膀胱输尿管反流注射治疗用磁性凝胶及其制备方法与流程

本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种磁性可示踪的膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法。

背景技术：

原发性膀胱输尿管反流（vesicoureteralreflux，vur）系常见的先天性肾脏和尿路畸形，所谓原发性vur是指由于先天性膀胱输尿管连接处瓣膜发育缺陷，导致尿液反流回输尿管及肾脏。vur患儿具有泌尿系统感染（urinarytractinfection，uti）的高风险，可引起肾盂肾炎和肾疤痕形成。肾疤痕及其后的慢性肾损伤可导致成人期的高血压、蛋白尿[2,3]和进行性肾功能衰竭。5-10%的患儿因rn的存在最终走向esrd[4,5]。严重的vur不仅影响儿童的生长发育和成年后的生活质量，给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担，还严重影响我国人口、环境资源的可持续发展。因此，如何有效个体化治疗、防止或延缓肾脏功能恶化，对于改善预后、减轻家庭及社会的负担具有十分重要的意义。

vur治疗的主要目的是防止上行性uti以及其相关的肾损害。通过内镜下注射填充物是近年来在国际上流行的一种治疗vur的新方法，包括sting法[19]、hit法和double-hit法[20]等。其原理均是利用内镜将各类填充物注射于输尿管膀胱璧间段的黏膜下层，填充物使得输尿管末端及开口位置抬高，从而达到抗反流的目的。内镜注射治疗vur已被证明安全、并发症少[25,26]。由于其操作简单快速、几无术后疼痛、微创美观、可门诊手术完成的特点，现在国外已部分取代抗生素治疗和开放手术，受到家长和临床医生等欢迎[26]。

理想的填充剂应具有以下特点：耐用、有效、安全、惰性、容易注射、时间稳定、不会被挤出或迁移、生物相容、非致敏、非致癌、经济、可示踪。早期使用的材料teflon即由于可迁移至其它脏器而被淘汰。既往使用过的材料如胶原蛋白、自体软骨细胞等，因可能致敏或需两次麻醉、可被吸收、长期随访失败率高等原因被逐步淘汰。deflux[27]是当前国际市场的主流产品，其成分包括直径80-250μm的聚糖酐微球体（dextranomermicrospheres，dx）和起载体作用的透明质酸（hyaluronicacid，ha）[27]。

本发明通过简单办法制备一种磁性琼脂糖/透明质酸凝胶，用于膀胱输尿管反流内镜注射治疗，并可在核磁共振检查中显像，便于后续临床治疗中示踪。为治疗vur提供新的技术和方法，最终对于改善vur患儿预后、减轻家庭及社会的负担起到积极作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种制备方便、热稳定性好，机械强度高，带有磁性纳米粒子的琼脂糖微球/透明质酸复合凝胶及其制备方法，并将其作为填充剂用于膀胱输尿管反流等疾病注射治疗。

本发明提供的磁性琼脂糖微球/透明质酸复合凝胶的制备方法，是通过共沉淀法制备磁性纳米粒子，采用反相悬浮法制备磁性琼脂糖复合微球，调控微球直径至合适大小，筛分后再在碱性条件下进行交联反应，使磁性琼脂糖复合微球与透明质酸混合形成稳定的磁性复合凝胶材料，具体步骤为：

（1）采用共沉淀法制备fe3o4磁性纳米粒子；

（2）以琼脂糖粉末、步骤（1）中的fe3o4磁性纳米粒子和去离子水为原料，加入碱，配制成含fe3o4磁性纳米粒子的琼脂糖水溶液；

（3）利用反相悬浮法将步骤（2）的琼脂糖水溶液制备成磁性琼脂糖微球；

（4）在步骤（3）制备的磁性琼脂糖微球中加入交联剂，进行交联反应，形成交联磁性琼脂糖微球；

（5）将步骤（4）制备的交联磁性琼脂糖微球通过多次分离洗涤，得到粒径为80-250微米，且均匀分布的交联磁性琼脂糖微球；

（6）步骤（5）得到的交联磁性琼脂糖微球与透明质酸混合，配制成复合凝胶。

本发明步骤（1）中，所述采用共沉淀法制备fe3o4磁性纳米粒子，是将fecl2∙4h2o及fecl3∙6h2o溶于去离子水中形成均相水溶液，采用氨水为沉淀剂，在机械搅拌、氮气氛围、55-95℃温度下经反应得到fe3o4磁性纳米粒子。

本发明步骤（2）中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠、碳酸钠中的一种，或者多种；琼脂糖水溶液中琼脂糖浓度为1-10wt%，fe3o4磁性纳米粒子浓度为0.1-1wt%。

本发明步骤（3）中，所述利用反相悬浮法制备成磁性琼脂糖微球，是采用正辛烷为液相，使用span-80作为乳化剂，在高速机械搅拌、50-85℃温度下，加入琼脂糖水溶液，经反应得到磁性琼脂糖微球。

本发明步骤（4）中，所述交联反应在150-1000rpm的搅拌速度下进行，交联反应温度为35-80℃，反应时间为0.5-4h。所述交联剂选自环氧氯丙烷、1,3-二溴-2-丙醇等中的一种，或者多种。

本发明步骤（5）中，所述分离洗涤用溶液为20%乙醇-水溶液以及去离子水；分离采用磁分离，或者采用静置分离（静置时间0.5-5h）；然后用分样筛（65-190目）过滤洗涤，得到一定粒径（80-250微米）均匀分布的交联磁性琼脂糖微球。

本发明步骤（6）中，交联磁性琼脂糖微球和透明质酸与去离子水混合配制成凝胶，其中交联磁性琼脂糖微球浓度为1-100mg/ml，透明质酸浓度为1-30mg/ml。

本发明制备方法具体操作流程如下：

（1）称取2-5gfecl2∙4h2o及10-15gfecl3∙6h2o于120mlh2o中,在机械搅拌下搅拌溶解，通氮驱氧0.5-1h。然后升温至50-70℃，在快速搅拌下迅速加入30-50mlnh3·h2o。随后升温至80-100℃，保持温度0.5-1h，然后降到室温，加入2-5mol.l^-1hcl调ph=3-5，静置，产物用磁场分离收集。收集的产物用去离子水搅拌分散，然后磁场分离，上述过程反复多次直至无游离cl^-。制得的fe3o4纳米粒子粒径为10-20nm；

（2）称取0.05-1g琼脂糖粉末与步骤（1）所得fe3o4（湿重）0.01-0.1g，加入去离子水至5-10g，将混合物超声3-10min。之后在80-110℃条件下加热，加入0.1-1mlnaoh（0.5-3m）。机械搅拌（100-500rpm）约5-25min，使溶解。形成琼脂糖浓度为1-10wt%，fe3o4磁性纳米粒子浓度为0.1-1wt%的琼脂糖水溶液；该琼脂糖水溶液粘度较大；

（3）（用移液枪或者移液管）移取25ml正辛烷，加入0.1-2g乳化剂span-80，高速机械搅拌，搅拌速度500-1500rpm,在搅拌过程中，同时升温到50-85℃，接回流冷凝，将步骤（1）得到的琼脂糖水溶液（粘度较大）倒入高速搅拌的正辛烷中，高速继续搅拌0.5-2h；

（4）将步骤（3）得到的反应体系温度调至35-80℃，加入交联剂0.1-2g，搅拌速度150-1000rpm，交联反应0.5-4h；

（5）停止加热，静置后溶液分层，下层为交联磁性琼脂糖微球；将上层液体倒出，下层固体用20%乙醇-水溶液洗涤分离数次，洗涤分离可以采用磁分离的形式，也可采用静置分离（0.5-5h），后用分样筛（65-190目）过滤和去离子水洗涤得到一定粒径分布（80-250微米）的交联磁性琼脂糖微球，产物保存在去离子水中备用；

（6）取步骤（5）得到的交联磁性琼脂糖微球与透明质酸配成凝胶，其中交联磁性琼脂糖微球浓度为1-100mg/ml，透明质酸浓度为1-30mg/ml，搅拌过夜，使其形成体系均匀的凝胶。

用注射器注射0.1ml-2ml凝胶在老鼠皮下监测其在体内保存情况。

本发明制备方法获得的交联琼脂糖微球，尺寸分布可调控，热稳定性好和机械性能强；制备得到交联磁性琼脂糖微球，磁响应性能好，且皮下注射可通过磁共振成像方便高效观察其在体内保留情况，无明显伤害性，是一种理想的膀胱输尿管反流内镜注射治疗用填充材料；可用于核磁共振检查显像，便于后续临床治疗中示踪。

本发明所制备交联磁性琼脂糖微球/透明质酸凝胶的具有以下特点：

1.反相悬浮法制备过程简单、高效，且具有工业化大规模生产的潜力；

2.交联磁性琼脂糖微球，热稳定性好且可通过交联程度进行调控，机械强度高，尺寸可控；

3.可通过磁共振成像方便后续动物实验简单高效观察，且不具有伤害性；

4.凝胶生物相容性好，无细胞毒性，皮下注射无明显不良反应；5.凝胶可在体内保存至少两周及以上。

说明所制备的交联磁性琼脂糖微球/透明质酸凝胶是一种优异且可广泛应用的理想注射填充材料。

附图说明

图1为实施案例1中磁性纳米粒子的透射电镜照片。

图2为实施案例3中不同磁含量微球的光学显微镜形貌，铁浓度为0时，样品基本是透明的，用虚线标出轮廓。

图3为实施案例不同磁含量微球经120℃过夜后的光学显微镜形貌，铁浓度为0时，样品基本是透明的，用虚线标出轮廓。

图4为不同fe含量的磁性凝胶的t2加权磁共振图像。

图5为1/t2信号与fe含量的关系曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明。

实施例1：交联磁性琼脂糖微球的制备

1.称取3.98gfecl2∙4h2o及10.82gfecl3∙6h2o于120mlh2o中,在机械搅拌下搅拌溶解，通氮驱氧0.5h。然后升温至65℃，在快速搅拌下迅速加入40mlnh3·h2o。随后升温至95℃，保持温度0.5h，然后降到室温，加入3mol.l^-1hcl调ph=4，静置，产物用磁场分离收集。收集的产物用去离子水搅拌分散，然后磁场分离，上述过程反复多次直至无游离cl^-；

2.称取0.3g琼脂糖粉末与步骤1所得fe3o4（湿重）0.036g，加入去离子水至7.5g，将混合物超声6min。之后在100℃条件下加热，加入0.75mlnaoh（2m）。机械搅拌（300rpm）约15min，使溶解。形成琼脂糖浓度为4wt%，fe3o4磁性纳米粒子浓度为0.48wt%的琼脂糖水溶液；该琼脂糖水溶液粘度较大；

3.用移液枪移取25ml正辛烷，加入0.75g乳化剂span-80，高速机械搅拌，搅拌速度1000rpm,在搅拌过程中，同时升温到70℃，接回流冷凝，将步骤2得到的琼脂糖水溶液（粘度较大）倒入高速搅拌的正辛烷中，高速继续搅拌0.5h；

4.将反应体系温度降至55℃，加入交联剂环氧氯丙烷0.75g，降速搅拌，搅拌速度300rpm，交联反应1h；

5.撤去加热，静置后溶液分层，下层为交联磁性琼脂糖微球；将上层液体倒出，下层固体用20%乙醇-水溶液洗涤分离数次，洗涤分离可以采用磁分离的形式，也可采用静置分离，后用分样筛过滤和去离子水洗涤得到一定粒径分布的交联磁性琼脂糖微球；

6.产物应保存在去离子水中，制作临时玻片，通过光学显微镜观察交联磁性琼脂糖微球的形态和大小。

实施例2：交联磁性琼脂糖微球的制备

1.称取4.28gfecl2∙4h2o及11.70gfecl3∙6h2o于120mlh2o中,在机械搅拌下搅拌溶解，通氮驱氧0.5h。然后升温至60℃，在快速搅拌下迅速加入40mlnh3·h2o。随后升温至90℃，保持温度0.5h，然后降到室温，加入3mol.l^-1hcl调ph=4，静置，产物用磁场分离收集。收集的产物用去离子水搅拌分散，然后磁场分离，上述过程反复多次直至无游离cl^-；

2.称取0.25g琼脂糖粉末与步骤1所得fe3o4（湿重）0.03g，加入去离子水至6.25g，将混合物超声5min。之后在95℃条件下加热，加入0.5mlnaoh（2m）。机械搅拌（250rpm）约15min，使溶解。形成琼脂糖浓度为4wt%，fe3o4磁性纳米粒子浓度为0.48wt%的琼脂糖水溶液；该琼脂糖水溶液粘度较大；

3.用移液枪移取25ml正辛烷，加入0.5g乳化剂span-80，高速机械搅拌，搅拌速度1000rpm,在搅拌过程中，同时升温到65℃，接回流冷凝，将步骤2得到的琼脂糖水溶液（粘度较大）倒入高速搅拌的正辛烷中，高速继续搅拌0.5h；

4.将反应体系温度降至50℃，加入交联剂环氧氯丙烷0.5g，降速搅拌，搅拌速度250rpm，交联反应1h；

5.撤去加热，静置后溶液分层，下层为交联磁性琼脂糖微球；将上层液体倒出，下层固体用20%乙醇-水溶液洗涤分离数次，洗涤分离可以采用磁分离的形式，也可采用静置分离，后用分样筛过滤和去离子水洗涤得到一定粒径分布的交联磁性琼脂糖微球；

6.产物应保存在去离子水中，制作临时玻片，通过光学显微镜观察交联磁性琼脂糖微球的形态和大小。

实施例3：交联磁性琼脂糖微球的制备

1.称取4.58gfecl2∙4h2o及12.4gfecl3∙6h2o于120mlh2o中,在机械搅拌下搅拌溶解，通氮驱氧0.5h。然后升温至65℃，在快速搅拌下迅速加入45mlnh3·h2o。随后升温至90℃，保持温度0.5h，然后降到室温，加入3mol.l^-1hcl调ph=4，静置，产物用磁场分离收集。收集的产物用去离子水搅拌分散，然后磁场分离，上述过程反复多次直至无游离cl^-；

2.称取0.22g琼脂糖粉末与步骤1所得fe3o4（湿重）0.026g，加入去离子水至7.7g，将混合物超声5min。之后在95℃条件下加热，加入0.75mlnaoh（2m）。机械搅拌（250rpm）约20min，使溶解。形成琼脂糖浓度为3.5wt%，fe3o4磁性纳米粒子浓度为0.42wt%的琼脂糖水溶液；该琼脂糖水溶液粘度较大；

3.用移液枪移取25ml正辛烷，加入0.4g乳化剂span-80，高速机械搅拌，搅拌速度1000rpm,在搅拌过程中，同时升温到65℃，接回流冷凝，将步骤2得到的琼脂糖水溶液（粘度较大）倒入高速搅拌的正辛烷中，高速继续搅拌0.5h；

4.将反应体系温度降至55℃，加入交联剂环氧氯丙烷0.4g，降速搅拌，搅拌速度250rpm，交联反应1h；

5.撤去加热，静置后溶液分层，下层为交联磁性琼脂糖微球；将上层液体倒出，下层固体用20%乙醇-水溶液洗涤分离数次，洗涤分离可以采用磁分离的形式，也可采用静置分离，后用分样筛过滤和去离子水洗涤得到一定粒径分布的交联磁性琼脂糖微球；

6.产物应保存在去离子水中，制作临时玻片，通过光学显微镜观察交联磁性琼脂糖微球的形态和大小。

实施例4：交联磁性琼脂糖微球的尺寸筛分

将分散在去离子水中的琼脂糖微球置于分样筛上，其中上层69目对应250微米，下层190目对应80微米。经过大量去离子水的反复冲洗，符合粒径要求（80-250微米）的微球会留在筛的中间层中，较大的微球保留在上层中，较小的微球会随着去离子水被洗掉。保存中间层微球，并取部分烘干，计算其干重。

实施例5：磁性琼脂糖微球交联性能验证

取1g已交联的微球分散在5ml去离子水中，置于120℃的烘箱中加热过夜，观察微球其是否溶解，并用光学显微镜来表征加热前后的微球结构。

实施例6：与载体透明质酸混合制备注射填充材料

将交联磁性琼脂糖微球和透明质酸粉末以50mg/ml和15mg/ml的浓度和配比与去离子水混合，搅拌过夜使体系均匀。得到的凝胶体系粘度较大。取2ml左右凝胶装入2ml注射器中以备后续动物实验使用。

实施例7：小动物（兔）长期磁共振成像示踪测试

将交联磁性琼脂糖微球和透明质酸粉末以50mg/ml和15mg/ml的浓度和配比与去离子水混合，搅拌过夜使体系均匀，得到的凝胶用于后续vur模型兔的注射。

通过外科手术建立兔的vur动物模型。新西兰大白兔麻醉成功后，备皮、消毒；取下腹部正中切口，逐层进入，打开膀胱；剪开左侧输尿管膀胱壁间段，扩大左侧输尿管开口；压迫止血后，逐层关闭切口。术后2月，通过逆行泌尿道造影明确模型兔左侧膀胱输尿管反流建模成功。

再次通过外科手术将上述凝胶，采用sting法注射于兔膀胱内左侧输尿管开口处。注射后2月，用磁共振成像分别测试其注射后在模型兔体内的状态。