本发明涉及蜂胶应用研究领域，具体为一种小分子蜂胶提取物的制备方法及其应用。
背景技术：
：蜂胶中含有20余类，300多种天然物质成分，包括30多种人体必需的钙、铁、锌、硒、铬等常量、微量元素，以及甾类化合物，20多种氨基酸，数十种芳香化合物，30多种黄酮类物质，还含有丰富的有机酸、萜烯类物质、木质体、多种酶和多糖、维生素等具有生物活性的天然成分。中国专利库中公开了中国专利库中公开了一种高效的蜂胶提取和脱铅方法(cn201310124273.2)。所述方法引入了循环提取、水溶性物质提取、物理吸附脱铅、浓缩干燥等步骤，提高了蜂胶的全物质提取率，提高了提取率和生产效率。特别是通过用物理的除铅方法降低了铅的含量，方法简单、高效、安全可靠，既提高了蜂胶的品质，又提升了蜂胶的使用安全性。现有技术中，蜂胶提取物已经应用到化妆品、保健品和药品等领域，但直接添加蜂胶提取物，由于其主要成分黄酮类物质和萜烯类物质分子量大于400道尔顿，这会导致其吸收速度慢，吸收效率低，如何对其进行小分子改造是值得研究的课题。技术实现要素：针对上述问题，本发明的目的是提供一种小分子蜂胶提取物的制备方法及其应用，先提取蜂胶提取物，再利用酶解反应和质谱裂解对其进行小分子改造，使其从不易吸收的大分子物质转化为易吸收的小分子物质，最后表面处理、杀菌封装，通过对蜂胶提取物提取物的小分子改造，使其运用于化妆品等产品时更容易被吸收。为了实现上述目的，本发明采用以下方案一种小分子蜂胶提取物的制备方法，其包括以下步骤：s1蜂胶提取物粗提，对天然蜂胶进行提纯，得到蜂胶提取物；s2低温处理，将液态蜂胶提取物降温至3-8℃，处理25-30min；s3酶解，将液态蜂胶提取物升温至15-20℃，加入纯净水溶解，调节为酸性环境，ph为4.0-4.5，加入裂解酶进行酶解，得到酶解蜂胶提取物；s4过滤，加入碱性溶液调节酶解蜂胶提取物的ph为7.0-7.5，酸碱中和后进行过滤；s5脱水，采用喷雾干燥法对酶解蜂胶提取物进行干燥，得到固相蜂胶提取物，再将固相蜂胶提取物纳米级粉碎；s6质谱裂解，对蜂胶提取物微粉采用电喷雾离子阱质谱法进行裂解，得到小分子蜂胶提取物；s7表面处理，加入表面处理剂到小分子蜂胶提取物中，并匀速搅拌，最后干燥处理；s8杀菌封装，对小分子蜂胶提取物进行杀菌封装。优选地，蜂胶提取物的提取方法，包括以下步骤：a1将天然蜂胶在于-40～-25℃的低温下预冷20-30min，粉碎后过100目筛，得到蜂胶颗粒物，将蜂胶颗粒物在-25～-20℃的低温下冷冻15-30min；a2将恢复常温的蜂胶颗粒物用10～15倍的80～95％(v/v)的食用酒精浸提30～60min；a3采用连续回流提取法对s2中的混合物进行提取，提取时间2～3h，得到提取液；a4使用板框压滤机进行过滤，过滤精度15～20μm，得到液态蜂胶提取物。优选地，步骤s3中，加入的酸性物质为质量比为1：(2-4)的水杨酸和柠檬酸，水杨酸的浓度为9％，柠檬酸的浓度为12％。优选地，步骤s3中，裂解酶为核酸酶、羧肽酶和酸类裂解酶组成的复合酶。优选地，步骤s3中，核酸酶、羧肽酶和酸类裂解酶的质量比为(4-7)：(2-4)：3。优选地，步骤s3中，加入裂解酶后进行慢速搅拌，搅拌速度为60-100rpm，时间5-8小时。优选地，步骤s4中，碱性溶液为10％含量的氢氧化钠溶液。优选地，步骤s4中，采用平板超滤设备对酶解蜂胶提取物进行过滤，选用截留相对分子质量为400的膜，压力范围为0.5-0.8mpa。优选地，步骤s4中，所述表面活性剂为磷脂，采用单层分子构成的脂球体来包裹蜂胶活性物，得到稳定态的水溶性小分子蜂胶提取物。优选地，步骤s4中，所述表面活性剂为聚乙二醇，采用聚乙二醇包裹蜂胶活性物，得到稳定态的水溶性小分子蜂胶提取物，聚乙二醇的分子量小于400。优选地，步骤a2中，采用漩涡混匀器辅助浸提，速度为500～1000rmp/min。优选地，步骤a3中，使用超声波辅助提取，超声波频率为50～200mhz。优选地，步骤a3中，采用低温提取，提取温度50～60℃。其中，磷脂属于表面活性剂，表面活性剂一端可溶于水，一端可溶于油，物料在涂上磷脂后，磷脂的水溶性端插入物料中，水溶性一端暴漏在外，可以使物料溶于水。聚乙二醇具有与各种溶剂的广泛相容性，是很好的溶剂和增溶剂，被广泛用于液体制剂，其具有较高的水溶性和较宽的熔点范围、良好的稳定性，单独使用或混配可以制出保存时间长和符合药物与物理效果要求的熔点变化范围。一种小分子蜂胶提取物的应用，所述小分子蜂胶提取物作为一种原料添加到化妆品、保健品、药品中。本发明的有益效果是：对提取的蜂胶提取物进行小分子改造，使其主要成分的分子量小于400，小分子物质更易吸收；采用物质将蜂胶活性成分包裹，使用时再释放出来，易于保存，且吸收率高；纳米级高纯度的蜂胶成分进一步提升吸收率；稳定态的小分子蜂胶活性成分，其使用效果远超普通的蜂胶提取物。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例来对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例1一种小分子蜂胶提取物的制备方法，其包括以下步骤：s1蜂胶提取物粗提，对天然蜂胶进行提纯，得到蜂胶提取物；s2低温处理，将液态蜂胶提取物降温至4℃，处理25min；s3酶解，将液态蜂胶提取物升温至15℃，加入纯净水溶解，加入质量比为1：2的9％水杨酸和12％柠檬酸调节为酸性环境，ph为4.0-4.5，加入质量比为7：4：3的核酸酶、羧肽酶和酸类裂解酶进行酶解，得到酶解蜂胶提取物；酶解过程中进行匀速搅拌，搅拌速度为00rpm，时间5小时；s4过滤，加入10％的氢氧化钠溶液调节酶解蜂胶提取物的ph为7.0-7.5，酸碱中和后进行过滤，采用平板超滤设备对酶解蜂胶提取物进行过滤，选用截留相对分子质量为400的膜，压力范围为0.6mpa；s5脱水，采用喷雾干燥法对酶解蜂胶提取物进行干燥，得到固相蜂胶提取物，再将固相蜂胶提取物纳米级粉碎；s6质谱裂解，对蜂胶提取物微粉采用电喷雾离子阱质谱法进行裂解，得到小分子蜂胶提取物；s7表面处理，加入表面处理剂到小分子蜂胶提取物中，并匀速搅拌，最后干燥处理；表面活性剂为磷脂，采用单层分子构成的脂球体来包裹小分子蜂胶提取物，得到稳定态的小分子蜂胶提取物；s8杀菌封装，对小分子蜂胶提取物进行杀菌封装。实施例2一种小分子蜂胶提取物的制备方法，其包括以下步骤：s1蜂胶提取物粗提，对天然蜂胶进行提纯，得到蜂胶提取物；s2低温处理，将液态蜂胶提取物降温至6℃，处理28min；s3酶解，将液态蜂胶提取物升温至18℃，加入纯净水溶解，加入质量比为1：3的9％水杨酸和12％柠檬酸调节为酸性环境，ph为4.0-4.5，加入质量比为6：4：3的核酸酶、羧肽酶和酸类裂解酶进行酶解，得到酶解蜂胶提取物；酶解过程中进行匀速搅拌，搅拌速度为80rpm，时间6.5小时；s4过滤，加入10％的氢氧化钠溶液调节酶解蜂胶提取物的ph为7.0-7.5，酸碱中和后进行过滤，采用平板超滤设备对酶解蜂胶提取物进行过滤，选用截留相对分子质量为400的膜，压力范围为0.7mpa；s5脱水，采用喷雾干燥法对酶解蜂胶提取物进行干燥，得到固相蜂胶提取物，再将固相蜂胶提取物纳米级粉碎；s6质谱裂解，对蜂胶提取物微粉采用电喷雾离子阱质谱法进行裂解，得到小分子蜂胶提取物；s7表面处理，加入表面处理剂到小分子蜂胶提取物中，并匀速搅拌，最后干燥处理；表面活性剂为聚乙二醇，采用聚乙二醇包裹蜂胶活性物，得到稳定态的水溶性小分子蜂胶提取物，聚乙二醇的分子量小于400；s8杀菌封装，对小分子蜂胶提取物进行杀菌封装。实施例3一种小分子蜂胶提取物的制备方法，其包括以下步骤：s1蜂胶提取物粗提，对天然蜂胶进行提纯，得到蜂胶提取物；s2低温处理，将液态蜂胶提取物降温至8℃，处理30min；s3酶解，将液态蜂胶提取物升温至20℃，加入纯净水溶解，加入质量比为1：4的9％水杨酸和12％柠檬酸调节为酸性环境，ph为4.0-4.5，加入质量比为4：2：3的核酸酶、羧肽酶和酸类裂解酶进行酶解，得到酶解蜂胶提取物；酶解过程中进行匀速搅拌，搅拌速度为60rpm，时间8小时；s4过滤，加入10％的氢氧化钠溶液调节酶解蜂胶提取物的ph为7.0-7.5，酸碱中和后进行过滤，采用平板超滤设备对酶解蜂胶提取物进行过滤，选用截留相对分子质量为400的膜，压力范围为0.8mpa；s5脱水，采用喷雾干燥法对酶解蜂胶提取物进行干燥，得到固相蜂胶提取物，再将固相蜂胶提取物纳米级粉碎；s6质谱裂解，对蜂胶提取物微粉采用电喷雾离子阱质谱法进行裂解，得到小分子蜂胶提取物；s7表面处理，加入表面处理剂到小分子蜂胶提取物中，并匀速搅拌，最后干燥处理；表面活性剂为磷脂，采用单层分子构成的脂球体来包裹小分子蜂胶提取物，得到稳定态的小分子蜂胶提取物；s8杀菌封装，对小分子蜂胶提取物进行杀菌封装。蜂胶的特征：蜂胶是世界公认的保健食品，内含20大类共300余种活性成分，被誉为天然药库。蜂胶的成分主要依赖于蜜蜂采集胶源的植物，因为欧洲、南美洲、北美洲及亚洲的主要胶原植物不同，世界各地的蜂胶成分也不相同。目前，从蜂胶中已经分离鉴定的活性成分，其中主要是多酚类化合物，包括黄酮类和肉桂酸类衍生物。我国地域辽阔，南北气候条件差异大，植被多样，蜂胶成分也不尽相同，但是目前发现的主要活性物质包括两类，一类是酚酸及其酯类，另一类是黄酮类。黄酮类化合物是人体必需营养素，人体内不能合成，只能从饮食中摄取，是一类生命运动不可或缺的调节机体生理功能的重要物质。除黄酮类化合物外，蜂胶还有芳香挥发油，烯萜类化合物，有机酸类，黄烷醇类，醇、酚、醛、酮、酯、醚类化合物，酶类及无机盐等蜂胶具有十分广泛的生物学作用，这主要与其所含有的丰富的黄酮类和酚酸及其酯类物质密切相关，这些物质具有相似而又不同的生物学活性。咖啡酸又称二羟基肉桂酸，广泛存在于植物中，是天然、安全的自由基猝灭剂，具有优异的抗氧化特性。p-香豆酸又称对羟基肉桂酸，以豆科植物含量居多。大量研究表明，p-香豆酸有很强的生物活性。同时，p-香豆酸还是利胆的有效成分，且作用缓和、持久。阿魏酸和异阿魏酸是中药升麻的主要活性成分。阿魏酸有许多保健功用。异阿魏酸和阿魏酸的功效相似。香兰素又称香草醛，常被用作香料添加剂而广泛应用于化妆品、糖果、饮料及烘烤食品等行业。香兰素对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，可抑制酪氨酸酶单酚酶的稳态活性和二酚酶活性。对酪氨酸酶单酚酶的抑制效应主要表现为酶催化反应迟滞时间有明显的延长。肉桂酸又称桂皮酸，被广泛应用于美容方面，具有抑制形成黑色素的酪氨酸酶的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，是防晒霜中必不可少的成分之一。松属素又称乔松素，在蜂胶中含量丰富。松属素具有抗原虫、抗诱变、抗氧化、抑制睾酮还原酶、抑制酪氨酸酶、抑制葡萄糖基转移酶、抑制肥大细胞及中性粒细胞分泌等多种药理学活性。柯因又称白杨素，是蜂胶和蜂蜜的主要生物活性成分之一。柯因能够抑制环氧化酶和增加白细胞介素。此外，柯因也是抗焦虑药物的一种成分。高良姜素是天然的黄酮醇，具有化学防护作用，如抗突变、抗致畸及较强的抗脂质过氧化活性。咖啡酸苯乙酯(cape)是蜂胶中一种重要的成分物质，近十年来一直是国内外研究的热点。此外，cape还是一种强力的抗氧化剂，能够清除活性氧化物质，且具有免疫调节作用。芹菜素是一种天然的黄酮类化合物，具有抗氧化作用，能够灭活自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化等。槲皮素是植物界最常见的类黄酮之一。研究表明，槲皮素不仅可以直接提高动物的抗氧化能力，还可以与维生素c和维生素e协同发挥抗氧化作用。此外，槲皮素能对多种细胞均具有抗纤维化作用。山姜素是一种天然的黄酮类化合物，主要存在于姜科植物中，如姜黄、豆蔻等。研究发现，山姜素具有抗菌等方面的作用。3,4-二羟基苯甲醛是丹参注射液的主要成分，具有扩张血管、改善微循环等作用。鼠李素具有促进血流通畅等作用。鼠李素还能够抑制低密度脂蛋白的氧化。短叶松素广泛存在于蜂胶中，是一种具有抗氧化活性的生物类黄酮，能够抑制低密度脂蛋白的氧化及减少维生素e自由基。基于蜂胶活性成分的诸多特性，应用中将实施例1-3制备的稳定态的小分子蜂胶提取物作为原料加入到化妆品、药品和保健品中。对比例1a1、将天然蜂胶在于-35℃的低温下预冷30min，粉碎后过100目筛，得到蜂胶颗粒物，将蜂胶颗粒物在-20℃的低温下冷冻20min；a2、将恢复常温的蜂胶颗粒物用10倍的85％(v/v)的食用酒精浸提45min，采用漩涡混匀器辅助浸提，速度为800rmp/min；a3、采用连续回流提取法对s2中的混合物进行提取，提取时间2h，得到提取液；a4、使用板框压滤机进行过滤，过滤精度15μm，得到滤液；a5、采用喷雾干燥法对滤液进行干燥，得到固相蜂胶活性物；a6、将固相蜂胶活性物纳米级粉碎，并加入表面活性剂进行搅拌；a7、搅拌均匀后，得到稳定态的蜂胶活性物。试验例1分别取用等量的实施例1-3制备的小分子蜂胶提取物和对比例1制备的蜂胶提取物制备祛斑抗敏类化妆品，在祛斑抗敏类中，其他成分的重量和比例都相同，分别记作，实施例s1、试验例s2、试验例s3和对比例d1，随机选择30-45岁脸部有过敏、祛斑或面色暗沉情况的女性分成四组，每组十人，分别涂抹等量的四种祛斑抗敏类化妆品于脸部，在涂抹0.1小时、0.5小时、1.0小时和2小时后，分别测量脸部皮肤上化妆品残留物中黄酮类物质的含量(检测方法为固相萃取-高效液相色谱法)，并推算出肌肤的吸收率，试验结果如表一。涂抹0.1小时后涂抹0.5小时后涂抹1.0小时后涂抹2小时后实施例s169.35％87.15％91.06％96.61％试验例s271.52％90.41％96.34％99.32％试验例s370.18％88.36％91.85％97.17％对比例d149.37％70.53％76.29％81.24％表一通过上述数据说明，检测以黄酮类物质为代表的蜂胶提取物的吸收率可以得出小分子蜂胶提取物的吸收率明显比普通的蜂胶提取物的吸收率更高，由此可得出，小分子蜂胶提取物更容易被吸收，吸收率提升后，化妆品的使用效果也可以得到提升。试验例2分别取用等量的实施例1-3制备的小分子蜂胶提取物和对比例1制备的蜂胶保健品，分别喂养四组小白鼠，每组8只，小白鼠选用远交系km小鼠，体重约25g，误差小于1g，分别记作实施例a1、试验例a2、试验例a3和对比例b1，分别在喂养后1小时、2小时、3小时和4小时后提取白鼠胃内残留物，检测其黄酮类物质含量(检测方法为固相萃取-高效液相色谱法)，并推断出吸收率，试验结果如表二。1小时后2小时后3小时后4小时后实施例a141、36％56.39％88.74％98.46％试验例a244.61％58.74％90.26％99.61％试验例a340.27％55.52％87.32％98.19％对比例b132.52％46.27％65.70％81.24％表二通过上述数据说明，作为保健品，小分子化后的蜂胶提取物比普通的蜂胶提取物的吸收速度更快，其有效物质更能有效快速地被人体吸收。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12