一种具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的制作方法

本发明属于医药保健品技术领域，具体涉及一种具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂。

背景技术：

良性前列腺增生(benignprostatichyperplasia，bph)是由前列腺上皮与基质细胞的过度增生，导致前列腺体积增大，从而引起尿频和尿急等临床症状。良性前列腺增生与前列腺癌和前列腺炎并称为前列腺的三大疾病，良性前列腺增生症通常发生在40岁以后，到60岁时发病大于50％，80岁时高达83％，在男性老年人口中，前列腺疾病已经成为了发病率最高的疾病。随着我国老龄化进程的发展，发病的比例和人数也将随之上升。不论是内分泌药物的治疗，还是通过手术、放疗和化疗的治疗其效果都不是十分理想，并且这些治疗也会带来一定的副作用。近年来在灵芝具有提高免疫，抗癌，降血糖和抗疲劳等生物活性的基础上，本发明人又发现了灵芝的乙醇提取物和三萜成分具有显著地抑制前列腺细胞增殖，抑制前列腺上雄性激素的受体表达的作用，并且灵芝和中草药在预防和治疗bph方面具有更好协同优势，不仅毒副作用小，而且可以有效减轻患者的痛苦，改善生活质量。

肝脏是机体解毒和调节糖、脂代谢平衡的主要器官。随着人们生活水平的提高和生活环境(水、空气、食品等)的变化，肝病发病率呈逐年上升趋势。如病毒性肝炎、异源性肝损伤(酒精或药物、杀虫剂、致癌物等引起)、肝纤维化及自身免疫性肝炎等在全球范围内严重威胁着人类健康。临床上多种药物也可以引起肝损伤，如抗菌药物、非甾体抗炎药、中枢抑制药、抗肿瘤药、抗甲状腺药、免疫抑制剂、降糖药、降脂药等。此外，护肝药物本身也具有潜在的肝损害问题。目前开发的保肝药以合成药物为主，这些药物毒副作用比较大，寻找防治肝病的无毒副作用的天然药物显得尤为迫切。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂，其包括，灵芝多糖、黄芪多糖、灵芝酸a、灵芝酸g、灵芝酸d、灵芝酮三醇及灵芝酸dm；

其中，以质量百分比计，灵芝多糖含量为2.5～3.5％、黄芪多糖含量为1.8～2.4％、灵芝酸a含量为0.0008～0.0012％、灵芝酸g含量为0.0004～0.0006％、灵芝酸d含量为0.0004～0.0006％、灵芝酮三醇含量为0.0007～0.0009％、灵芝酸dm含量为0.0004～0.0006％。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：以质量百分比计，灵芝多糖含量为3.0％、黄芪多糖含量为2.1％、灵芝酸a含量为0.001％、灵芝酸g含量为0.0005％、灵芝酸d含量为0.0005％、灵芝酮三醇含量为0.0008％、灵芝酸dm含量为0.0005％。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：所述灵芝制剂，包括灵芝醇提物、灵芝水提物、黄芪水提物。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：所述灵芝制剂，其制备方法包括，

制备灵芝醇提物：将灵芝子实体干燥粉碎、加入乙醇，热回流提取，过滤收集滤渣和滤液，滤液浓缩得到浓缩液，喷雾干燥粉碎得到灵芝醇提物；

制备灵芝水提物：将所述滤渣加热提取，浓缩，得到灵芝水提物；

制备黄芪水提物：将黄芪加热提取，浓缩，得到黄芪水提物；将所述灵芝醇提物、灵芝水提物、黄芪水提物混合。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：所述制备灵芝醇提物，为将1重量份灵芝子实体干燥粉碎至20～40目，加入浓度为80～95％的乙醇，浸泡2h后，热回流提取2次，过滤收集滤渣，将滤液于60～75℃真空按1：1体积浓缩得到浓缩液，高速离心除杂，将所述浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，之后喷雾干燥粉碎获得到灵芝醇提物。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：所述热回流提取，温度为70～80℃。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：所述制备灵芝水提物，为将所述滤渣风干后，使用10倍体积饮用水，100℃提取2次，每次各1h，结束加少量水冲洗，过滤后合并水提物，60～75℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎得到灵芝水提物。

作为本发明所述的具有抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的一种优选方案：所述制备黄芪水提物，为将干燥的4份黄芪粉碎至2～10目，加入20倍体积饮用水，100℃提取2次，每次各2h，过滤后合并水提物，60～75℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎得到黄芪水提物。

本发明的有益效果：本发明在灵芝制剂抑制前列腺增生和保肝护肝的基础上，将其与黄芪进行配伍，协同发挥各药材抑制前列腺增生、保肝养肝、提高免疫的功效，所得灵芝片剂可抑制前列腺增生、改善慢性肝炎，并有效防止病情复发、恶化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为不同实施例的样品对lncap细胞增殖的抑制作用图。

图2为不同实施例的样品对22rv1细胞增殖的抑制作用图。

图3为不同实施例的样品对过氧化氢损伤hepg2细胞的修复作用图。

图4为不同实施例的样品对raw264.7释放no的作用图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂组分，以质量百分比计，包括，控制灵芝制剂中灵芝多糖含量3.0％、黄芪多糖含量2.1％、灵芝酸a含量0.001％、灵芝酸g含量0.0005％、灵芝酸d含量0.0005％、灵芝酮三醇含量0.0008％、灵芝酸dm含量0.0005％。

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的制备方法：

将1份(重量份)沪农灵芝1号子实体干燥粉碎至40目，加8倍体积80％乙醇，浸泡2h后，80℃热回流提取2次，第一次2h，第二次1h，过滤收集滤渣，将滤液于60℃真空按1：1体积浓缩得到浓缩液，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝醇提物0.05重量份；

将所述滤渣风干后，加入10倍体积的水，100℃提取2次，每次各1h，结束加少量水冲洗，过滤后合并水提物，60℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝水提物0.06重量份；

将干燥的4份黄芪粉碎至2目，加入20倍体积饮用水，100℃提取2次，每次各2h，过滤后合并水提物，70℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎得到黄芪提取物0.40重量份；

得到的所述灵芝醇提物、灵芝水提物和黄芪提取物混合。

实验结果：

lncap，22rv1细胞的抑制率检测：

将细胞浓度为5×10⁴个/ml肿瘤细胞lncap，22rv1(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)悬浮液180μl加入96孔板中，待24h后加入20μl实施例1的提取物样品，以dmso为阴性对照，非那雄胺为阳性对照，每个样品设3个重复，在37℃、5％浓度的co2条件下培养72h后，吸去旧培养基加入180μl无色1640培养基(美国thermofsherscientific公司)，20μl0.075mg/ml的alamarblue试剂(美国thermofisherscientific公司)，待变色后用酶联免疫检测仪于570和600nm下测吸光值，用公式计算样品对细胞增殖的影响。

当实施例1样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为68.91％，22rv1的抑制率为62.69％。

对过氧化氢对hepg2细胞的修复率检测：

用胰酶将对数生长期的hepg2细胞消化，将细胞浓度为1×10⁴个/ml细胞hepg2(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)悬浮液180μl加入96孔板中，待24h后加入60μmol/l的过氧化氢处理液处理12h后，将培养基吸出，加入20μl实施例1(工作浓度100μg/ml)的提取物样品，以dmso为阴性对照，维生素c(vc)为阳性对照，每个样品设3个重复，在37℃、5％浓度的co2条件下培养72h后，吸去旧培养基加入180μl无色1640培养基(美国thermofsherscientific公司)，20μl0.075mg/ml的alamarblue^@试剂(美国thermofisherscientific公司)，待变色后用酶联免疫检测仪于570和600nm下测吸光值，用公式计算样品对细胞增殖的影响。

当实施例1样品作用浓度为100μg/ml时，对过氧化氢对hepg2损伤修复的修复率为52.56％。

对raw264.7释放no影响的检测：

选择生长良好的对数期raw264.7细胞制成细胞悬液，将细胞密度调整为5×10⁵/ml，以每孔180μl细胞悬液接种于96孔板。用griess反应测定不同浓度亚硝酸钠溶液在543nm处的吸光值，绘制no标准曲线。对实施例1(工作浓度100μg/ml)的提取物样品刺激巨噬细胞释放no量进行测定，pbs和含有1μg/mllps的pbs溶液分别作阴性和阳性对照，543nm处测样品液吸光值，根据标准曲线计算培养液中的no生成量。

当实施例1样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为42.19μm/l。

实施例2：

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂组分，以质量百分比计，包括，控制灵芝制剂中灵芝多糖含量2.9％、黄芪多糖含量2.0％、灵芝酸a含量0.001％、灵芝酸g含量0.0004％、灵芝酸d含量0.0005％、灵芝酮三醇含量0.0006％、灵芝酸dm含量0.0005％。

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的制备方法：

将1份(重量份)沪农灵芝1号子实体干燥粉碎至40目，加8倍体积95％乙醇，浸泡2h后，80℃热回流提取2次，第一次2h，第二次1h，过滤收集滤渣，将滤液于60℃真空按1：1体积浓缩得到浓缩液，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝醇提物0.04重量份；

将所述滤渣风干后，加入10倍体积的水，100℃提取2次，每次各1h，结束加少量水冲洗，过滤后合并水提物，60℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝水提物0.03重量份；

将干燥的4份黄芪粉碎至2目，加入20倍体积饮用水，100℃提取2次，每次各2h，过滤后合并水提物，70℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎得到黄芪提取物0.40重量份；

得到的所述灵芝醇提物、灵芝水提物和黄芪提取物混合。

实验结果：

lncap，22rv1细胞的抑制率检测：

将细胞浓度为5×104个/ml肿瘤细胞lncap，22rv1(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)悬浮液180μl加入96孔板中，待24h后加入20μl实施例1的提取物样品，以dmso为阴性对照，非那雄胺为阳性对照，每个样品设3个重复，在37℃、5％浓度的co2条件下培养72h后，吸去旧培养基加入180μl无色1640培养基(美国thermofsherscientific公司)，20μl0.075mg/ml的alamarblue^@试剂(美国thermofisherscientific公司)，待变色后用酶联免疫检测仪于570和600nm下测吸光值，用公式计算样品对细胞增殖的影响。

当实施例2样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为39.81％，前列腺肿瘤细胞22rv1的抑制率为38.59％。

对过氧化氢对hepg2细胞的修复率检测：

用胰酶将对数生长期的hepg2细胞消化，将细胞浓度为1×10⁴个/ml细胞hepg2(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)悬浮液180μl加入96孔板中，待24h后加入60μmol/l的过氧化氢处理液处理12h后，将培养基吸出，加入20μl实施例1(工作浓度100μg/ml)的提取物样品，以dmso为阴性对照，维生素c(vc)为阳性对照，每个样品设3个重复，在37℃、5％浓度的co2条件下培养72h后，吸去旧培养基加入180μl无色1640培养基(美国thermofsherscientific公司)，20μl、0.075mg/ml的alamarblue^@试剂(美国thermofisherscientific公司)，待变色后用酶联免疫检测仪于570和600nm下测吸光值，用公式计算样品对细胞增殖的影响。

当实施例2样品作用浓度为100μg/ml时，对过氧化氢对hepg2损伤修复的修复率为39.14％。

对raw264.7释放no影响的检测：

选择生长良好的对数期raw264.7细胞制成细胞悬液，将细胞密度调整为5×10⁵/ml，以每孔180μl细胞悬液接种于96孔板。用griess反应测定不同浓度亚硝酸钠溶液在543nm处的吸光值，绘制no标准曲线。对实施例2(工作浓度100μg/ml)的提取物样品刺激巨噬细胞释放no量进行测定，pbs和含有1μg/mllps的pbs溶液分别作阴性和阳性对照，543nm处测样品液吸光值，根据标准曲线计算培养液中的no生成量。

当实施例2样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为28.53μm/l。

实施例3(对照例)：

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂组分，以质量百分比计，包括，灵芝制剂中灵芝多糖含量2.18％、黄芪多糖含量1.90％。

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的制备方法：

将1份(重量份)沪农灵芝1号子实体干燥粉碎至40目，加入10倍体积的水，100℃提取2次，每次各1h，结束加少量水冲洗，过滤后合并水提物，60℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝水提物0.03重量份；

将干燥的4份黄芪粉碎至2目，加入20倍体积饮用水，100℃提取2次，每次各2h，过滤后合并水提物，70℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎得到黄芪提取物0.40重量份；

得到的灵芝水提物和黄芪提取物混合。

当实施例3样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为11.25％，前列腺肿瘤细胞22rv1的抑制率为9.18％。

当实施例3样品作用浓度为100μg/ml时，对h2o2对hepg2损伤修复的修复率为2.56％。

当实施例3样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为15.46μm/l。

实施例4(对照例)：

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂组分，以质量百分比计，包括，控制所述灵芝制剂中灵芝多糖含量3.68％、灵芝酸a含量0.0017％、灵芝酸g含量0.0006％、灵芝酸d含量0.0008％、灵芝酮三醇含量0.0009％、灵芝酸dm含量0.0005％。

本发明抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的灵芝制剂的制备方法：

将2份(重量份)沪农灵芝1号子实体干燥粉碎至2目，加8倍体积80％乙醇，浸泡2h后，80℃热回流提取2次，第一次2h，第二次1h，过滤收集滤渣，将滤液于60℃真空按1：1体积浓缩得到浓缩液，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝醇提物0.10重量份；

将所述滤渣风干后，加入10倍体积的水，100℃提取2次，每次各1h，结束加少量水冲洗，过滤后合并水提物，60℃真空1：1体积浓缩，高速离心除杂，浓缩液继续浓缩至原体积的1/3，喷雾干燥粉碎获得灵芝水提物0.12重量份；

得到的所述灵芝醇提物、灵芝水提物混合。

当实施例4样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为19.51％，前列腺肿瘤细胞22rv1的抑制率为22.73％。

当实施例4样品作用浓度为100μg/ml时，对h2o2对hepg2损伤修复的修复率为13.99％。

当实施例4样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为14.44μm/l。

实施例5：

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂，以质量百分比计，其组分包括，控制灵芝制剂中灵芝多糖含量3.0％、黄芪多糖含量2.1％、灵芝酸a含量0.001％、灵芝酸g含量0.0005％、灵芝酸d含量0.0005％、灵芝酮三醇含量0.0008％、灵芝酸dm含量0.0005％，其余为水。

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂各组分均购自市售标志物。

当实施例5样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为63.37％，前列腺肿瘤细胞22rv1的抑制率为57.83％。

当实施例5样品作用浓度为100μg/ml时，对h2o2对hepg2损伤修复的修复率为47.10％。

当实施例5样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为36.94μm/l。

实施例6(对照例)：

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂，以质量百分比计，其组分包括，灵芝多糖含量3.0％、黄芪多糖含量2.1％，其余为水。

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂各组分均购自市售标志物。

当实施例6样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为8.12％，前列腺肿瘤细胞22rv1的抑制率为6.52％。

当实施例6样品作用浓度为100μg/ml时，对h2o2对hepg2损伤修复的修复率为6.01％。

当实施例6样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为26.13μm/l。

实施例7(对照例)：

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂，以质量百分比计，其组分包括，灵芝酸a含量0.001％、灵芝酸g含量0.0005％、灵芝酸d含量0.0005％、灵芝酮三醇含量0.0008％、灵芝酸dm含量0.0005％，其余为水。

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂各组分均购自市售标志物。

当实施例7样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为14.73％，前列腺肿瘤细胞22rv1的抑制率为13.53％。

当实施例7样品作用浓度为100μg/ml时，对h2o2对hepg2损伤修复的修复率为30.29％。

当实施例7样品作用浓度为100μg/ml时，no释放量为15.42μm/l。

实施例8(对照例)：

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂，以质量百分比计，其组分包括，灵芝多糖含量2.18％、灵芝酸a含量0.012％、灵芝酸f含量0.006％、灵芝酮三醇含量0.006％、灵芝醇b含量0.006％，其余为水。

抑制前列腺增生、保肝、提高免疫三重功效的制剂各组分均购自市售标志物。

按实施例1方法进行lncap，22rv1细胞的抑制率检测：样品作用浓度为100μg/ml时，前列腺肿瘤细胞lncap的抑制率为12.76％，22rv1的抑制率为16.20％。

按实施例1方法进行对过氧化氢对hepg2细胞的修复率检测：样品作用浓度为100μg/ml时，对过氧化氢对hepg2损伤修复的修复率为10.52％。

综上，在灵芝制剂抑制前列腺增生和保肝护肝的基础上，将其与黄芪进行配伍，协同发挥各药材抑制前列腺增生、保肝养肝、提高免疫的功效，所得灵芝片剂可抑制前列腺增生、改善慢性肝炎，并有效防止病情复发、恶化。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。