一种超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法与流程

本发明属于天然活性物质提取分离技术领域，尤其涉及一种超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法。

背景技术：

生物碱类成分是最早从石斛属植物中分离并进行结构鉴定的化合物，其具有清热养胃、明目清音、退热、止痛作用，还可用于降低血压、心率，减慢呼吸，具有强壮作用并可解巴比妥中毒。近年来石斛生物碱还证实具有抗菌作用，并有抗癌作用。有研究报道石斛的生物碱含量范围为0％～0.638％之间，大部分石斛品种生物碱含量较低，金钗石斛的生物碱含量为0.415％左右，含量甚微。

目前，金钗石斛生物碱主要提取工艺为醇提法，该方法在提取过程存在能耗大、有效成分损失高、杂质多、效率低等问题。因此，研究高效提取石斛生物碱的制备方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明提供了一种超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法，该方法具有高效的分离效果，制备的金钗石斛生物碱活性高、品质好，同时为中药活性成分的高效提取提供一种新材料及新方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案为：

一种超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法，具体包括以下步骤：

a1：超微粉碎：将金钗石斛经冷冻干燥处理后，在气流粉碎机进行超微粉碎，冷冻干燥可保留金钗石斛中的热不稳定性生物碱的活性；

具体地，所述步骤a1具体为：将干燥处理的金钗石斛加到气流粉碎机料斗中，控制温度0～10℃，粉碎压力0.70～0.80mpa，进料压力0.60～0.70mpa，螺旋进料速度200.0～300.0r/min，进行超微粉碎破壁；

a2：超声强化提取：按照固液比为1:5～15，向所述步骤a1粉碎后的金钗石斛内加入体积分数为85～95％的乙醇，在超声功率为150～250w下，超声提取10～30min，固液分离得到含金钗石斛生物碱的提取液；

优选地，采用体积分数为87～93％的乙醇；

优选地，采用体积分数为90％的乙醇；

a3：聚离子液体固相萃取：以聚离子液体作为固相萃取吸附剂填充制备萃取柱，经萃取柱活化预处理、所述步骤a2得到的含金钗石斛生物碱的提取液上样、洗去干扰物质，进行洗脱和收集洗脱液；

具体地，所述步骤a3具体为：依次采用体积分数为90％的乙醇和去离子水活化聚离子液体固相萃取柱，将所述步骤a2得到的含金钗石斛的提取液上萃取柱，再依次用去离子水和体积分数30～50％的乙醇洗涤固相萃取柱，然后用体积分数90％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；

优选地，步骤a3还包括聚离子液体的制备：通过咪唑类阳离子型离子液体单体自由基聚合得到烷基取代基的聚离子液体；

优选地，所述聚离子液体的制备具体包括：

a301：离子液体单体制备：将40～50g的1-乙烯基咪唑、160～200g的1-溴十六烷和150～250ml的无水乙醇添加至反应容器中，在70～80℃下反应20～30小时，得到溶液，经沉淀过滤，65～70℃真空干燥20～30小时，除去残余溶剂，得离子液体单体；

a302：聚离子液体制备：将所述步骤a301制备的40～50g离子液体单体、0.3～0.5g引发剂和150～250ml无水乙醇添加至反应容器，在70～80℃下自发聚合20～30小时，得到溶液，经沉淀过滤，65～70℃真空干燥20～30小时，除去残余溶剂，得到聚离子液体；

优选地，所述步骤a301中1-乙烯基咪唑和1-溴十六烷的质量比例为1:4。

优选地，所述引发剂为过硫酸盐；

a4：将所述步骤a3得到的洗脱液真空冷冻干燥，得到金钗石斛生物碱；

具体地，所述步骤a4具体为：将所述步骤a3收集到的洗脱液的乙醇挥干，再加适量的水溶解，在预冻温度-20～-30℃，预冻时间2～4h，工作压力40～50pa，升华温度45～55℃的条件下，干燥10～15h。

本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：

(1)本发明提供的提取金钗石斛生物碱的方法采用聚离子液体萃取金叉石斛生物碱，聚离子液体结合了离子液体和聚合物材料的双重优势，且可提高离子液体的利用效率，其所含的离子液体功能基团能够对有机吸附质分子提供多种相互作用，具有高效的分离效果，将聚离子液体作为固相萃取的核心，聚离子液体对金钗石斛生物碱具备高的选择性、亲和性和吸附容量，因此具有良好的分离效果、高效的分离效率，进而节约了能源。另外聚离子液体具有聚合物的可设计性，可以得到具有多化学成分、适宜孔结构和表面性质、高比表面积以及各种形貌的吸附材料。

(2)本发明在最初干燥金钗石斛时采用冷冻干燥，是为了保留金钗石斛中的热不稳定性生物碱的活性，在最后将萃取的金钗石斛生物碱同样采用冷冻干燥，冷冻干燥是在低温和真空条件下进行，热敏性成分在产品中不会受到破坏，干燥时酶活性、微生物代谢和以水作为介质生化反应等受到抑制。而且氧气非常少，容易氧化成分不易受到氧化损失，生物碱的营养成分得到很好保护，利于生物碱产品的稳定和长时间保存。在冻干中，生物碱产品的组织结构很少被破坏，不发生收缩、表面硬化和龟裂等现象。冻干的物料疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状，具有很强的可适用性。

(3)本发明整个提取过程都处于较低温度下进行，确保了金钗石斛中一些热不稳定性生物碱的活性，提高金钗石斛生物碱的提取率。

(4)本发明通过气流粉碎破壁金钗石斛，可使金钗石斛中的生物碱活性成分全部释放，确保了生物碱得到充分提取。

(5)聚离子液体最为一种新材料，在生物碱中展示了良好的分离效果，通过采用本发明的提取方法，具有提取效率高，产品中活性成分含量高，品质好等特点，具有很好的推广前景。

附图说明

图1为本发明超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法流程图；

图2为石斛碱对照品的gc色谱图；

图3为实施例1提取的样品gc色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。

参看图1，一种超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱的方法，具体包括以下步骤：

a1：超微粉碎：将金钗石斛经冷冻干燥处理后，在气流粉碎机进行超微粉碎，冷冻干燥可保留金钗石斛中的热不稳定性生物碱的活性；

a2：超声强化提取：按照固液比为1:5～15，称取适量步骤a1粉碎后的金钗石斛粉末，向金钗石斛粉末内加入体积分数为85～95％的乙醇，在超声功率为150～250w下，超声提取10～30min，固液分离得到含金钗石斛生物碱的提取液；

优选地，采用体积分数为87～93％的乙醇；

优选地，采用体积分数为90％的乙醇；

a3：聚离子液体固相萃取：以聚离子液体作为固相萃取吸附剂填充制备萃取柱，经萃取柱活化预处理、步骤a2得到的含金钗石斛生物碱的提取液上样、洗去干扰物质，进行洗脱和收集洗脱液。

a4：将步骤a3得到的洗脱液真空冷冻干燥，得到金钗石斛生物碱。

本发明中金钗石斛先采用低温气流粉碎机进行粉碎，通过粉碎的金钗石斛可达到300目以上，其活性成分可得到充分的释放，能有效提高生物碱的提取率。同时，颗粒的粉碎是在低温瞬间完成的，从而避免了某些物质在粉碎过程中产生热量而破坏其化学成分的现象发生。气流粉碎纯粹是物理行为，既没有其它物质掺入其中，也没有高温下的化学反应，因而保持物料的原有天然性质。气流粉碎技术是根据物料的自磨原理而实现对物料的粉碎，粉碎的动力是空气。粉碎腔体对产品污染极少，粉碎是在负压状态下进行的，颗粒在粉碎过程中不发生任何泄漏，不会造成新的污染源。

具体的：先将金钗石斛清洗干净后，沥干、切成小段，将所得的金钗石斛小段进行干燥灭菌处理，将杀菌干燥好的金钗石斛小段初步粉碎，将所得的金钗石斛粗粉加到气流粉碎机料斗中，控制温度0～10℃，粉碎压力0.70～0.80mpa，进料压力0.60～0.70mpa，螺旋进料速度200.0～300.0r/min，进行超微粉碎破壁。经破壁的超微粉目数可达到300目以上，破壁率可达到98％以上。

本发明中经粉碎的金钗石斛超微粉采用超声辅助方法提取金叉石斛生物碱。利用超声波的强振动、高加速度、强空化效应、强搅拌作用来缩短天然产物有效成分进入溶剂的时间，加快提取过程，提高提取率，并有效避免高温对有效成分的破坏。因此，通过超声波辅助提取可以明显缩短提取时间，节省溶剂用量，提高有效成分的提取率，避免高温对有效成分的破坏，在天然产物提取中的应用已展现明显的优势。

本发明采用聚离子液体萃取金叉石斛生物碱，聚离子液体结合了离子液体和聚合物材料的双重优势，且可提高离子液体的利用效率，其所含的离子液体功能基团能够对有机吸附质分子提供多种相互作用，具有高效的分离效果，将聚离子液体作为固相萃取的核心，聚离子液体对金钗石斛生物碱具备高的选择性、亲和性和吸附容量，因此具有良好的分离效果、高效的分离效率，进而节约了能源。另外聚离子液体具有聚合物的可设计性，可以得到具有多化学成分、适宜孔结构和表面性质、高比表面积以及各种形貌的吸附材料。而且聚离子液体的物理化学性质可以方便地通过不同反离子来调节，与离子液体相比，聚离子液体固相材料避免了离子液体从水中流失的风险，也更容易从水相中分离回收，减少有机溶剂的使用。

优选地，所述步骤a3还包括：聚离子液体的制备：通过咪唑类阳离子型离子液体单体自由基聚合得到烷基取代基的聚离子液体。

本发明一优选实施例中聚离子液体采用自由基聚合合成的方法制备。两亲性的离子液体可以在溶液中自发聚集成有序结构，溶剂是影响离子液体自发聚集行为的重要因素。通过改变溶剂与离子液体间、溶剂分子间和离子液体间的相互作用可以调控自发聚集行为。

具体的，聚离子液体的制备具体包括：

a301：离子液体单体制备：将40～50g的1-乙烯基咪唑、160～200g的1-溴十六烷和150～250ml的无水乙醇添加至反应容器中，在70～80℃下反应20～30小时，得到溶液，经沉淀过滤，65～70℃真空干燥20～30小时，除去残余溶剂，得离子液体单体；

a302：聚离子液体制备：将步骤a301制备的40～50g离子液体单体、0.3～0.5g引发剂和150～250ml无水乙醇添加至反应容器，在70～80℃下自发聚合20～30小时，得到溶液，经沉淀过滤，65～70℃真空干燥20～30小时，除去残余溶剂，得到聚离子液体。

优选地，步骤a301中1-乙烯基咪唑和1-溴十六烷的质量比例为1:4。

优选地，引发剂为过硫酸盐。

具体地，步骤a4具体为：依次采用体积分数为90％的乙醇和去离子水活化聚离子液体固相萃取柱，将步骤a2得到的含金钗石斛的提取液上萃取柱，再依次用去离子水和体积分数30～50％的乙醇洗涤固相萃取柱，然后用体积分数90％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。

本发明一优选实施例中金钗石斛生物碱采用聚离子液体固相分离纯化获得。利用固相分离介质对分离物的吸附作用强于液相溶剂的特点，将分离物浓缩在固相分离介质表面从而达到分离，其中分离介质的选择对固相分离效率至关重要。以聚离子液体为分离介质，其大分子结构克服了离子液体作为分离介质时所存在的水溶解性而造成流失的问题，其良好的化学稳定性可延长其作为分离介质的使用寿命。该技术可用于黄酮类和生物碱类化合物及蛋白质的高效分离。

优选地，步骤a5具体为：将步骤a4收集到的洗脱液的乙醇挥干，再加适量的水溶解，在预冻温度-20～-30℃，预冻时间2～4h，工作压力40～50pa，升华温度45～55℃的条件下，干燥10～15h。

本发明一优选实施例中对收集的洗脱液采用冷冻干燥方法进行干燥处理。冷冻干燥是在低温和真空条件下进行，产品的脱水彻底，产品中的水分活度较低，可提高产品的稳定性和贮藏时间。同时，产品中的一些热敏感性生物碱和易氧化活性成分都能够得到保护，不易损失。

采用本发明的制备方法所得到金钗石斛生物碱含量高，各样品中的平均含量可达到4.86mg/g以上，比乙醇提取方法所获得的生物碱含量高20％以上。

实施例1

将金钗石斛清洗干净后，沥干、切成小段，所得的金钗石斛小段进行干燥灭菌处理，将杀菌干燥好的金钗石斛小段初步粉碎，将所得的金钗石斛粗粉加到气流粉碎机料斗中，控制温度4℃，粉碎压力0.75mpa，进料压力0.65mpa，螺旋进料速度250r/min，进行超微粉碎破壁。

称取一定量金钗石斛超微粉，以1:10的比例加入90％的乙醇，混合均匀，控制超声功率在200w，提取20min，完成后过滤并收集滤液。

同时，将45g的1-乙烯基咪唑、180g的1-溴十六烷和200ml的无水乙醇进行混合，混合液在75℃下反应25小时，得到溶液。溶液冷却至室温，利用乙醇-乙酸乙酯进行溶解沉淀4次，得到固体粉末，68℃真空干燥25小时，除去残余溶剂，得离子液体单体。

将45g的离子液体单体、0.4g的引发剂和200ml的无水乙醇进行混合，混合液在75℃下反应25小时，反应结束后得到溶液。溶液冷却至室温，利用乙醇-丙酮进行溶解沉淀4次，得到固体粉末，68℃真空干燥25小时，除去残余溶剂，得聚离子液体。

将聚离子液体作为吸附剂进行填柱，依次用适量的90％乙醇和水活化聚离子液体固相萃取柱，将过滤的样品准确移取0.5～1.5g进行上柱，再用水和40％乙醇洗涤固相萃取柱，并用适量的90％乙醇溶液洗脱金钗石斛生物碱，收集洗脱液。

获得的洗脱液先将乙醇挥干，再加适量的水溶解，在预冻温度-25℃之间，预冻时间3h，工作压力为45pa，升华温度为50℃的条件下，干燥12小时，获得铁皮石斛生物碱产品。

对比例1

将金钗石斛清洗干净后，沥干、切成小段，所得的金钗石斛小段进行干燥灭菌处理，将杀菌干燥好的金钗石斛小段初步粉碎，将所得的金钗石斛粗粉加到气流粉碎机料斗中，控制温度4℃，粉碎压力0.75mpa，进料压力0.65mpa，螺旋进料速度250r/min，进行超微粉碎破壁。称取一定量金钗石斛超微粉，以1:10的比例加入90％的乙醇，混合均匀，控制超声功率在200w之间，提取20min，完成后过滤并收集滤液。

将预处理好的ab-8大孔树脂进行装柱，用水洗至无味，将上述提取液调节ph至10，上柱吸附2h，依次用水，10％，30％，50％，70％，90％的酸性乙醇进行洗脱，收集洗脱液。

获得的洗脱液先将乙醇挥干，再加适量的水溶解，在预冻温度-25℃之间，预冻时间3h，工作压力为45pa，升华温度为50℃的条件下，干燥12小时，获得金钗石斛生物碱产品。

对比例2

其他步骤与实施例1相同，只有粉碎的方法不同，采用的是干法粉碎。

将金钗石斛清洗干净后，沥干、切成小段，所得的金钗石斛小段进行干燥灭菌处理，将杀菌干燥好的金钗石斛小段初步粉碎，将所得的金钗石斛粗粉加到粉碎机料斗中，控制温度15℃，螺旋转速1500r/min，进行粉碎破壁。

对比例3

采用的是醇提法只有金钗石斛生物碱提取方法不同，

将金钗石斛清洗干净后，沥干、切成小段，所得的金钗石斛小段进行干燥灭菌处理，将杀菌干燥好的金钗石斛小段初步粉碎，将所得的金钗石斛粗粉加到气流粉碎机料斗中，控制温度4℃，粉碎压力0.75mpa，进料压力0.65mpa，螺旋进料速度250r/min，进行超微粉碎破壁。

称取一定量金钗石斛超微粉，以1:10的比例加入90％的乙醇，混合均匀，在提取温度为60℃条件下，提取4小时，提取次数为3次，完成后过滤并收集滤液。

获得的滤液先将乙醇挥干，再加适量的水溶解，在预冻温度-25℃之间，预冻时间3h，工作压力为45pa，升华温度为50℃的条件下，干燥12小时，获得铁皮石斛生物碱产品。

采用气相色谱测定实施例和对比例中金钗石斛生物碱含量

1、色谱条件

色谱柱：ov1701石英毛细管柱(30x0.32mm，0.25μm)；温70℃，保持5min,以60c/min上升至230℃，保留5min,载气：n2,0.60ml/min；分流比为50：1；气化室温度：230℃，检测器fid,检测器温度：250℃；氢气：30ml/min,空气：400ml/min,尾吹：30ml/min；进样方式：直接进样。

2、对照品溶液的制备

采用石斛碱为对照品，精密称取石斛碱10mg于50ml容量瓶中，加入甲醇溶液，并稀释至刻度，制成石斛碱的对照品溶液。

3、供试品溶液的制备

称取0.20g粉末置于10ml容量瓶中，加适量甲醇使样品溶解，定容至刻度，摇匀，精密量取1ml于10ml容量瓶中，加适量甲醇使样品溶解，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，即得。

4、测定方法

量取实施例制备的金钗石斛生物碱供试品溶液1μl,注入气相色谱仪，记录色谱图，即得。

5、方法学考察

5.1、标准曲线绘制

分别精密吸取石斛碱对照品溶液0.125，0.625，1.25，6.2512.5ml定容至25ml，各取1μl进样,以峰面积积分为纵坐标，对照品进样量为横坐标进行线性回归，回归方程为y＝8912.329x-5526.5，r2＝0.9996,线性关系良好，表明石斛碱在0.001～0.1μg范围内具有良好的线性关系。

5.2、精密度试验

取石斛碱对照品溶液1μl连续进样6次，记录色谱峰面积，rsd为1.39％。

5.3、重复性试验

平行制备6份实施例1的供试品溶液，进样1μl测定，记录石斛碱色谱峰面积，rsd为2.18％。

5.4、稳定性试验

精密吸取实施例1样品溶液1μl，分别在0、1、2、4、8、12h进样，计算石斛碱峰面积rsd为1.98％，结果表明样品溶液在12h内稳定。

5.5、加样回收率试验

精密称取实例1中得到的石斛碱粉末0.1g(含石斛碱约0.494mg)6份，分别置于50ml的量瓶中，各精密加入石斛碱对照品溶液2.5ml，混匀，加甲醇适量稀释至刻度，混匀，过0.45μm在同样的色谱条件下测定其中石斛碱含量，计算回收率，结果见表1,石斛碱平均回收率为99.4％，rsd值为1.70％，说明该方法准确度良好。

表1金钗石斛中石斛碱的回收率

5.6样品测定

分别精密吸取1μl按上述步骤3条件下处理的供试品溶液样品,注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算各样品溶液的石斛碱含量，结果见表2。

表2生物碱含量测定结果(n＝3)

经过图2和图3对比可知，实施例1提供的方法能够提取石斛碱，由表2可知，实施例1提供的方法所得到金钗石斛生物碱含量高。且该方法准确度良好。

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明作出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。