药物组合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用的制作方法

本发明属于药物化学和细胞生物学领域，涉及药物组合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，具体涉及化合物r162与阿糖胞苷组合在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。

背景技术：

肿瘤是危害人类健康的重要疾病之一，根据《lancet》杂志公布的2016全球疾病负担研究(globalburdenofdiseasestudy2016，gbd)显示，全球每年因恶性肿瘤死亡人数为8927.4万人。恶性肿瘤成为仅次于心脑血管疾病的第二大死因，从2006年到2016年，肿瘤死亡人数增加了17.8％(参见文献1：disease,g.b.d.,i.injury,andc.prevalence,global,regional,andnationalincidence,prevalence,andyearslivedwithdisabilityfor328diseasesandinjuriesfor195countries,1990-2016:asystematicanalysisfortheglobalburdenofdiseasestudy2016.lancet,2017.390(10100):p.1211-1259.)。恶性肿瘤已成为危害人类健康的重要杀手，针对癌症的研究和治疗是现今医学的重要热点内容。

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛(参见文献2：dinardo,c.d.andj.e.cortes,mutationsinaml:prognosticandtherapeuticimplications.hematologyamsochematoleducprogram,2016.2016(1):p.348-355.)。

根据细胞系列不同，急性白血病分为急性淋巴细胞性白血病(acutelymphocyticleukemia,all)和急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,aml),后者又分为m0-m7几个亚型，其中m3型又称为急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia,apl)；慢性白血病又分为慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,cll)和慢性髓系白血病(chronicmyeloidleukemia,cml)(参见文献3：short,n.j.,m.e.rytting,andj.e.cortes,acutemyeloidleukaemia.lancet,2018.392(10147):p.593-606.)。

目前aml的治疗方案，对身体状况良好的年轻患者主要采用阿糖胞苷联合蔥环类药物，如柔红霉素或去甲柔红霉素等组成的3+7方案，中高危患者后续异体造血干细胞移植治疗；60岁以上体能状况不佳患者常采用定期注射小剂量阿糖胞苷作为一线治疗方案(参见文献4：juliusson,g.,etal.,ageandacutemyeloidleukemia:realworlddataondecisiontotreatandoutcomesfromtheswedishacuteleukemiaregistry.blood,2009.113(18):p.4179-87.)。dna去甲基化药物azacitidine和decitabine分别于2008年和2012年获批用于aml治疗，相比于阿糖胞苷类化疗药物，其有毒副作用小的优势，常作为后者的替代药物(参见文献5：mozessohn,l.,etal.,azacitidineinthe'real-world':anevaluationof1101higher-riskmyelodysplasticsyndrome/lowblastcountacutemyeloidleukaemiapatientsinontario,canada.brjhaematol,2018.181(6):p.803-815.；文献6：wierzbowska,a.,etal.,decitabineimprovesresponserateandprolongsprogression-freesurvivalinolderpatientswithnewlydiagnosedacutemyeloidleukemiaandwithmonosomalkaryotype:asubgroupanalysisofthedaco-016trial.amjhematol,2018.93(5):p.e125-e127.)。此外，midostaurin常用于携带有flt3突变的aml患者(参见文献7：levis,m.,midostaurinapprovedforflt3-mutatedaml.blood,2017.129(26):p.3403-3406.)。然而由于aml存在复发率高，长期无病生存率低的特点，为有效改善aml患者的预后，开发高效低毒的新型aml治疗药物势在必行。美国专利(申请号：62112937)公布了一种谷氨酸脱氢酶1(glud1)的特异性活性抑制剂r162的分子式，r162可以抑制多种实体肿瘤细胞和白血病细胞的增值，但是关于r162联合其他化疗药物的研究还未见有相关报道。阿糖胞苷是最常用的化疗药物，本发明将r162与阿糖胞苷组合，观察r162与阿糖胞苷后对aml的作用，为临床治疗白血病提供理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种药物组合物在制备治疗急性髓性白血病药物中的应用。所述药物组合物由化合物r162和阿糖胞苷组成，所述阿糖胞苷与化合物r162用量摩尔比为：1:0.8-1:10，优选摩尔比为1:1。

化合物r162的化学名称为：2-烯丙基-1-羟基-9,10-蒽醌，化学结构式如下：

(2-烯丙基-1-羟基-9,10-蒽醌)(r162)

将r162组合阿糖胞苷对aml细胞增殖的研究，经aml细胞株和aml患者原代细胞的研究显示：r162能抑制aml细胞株的增殖，而且降低原代aml细胞对阿糖胞苷的ic50。

通过体内实验研究表明，r162组合阿糖胞苷能降低小鼠的肿瘤负荷，有效缓解aml小鼠的疾病进展，延长小鼠的生存期。

本发明研究显示，r162能抑制aml细胞株thp-1，hl-60，nb4，molm-13的活性，并且这一抑制作用呈剂量依赖性。在aml原代细胞中r162能降低阿糖胞苷对于aml细胞的ic50。与此同时，r162对cd34+造血干细胞没有增殖抑制作用。aml小鼠研究结果显示，与单一的r162或阿糖胞苷组相比，组合物组3周后小鼠白血病负荷显著降低。与单一r162或阿糖胞苷相比，组合物可降低小鼠白血病侵袭症状，包括缩小脾肿大和降低骨髓中原始细胞百分比。生存分析结果表明，组合物组将aml小鼠的存活时间延长至31天，而单用r162或阿糖胞苷的生存时间均为26天。本发明首次公开了r162和阿糖胞苷组合物在治疗aml中的应用。所述组合物可协同抑制aml细胞增殖。本发明为寻找急性髓系白血病新的治疗方法提供了理论依据。

附图说明

图1是利用cck8法检测r162对aml细胞株thp-1，hl-60，moml-13，nb4生长抑制作用(*：p<0.05,**：p<0.005,***：p<0.001,****：p<0.0001)。

图2是利用cck8法检测r162联合阿糖胞苷对3例aml病人原代细胞生长抑制作用，图中a，b，c分别代表三例aml患者。

图3是利用cck8法检测r162联合阿糖胞苷对4例cd34+造血干细胞生长抑制作用a，b，c，d分别代表四例脐带血捐献者。

图4是荧光素酶标记的molm-13细胞构建白血病小鼠模型后，不同处理组在细胞移植7，14，21天检测时间点的荧光值。

图5是各组白血病小鼠在死亡终点时骨髓中原始细胞百分比含量(*：p<0.05,***：p<0.001,****：p<0.0001)。

图6是各组白血病小鼠在死亡终点时脾脏的大小。

图7是白血病细胞移植后，不同处理方式对小鼠生存期的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。

在以下实施例中，如无特别说明，aml细胞株thp-1、hl-60、nb4、molm-13来自atcc细胞库，r162来自medchemexpress。

实施例1：r162对aml细胞株增殖的影响

取处于对数生长期的aml细胞株thp-1，hl-60，molm-13，nb4离心重悬计数，以1×10⁵个/孔密度种于6孔板中，完全培养基作为空白对照，实验组中加入r-162至终浓度为5，10，15，20，25，30，35μm。在细胞接种的第7天分别将细胞吹均匀后转移进96孔板中，每组四个孔，每孔100μl，另外再加入10μl的cck8溶液，37℃，5％co2孵育2h后用酶标仪在450nm波长处测定吸光度(od)。以实验组od/对照组od作为评价细胞活性的指标。

r162对aml细胞活性抑制研究结果显示，r162能抑制thp-1，hl-60，molm-13，nb4细胞株的活性，并且呈剂量和时间依赖性(图1)。

实施例2：组合物治疗aml的体外研究

从初诊的aml患者获得aml原代细胞，加入含有10％胎牛血清的imdm培养基，培养于37℃，5％co2的培养箱中培养。在aml原代细胞研究中，组合物中阿糖胞苷浓度为0,2,4,8,16μm、r162浓度为20μm，实验分为单用阿糖胞苷组和阿糖胞苷+r162组。将原代aml细胞置于6孔板中，1×10⁵个/孔。在药物处理48h后，将100μl细胞接种到96孔板中，向每个孔中加入10μlcck-8测定溶液，在37℃下再孵育2小时，在450nm的波长下读板测定吸光度，计算各组细胞对阿糖胞苷的ic50。

3例初诊的aml患者原代细胞实验结果表明，r162能增加白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性，r162与阿糖胞苷组合物能降低白血病细胞对阿糖胞苷的ic50，三例原代细胞对阿糖胞苷的ic50分别为6.38、3.73、4.69μm，而组合物的ic50为4.88、2.96、3.55μm(图2，a,b,c分别代表三名aml患者)。

在cd34+造血干细胞研究中，利用淋巴细胞分离液从脐带血中纯化单核细胞。根据制造商的说明，使用磁性cd34微磁珠从单核细胞中分离cd34+造血干细胞，培养在含有scf(100ng/ml)和il-3(2ng/ml)的stemspansfemii培养基中培养2天，组合物中阿糖胞苷浓度和r162的浓度分别为0.2μm和20μm。实验分为对照组、单用阿糖胞苷组、单用r162组和阿糖胞苷+r162组。将cd34+造血干细胞置于6孔板中，1×10⁵个/孔。在药物处理48h后，将100μl细胞接种到96孔板中，向每个孔中加入10μlcck-8测定溶液，在37℃下再孵育2小时，在450nm的波长下读板测定吸光度，计算各组细胞的存活率。

4例脐带血cd34+造血干细胞的研究结果表明，r162对正常的造血干细胞没有抑制作用(图3，a,b,c,d分别代表四名脐带血捐赠者)。

实施例3：组合物治疗aml的体内研究

雌性b-nsgtm(nod-prkdcscidii2rgtm1/bcgen)小鼠(6-8周龄)用于aml建模，尾静脉接种1×10⁶个molm-13-luc细胞。腹膜内注射d-荧光素(250mg/kg)，并使用ivisluminalt系统成像。在治疗前将小鼠随机分成四组，分别是对照组、单一阿糖胞苷组、单一r162组、组合物组。每天观察小鼠并称重，并且每7天通过生物发光成像评估白血病负荷。组合物中用20mg/kg阿糖胞苷，20mg/kgr162处理小鼠。将阿糖胞苷在pbs中稀释至25mg/ml并储存在-20℃。r162溶于dmso中至100mg/ml，避光保存在-20℃。从移植后第8天开始每天通过静脉内注射给予阿糖胞苷，通过腹膜内注射给予r162。在对照组中，注射pbs和pbs配置的50％的dmso。

研究结果：组合物组3周后小鼠白血病负荷显著降低。与单一r162或单一阿糖胞苷相比，组合物组可降低小鼠白血病侵袭症状(图4)，包括缩小脾肿大(图5)和降低骨髓中原始细胞百分比(图6)。生存分析结果表明，组合物组aml小鼠的存活时间延长至31天，而单用r162或单用阿糖胞苷的生存时间为26天(图7)，结果具有统计学意义。