先天性脱发，发育缺陷所引起的头发完全缺失或稀疏，患者常见头发稀疏细小，或出生时头发正常，不久就脱落不再生，可分为孤立缺陷和其他畸形；(10)季节性脱发，一般夏季容易脱发，因为夏天温度高毛孔扩张导致脱发，秋冬之际不易脱发，因为这时期温度下降毛孔闭合。其中，男性区域秃发是一种常见疾病，其经常是通过头发的移植手术而治疗。在此过程中，来自非秃发区域的头皮内的毛囊被切除下来，并且通过再移植从而实现满头全发的梦想。事实上，在此过程中，由于能够获得用于重新分布的毛囊的数量有限，因此没有形成新头发。

综上所述，现有技术存在的问题是：男性区域性秃发频发，目前治疗这种秃发一般采取头发移植来治疗。在此过程中，由于能够获得用于重新分布的毛囊的数量有限，因此没有形成新头发。

解决上述技术问题的难度和意义：本发明对离体的毛囊祖细胞进行各种处理，毛囊祖细胞来源丰富，首先通过分离酶对其进行消化，然后切取毛囊隆突部，再通过胰蛋白酶对隆突部进行消化，并对其进行分离、培养、再分离、再培养，再次收集培养后的上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞，经过培养得到毛囊祖细胞，进一步培养形成毛囊祖细胞簇。本发明制备的毛囊祖细胞簇注射药剂适合在人的头皮种植，对秃发治疗效果明显，且较少产生免疫排斥。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种毛囊祖细胞的注射药剂，

本发明是这样实现的，一种毛囊祖细胞的注射药剂，其制备步骤包括：毛囊祖细胞的获取和毛囊祖细胞簇的形成。

进一步，毛囊祖细胞的获取包括以下步骤：

步骤一：利用分离酶对离体的毛囊进行第一消化培养；

步骤二：切取第一次消化后毛囊的毛囊隆突部进行第二消化培养；

步骤三：利用胰酶对第二次消化后获得的毛囊隆突部进行第三次消化培养；

步骤四：终止消化，对经过三次消化处理得到的毛囊隆突部进行离心收集得到毛囊细胞；

步骤五：将毛囊细胞在无血清的含各种氨基酸和葡萄糖的培养液中培养，进行初步分离，获得初步分离产物；

步骤六：将初步分离产物置于培养皿中培养，离心后收集得到毛囊表皮中的角质祖细胞和毛囊真皮中特殊的成纤维细胞，即毛囊真皮乳头细胞；

步骤七：取上层毛囊真皮乳头细胞进行培养，得到毛囊祖细胞。

进一步，步骤一中，利用分离酶对离体的毛囊进行第一消化培养，具体为：

(1)取头发数根，利用75％酒精冲洗2～次；

(2)截取生长期的毛囊组织，剪碎，利用0.35％分离酶，34℃～36℃，消化35-40min；

(3)25℃,1000r/min离心2～4min，去除上清，将毛囊组织和消化的细胞种入36孔板中，6％co2孵育箱培养。

进一步，步骤二中，采用在解剖显微镜下切取步骤一得到毛囊隆突部。

进一步，步骤三中，利用胰酶对第二次消化后获得的毛囊隆突部进行第三次消化培养，具体为：

(1)取第二次消化后获得的毛囊隆突部，剪碎，利用0.65ml0.20％胰酶+0.06％edta，37℃消化5min，多次吹打；

(2)25℃，800r/min离心6～8min，取上清液置ep管中，加入0.65mldmem/f12培养液；

(3)利用0.65ml0.20％胰酶+0.06％edta消化3min，25℃,800-1200r/min离心2～4min，去除上清，将毛囊组织和消化的细胞种入36孔板中，6％co2孵育箱培养。

进一步，步骤五中，初步分离优选采用密度梯度离心。

进一步，步骤六中，培养的条件优选为培养皿中铺设有30平方厘米胶原蛋白，培养温度为37℃，5％co2。

进一步，步骤七中，培养液优选为20％血清的含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(dmem)条件培养液；培养过程中，优选为每2天换一次培养基。

进一步，毛囊祖细胞簇的形成包括以下步骤：

步骤一：取毛囊祖细胞，利用rpml1640培养基进行培养，扩增毛囊祖细胞数量；

步骤二：使经培养的毛囊祖细胞形成细胞簇；

步骤三：使用注射器收集毛囊祖细胞簇，制成药剂，冷藏备用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明对离体的毛囊祖细胞进行各种处理，毛囊祖细胞来源丰富，首先通过分离酶对其进行消化，然后切取毛囊隆突部，再通过胰蛋白酶对隆突部进行消化，并对其进行分离、培养、再分离、再培养，再次收集培养后的上层毛囊表皮中的角质祖细胞和毛囊真皮中特殊的成纤维细胞，即毛囊真皮乳头细胞，经过培养得到毛囊祖细胞，进一步培养形成毛囊祖细胞簇。本发明制备的毛囊祖细胞簇注射药剂适合在人的头皮种植，对秃发治疗效果明显，且较少产生免疫排斥。

附图说明

图1是本发明实施例提供的毛囊祖细胞的获取操作步骤流程图

图2是本发明实施例提供的毛囊祖细胞簇的形成步骤流程图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的毛囊祖细胞的注射药剂，其制备步骤包括：毛囊祖细胞的获取和毛囊祖细胞簇的形成。

下面结合附图对本发明的原理做进一步的说明：

如图1所示，本发明实施例提供的毛囊祖细胞的获取包括以下步骤：

s101：利用分离酶对离体的毛囊进行第一消化培养；

s102：切取第一次消化后毛囊的毛囊隆突部进行第二消化培养；

s103：利用胰酶对第二次消化后获得的毛囊隆突部进行第三次消化培养；

s104：终止消化，对经过三次消化处理得到的毛囊隆突部进行离心收集得到毛囊细胞；

s105：将毛囊细胞在无血清的含各种氨基酸和葡萄糖的培养液中培养，进行初步分离，获得初步分离产物；

s106：将初步分离产物置于培养皿中培养，离心后收集得到毛囊表皮中的角质祖细胞和毛囊真皮中特殊的成纤维细胞，即毛囊真皮乳头细胞；

s107：取上层毛囊真皮乳头细胞进行培养，得到毛囊祖细胞。

步骤s101中，本发明实施例提供的利用分离酶对离体的毛囊进行第一消化培养，具体为：

(1)取头发数根，利用75％酒精冲洗2～次；

(2)截取生长期的毛囊组织，剪碎，利用0.35％分离酶，34℃～36℃，消化35-40min；

(3)25℃,1000r/min离心2～4min，去除上清，将毛囊组织和消化的细胞种入36孔板中，6％co2孵育箱培养。

步骤s102中，本发明实施例提供的采用在解剖显微镜下切取步骤一得到毛囊隆突部。

步骤s103中，本发明实施例提供的利用胰酶对第二次消化后获得的毛囊隆突部进行第三次消化培养，具体为：

(1)取第二次消化后获得的毛囊隆突部，剪碎，利用0.65ml0.20％胰酶+0.06％edta，37℃消化5min，多次吹打；

(2)25℃，800r/min离心6～8min，取上清液置ep管中，加入0.65mldmem/f12培养液；

(3)利用0.65ml0.20％胰酶+0.06％edta消化3min，25℃,800-1200r/min离心2～4min，去除上清，将毛囊组织和消化的细胞种入36孔板中，6％co2孵育箱培养。

步骤s105中，本发明实施例提供的初步分离优选采用密度梯度离心。

步骤s106中，本发明实施例提供的培养的条件优选为培养皿中铺设有30平方厘米胶原蛋白，培养温度为37℃，5％co2。

步骤s107中，本发明实施例提供的培养液优选为20％血清的含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(dmem)条件培养液；培养过程中，优选为每2天换一次培养基。

如图2所示，本发明实施例提供的毛囊祖细胞簇的形成包括以下步骤：

s201：取毛囊祖细胞，利用rpml1640培养基进行培养，扩增毛囊祖细胞数量；

s202：使经培养的毛囊祖细胞形成细胞簇；

s203：使用注射器收集毛囊祖细胞簇，制成药剂，冷藏备用。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理进行进一步说明；

实施例1；

用热敷布将皮肤变暖后，将毛囊祖细胞药剂注射到希望头发生长的地方。

结果：

注射后的大约8周，头发毛囊的再生完成，患者能够开始体验新的、组织工程的头发的生长，该生长的头发完全正常而且与供体部位的头发一样。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。