醋酸棉酚和自噬抑制剂的联合用药物的制作方法

本发明涉及用于治疗肿瘤的联合用药物，具体涉及醋酸棉酚(gossypolaceticacid，gaa)和自噬抑制剂的联合用药物。

背景技术：

癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。现阶段由于癌症早期诊断和筛查技术的不足，很大一部分癌症病人在初次就诊时就已经是处于肿瘤晚期，丧失了手术切除治愈的机会。化疗以及放疗仍然是现阶段晚期肿瘤的主要治疗手段。然而，这种治疗方法疗效有限，绝大部分病人最终都会复发，此外该种方法具有非常大的副作用，极大的降低了患者生存质量。

肿瘤靶向治疗是针对肿瘤特异性表达的功能分子，设计开发靶向性的抑制剂包括抗体、小分子、生物载体等。该类靶向性分子可以特异性抑制肿瘤细胞的生长、运动及化疗抵抗等功能，而对正常的组织细胞不具有破坏作用。因此，靶向治疗可以极大的延长患者的生存时间及生存质量。因此开发新的肿瘤靶向治疗药物具有重要意义。

醋酸棉酚(gaa)是存在于棉籽中的广泛分布的天然产物，此前已有研究表明，醋酸棉酚具有一定的抗肿瘤作用，但其作用机制仍不完全清楚，现阶段所有的把gaa作为bcl2蛋白抑制剂的临床试验都以失败告终。探索gaa的作用机制，构建新型的gaa药物组合，对于gaa的临床推广具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种醋酸棉酚(gossypolaceticacid，gaa)和自噬抑制剂的联合用药物。该联合用药可以显著抑制肿瘤细胞生长，且具有协同增效作用。

为此，第一方面，本发明提供lrpprc负调节剂在诱导肿瘤细胞自噬中的应用。

其中，所述lrpprc负调节剂是lrpprc降解剂，优选醋酸棉酚。

第二方面，本发明提供lrpprc负调节剂与自噬抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中，所述lrpprc负调节剂是lrpprc降解剂，优选醋酸棉酚。

第三方面，本发明提供lrpprc负调节剂在制备自噬抑制剂抗肿瘤活性增效剂中的应用。

其中，所述lrpprc负调节剂是lrpprc降解剂，优选醋酸棉酚。

第四方面，本发明提供一种药物，其包括a)lrpprc负调节剂，以及b)自噬抑制剂。

其中，所述的lrpprc负调节剂为lrpprc降解剂，优选醋酸棉酚。

其中，所述自噬抑制剂选自3-甲基腺苷，渥曼青霉素，ly294002，硫酸羟氯喹，巴弗洛霉素a1，去甲氯丙咪嗪，苯基乙炔磺酰胺中的一种或几种，优选巴弗洛霉素a1或硫酸羟氯喹。

进一步，本发明所述的药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

第五方面，本发明提供所述药物在制备下述产品中的应用：

1)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；2)预防和/或治疗肿瘤疾病的药物。

其中，所述肿瘤细胞为癌细胞，所述癌细胞优选为肺癌细胞、乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、结直肠癌细胞和前列腺癌细胞，优选肺腺癌细胞、肺鳞癌细胞、乳腺癌细胞、乳腺导管癌细胞。

其中，所述肿瘤疾病包括肺癌、乳腺癌、乳腺导管癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌，优选肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、乳腺导管癌。

本文所用药物名或商品名称仅表示其活性成分，不应视为对所述药物来源的限制。

术语“载体”或“赋形剂”可以是制药领域中任何常规的载体和赋形剂。具体的载体和赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以包括香味剂、防腐剂和甜味剂等。

前期研究表明，lrpprc(富含亮氨酸的三角状五肽重复基序蛋白)是一种线粒体蛋白，它的突变与细胞色素c氧化酶缺陷(cytochromecoxidasedeficiency)及leigh综合征(leighsyndrome)的发生密切相关；beclin-1蛋白具有诱导细胞自噬的作用，而lrpprc蛋白可以与beclin-1形成复合物，从而抑制细胞的自噬过程。

同时，本发明筛选到的lrpprc特异性小分子抑制剂醋酸棉酚(gaa)，经本发明研究发现，gaa与lrpprc结合，不仅可以抑制lrpprc蛋白的核酸结合功能，而且可以直接降解lrpprc蛋白，诱导细胞自噬。而细胞自噬可以保护细胞度过逆境，因此发明人推测，同时抑制自噬过程可以增强gaa的抗癌效果。经本发明进一步的研究证明，gaa与自噬抑制剂的联用可显著抑制癌细胞的生长、克隆形成能力，且比单药使用显示出更强的抑制效果，具有协同性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供了gaa和自噬抑制剂的联合用药物，用于抑制肿瘤生长时效果显著，并且显著优于二者单独使用，说明二者联合使用可以发挥协同增效的作用。

(2)gaa和自噬抑制剂已经分别被证实可用于临床治疗，安全性高，故本发明为临床治疗肿瘤疾病提供了一种新的、更有效的治疗方案，临床应用前景良好。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为肺腺癌细胞系a549中lc3b-i、lc3b-ii和lrpprc蛋白的westernblot检测图，其中以actin蛋白的杂交信号作为衡量上样量的内参。

图2为肺腺癌细胞系a549的荧光共聚焦显微镜成像结果图。

图3为肺癌细胞系h460、肺腺癌细胞系a549、肺癌细胞系h1299三种癌细胞经处理后的相对细胞活力图，图a为经gaa与hcq处理，图b为经gaa与bafilomycina1处理。

图4为肺腺癌pdx模型的瘤块中lrpprc蛋白的westernblot检测图，其中以actin蛋白的杂交信号作为衡量上样量的内参。

图5为肺腺癌pdx模型的瘤体生长曲线。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例中未注明具体条件者，按照分子生物学与免疫学的常规实验条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1gaa降解lrpprc诱发细胞自噬

本实施例通过westernblot实验和免疫荧光实验，验证gaa可降解lrpprc诱发细胞自噬。实验步骤如下：

westernblot实验：

将肺腺癌细胞系a549消化后，接种于φ100mm的培养皿中，使用gaa分别进行浓度梯度与时间梯度实验：

(1)浓度梯度实验：分别用不同浓度的gaa(0μm、1μm、5μm、10μm)处理细胞，培养48h后，收集、裂解细胞，取40μg蛋白总量用进行westernblot实验，检测lc3蛋白表达量。

(2)时间梯度实验：用终浓度10μm的gaa处理细胞，分别作用8h、16h、24h。收集、裂解细胞，40μg蛋白总量用于westernblot实验，检测lc3蛋白。在未发生自噬的时候，lc3主要以lc3b-i的形式存在，发生自噬后，以lc3b-ii的形式存在。westernblot检测结果见图1。

免疫荧光实验：

将肺腺癌细胞系a549消化后，接种于激光共聚焦培养皿，培养24h后，添加终浓度为10μm的gaa，同时设置空白对照组(添加10μm的dmso)，培养48h，洗涤后用4％多聚甲醛固定5min，再用0.1％tritonx-100通透5min后用pbs缓冲液洗涤。1:200稀释lc3抗体(abcam公司，货号ab192890)后孵育细胞玻片，4℃孵育过夜后用pbs缓冲液洗涤。1:200稀释fitc荧光标记的二抗，彻底洗涤后，用激光共聚焦显微镜采集绿色荧光信号。荧光成像结果见图2。

由图1可知，经gaa处理后，lrpprc的表达量显著下降。进一步通过免疫荧光实验，由图2可知，经gaa处理后，自噬标志物lc3的颗粒性着色显著增加，说明gaa处理能够降低lrpprc的表达量，进一步诱导细胞自噬。

实施例2gaa与细胞自噬抑制剂联用在细胞水平抑制细胞活性

本实施例将gaa分别与硫酸羟氯喹(hcq)和bafilomycina1(baf-a1)进行联用，验证gaa与细胞自噬抑制剂联用可在细胞水平抑制细胞活性。实验步骤如下：

gaa与硫酸羟氯喹(hcq)联用实验：

将肺癌细胞系h460、肺腺癌细胞系a549、肺癌细胞系h1299三种癌细胞消化后，分别接种于96孔板中，每孔2000个细胞，24h后分别用gaa处理(10μm)，hcq(5μm)处理或者两者联用处理(gaa10μm，hcq5μm)，以10μm的dmso处理作为空白对照组(nc组)。48h后用mts法检测各个孔的吸光度，以nc组的吸光度值进行归一化处理。检测得到的细胞活性值见图3(a)。

gaa与bafilomycina1(baf-a1)联用实验：

将肺癌细胞系h460、肺腺癌细胞系a549、肺癌细胞系h1299三种癌细胞消化后，分别接种于96孔板中，每孔2000个细胞，24h后分别用gaa处理(10μm)，baf-a1(100nm)处理或者两者联用处理(gaa10μm，baf-a1100nm)，以10μm的dmso处理作为空白对照组(nc组)。48h后用mts法检测各个孔的吸光度，以nc组的吸光度值进行归一化处理。检测得到的细胞活性值见图3(b)。

根据图3，与单独使用gaa或单独使用抑制剂相比，gaa与hcq(图a)或者bafilomycina1联用后(图b)，肿瘤抑制效果显著增加。说明gaa与自噬抑制剂联用可以提高抑癌效果。

实施例3gaa与细胞自噬抑制剂联用在pdx模型上抑制肿瘤增长

本实施例在肺癌病人pdx模型上，测试了gaa与自噬抑制剂hcq联用的肿瘤抑制效果。实验步骤如下：

(1)对编号为lu0378的肺腺癌pdx模型的瘤块切取组织，进行匀浆处理提取组织总蛋白，取40μg的总蛋白用于westernblot实验，检测lrpprc蛋白的表达水平。westernblot检测结果见图4。

(2)将lu0378的肺腺癌pdx模型的瘤块切割后种在免疫缺陷的裸小鼠的皮下，待瘤体长到100mm³后，分为3组。一组为安慰剂处理组，一组为gaa处理(灌胃给药30mg/kg，一天一次)，一组为gaa(灌胃给药30mg/kg，一天一次)联合hcq(腹腔注射给药70mg/kg，一天一次)处理。每三天进行一次瘤体积的测量，绘制瘤体生长曲线见图5。

由图4可看出，编号为lu0378的肺腺癌pdx模型表达lrpprc。由图5可知，单独施加gaa有抑制肿瘤增长的作用，gaa与hcq联用具有更强的抑制效果。

实施例4gaa与自噬抑制剂联用具有协同效应

采用标准协同指数计算公式q＝e(a+b)/(e(a)+e(b)-e(a)×e(b))，(e(a+b)为两药联用抑制率，e(a)为a药单用的抑制率，e(a)为b药单用的抑制率)进行gaa与hcq的协同效应统计，当q值大于1.15时定义为协同效应。在肺腺癌细胞系a549中e(gaa)＝0.49，e(hcq)＝0.21，e(gaa+hcq)＝0.74，q＝1.22，显示为协同效应。

需要说明的是，实施例1-4以肺腺癌、肺癌细胞为例进行验证，当然，也可以取乳腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、肺鳞癌、胰腺癌、胃癌等细胞，本实施例在此不做限定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。