抑制CWF19L1蛋白活性和/或表达量的物质在抑制RSV复制中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质在抑制rsv复制中的应用。

背景技术：

呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)是全球新生儿与老年人最为常见的呼吸道疾病病原之一。70％以上的rsv患儿是5岁以下的儿童，其中10％因下呼吸道感染(lrti)而入院治疗。自上世纪60年代，全球科学家不遗余力的研制rsv疫苗，遗憾的是市场上至今没有认证的预防疫苗。由此，who要求世界各国做好防控rsv的工作。

rsv致病机制对于其预防疫苗及治疗药物的设计至关重要。迄今为止，rsv感染致病研究主要集中在rsv免疫逃逸机制、宿主免疫损伤及炎症效应。感染初期，rsv(ns1、ns2、g)可阻碍tlr信号通路，抑制ifn-ⅰ型应答，避免天然免疫的抗病毒攻击，完成自我复制，传播至下呼吸道诱发肺部疾病。同时，大量rsv聚集活化tlrs、rig-ⅰ，诱导促炎基因表达，产生大量的il-2、il-6、tnf-α、ccl2、ccl3、ip-10等招募激活免疫细胞，侵入肺组织，造成肺部炎症反应导致损伤。现有研究表明rsv感染导致的细胞死亡与其致病机制密切相关。rsv致病过程复杂，影响因素众多，亟需深入探究。

技术实现要素：

本发明的目的是制备rsv疫苗或治疗由rsv引起的疾病。

本发明首先保护抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质的应用，可为k1)或k2)或k3)：

k1)制备产品；所述产品的功能可为c1)至c7)中的至少一种：

c1)预防由rsv引起的疾病；

c2)治疗由rsv引起的疾病；

c3)抑制rsv复制；

c4)提高感染rsv的宿主的细胞活力；

c5)促进感染rsv的宿主分泌炎症因子il-8；

c6)降低感染rsv的宿主的自噬小体的生成；

c7)降低感染rsv的宿主的自噬；

k2)开发或筛选试剂；所述试剂的用途为c1)至c7)中的至少一种；

k3)制备rsv疫苗。

本发明还保护将cwf19l1蛋白作为药物靶点的物质的应用，可为k1)或k2)或k3)：

k1)制备产品；所述产品的功能可为c1)至c7)中的至少一种：

c1)预防由rsv引起的疾病；

c2)治疗由rsv引起的疾病；

c3)抑制rsv复制；

c4)提高感染rsv的宿主的细胞活力；

c5)促进感染rsv的宿主分泌炎症因子il-8；

c6)降低感染rsv的宿主的自噬小体的生成；

c7)降低感染rsv的宿主的自噬；

k2)开发或筛选试剂；所述试剂的用途为c1)至c7)中的至少一种；

k3)制备rsv疫苗。

本发明还保护cwf19l1蛋白或“提高cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质”的应用，可为如下d3)至d7)中的至少一种：

d3)促进rsv复制；

d4)降低感染rsv的宿主的细胞活力；

d5)抑制感染rsv的宿主分泌炎症因子il-8；

d6)促进感染rsv的宿主的自噬小体的生成；

d7)增加感染rsv的宿主的自噬。

本发明还保护cwf19l1蛋白或“提高cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质”在制备rsv感染模型中的应用。

本发明还保护产品甲，其可含有抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质；所述产品甲的用途可为c1)至c7)中的至少一种：

c1)预防由rsv引起的疾病；

c2)治疗由rsv引起的疾病；

c3)抑制rsv复制；

c4)提高感染rsv的宿主的细胞活力；

c5)促进感染rsv的宿主分泌炎症因子il-8；

c6)降低感染rsv的宿主的自噬小体的生成；

c7)降低感染rsv的宿主的自噬。

本发明还保护产品乙，其可含有cwf19l1蛋白或“提高cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质”；所述产品乙的用途可为如下d3)至d7)中的至少一种：

d3)促进rsv复制；

d4)降低感染rsv的宿主的细胞活力；

d5)抑制感染rsv的宿主分泌炎症因子il-8；

d6)促进感染rsv的宿主的自噬小体的生成；

d7)增加感染rsv的宿主的自噬。

上述任一所述“抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质”为寡聚核酸sirna-cwf19l1；所述寡聚核酸sirna-cwf19l1可由seqidno：4所示单链核酸分子和seqidno：5所示单链核酸分子组成。

上述任一所述宿主可为肿瘤细胞或动物。所述肿瘤细胞具体可为肺癌细胞。所述肺癌细胞具体可为a549细胞。所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物可为小鼠。所述小鼠可为c57bl/6小鼠。

本发明还保护s1)、s2)、s3)、s4)或s5)。

s1)一种抑制rsv复制的方法，为降低宿主中cwf19l1蛋白活性和/或表达量。

s2)一种提高感染rsv的宿主的细胞活力的方法，为降低宿主中cwf19l1蛋白活性和/或表达量。

s3)一种促进感染rsv的宿主分泌炎症因子il-8的方法，为降低宿主中cwf19l1蛋白活性和/或表达量。

s4)一种降低感染rsv的宿主的自噬小体的生成的方法，为降低宿主中cwf19l1蛋白活性和/或表达量。

s5)一种降低感染rsv的宿主的自噬能力的方法，为降低宿主中cwf19l1蛋白活性和/或表达量。

上述任一所述的方法中，所述“降低宿主中cwf19l1蛋白活性和/或表达量”可为向宿主导入所述抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质。

上述任一所述的方法中，所述“抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质”为寡聚核酸sirna-cwf19l1；所述寡聚核酸sirna-cwf19l1可由seqidno：4所示单链核酸分子和seqidno：5所示单链核酸分子组成。

上述任一所述的方法中，所述宿主可为肿瘤细胞或动物。所述肿瘤细胞具体可为肺癌细胞。所述肺癌细胞具体可为a549细胞。所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物可为小鼠。所述小鼠可为c57bl/6小鼠。

上述任一所述的方法中，所述“向a549细胞导入寡聚核酸sirna-cwf19l1”的方法具体可为：(1)将a549细胞铺板，培养8-16h(如8-12h、12-16h、8h、12h或16h)；(2)加入寡聚核酸sirna-cwf19l1，采用转染试剂(如jetprimetransfectionreagent)转染20-30h。(1)中a549细胞和(2)中寡聚核酸sirna-cwf19l1的比例具体可为3×10⁴个a549细胞：5.3μl浓度为50nmol的寡聚核酸sirna-cwf19l1。

上述任一所述rsv感染模型中rsv的含量提高。

上述任一所述rsv具体可为rsva2株。

上述任一所述cwf19l1蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

上述任一所述编码cwf19l1蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

上述任一所述“促进感染rsv的小鼠分泌炎症因子il-8”可为感染rsv的小鼠肺部il-8的含量增加。

上述任一所述“促进感染rsv的a549细胞分泌炎症因子il-8”可为感染rsv的a549细胞产生il-8的含量增加。

上述任一所述由rsv引起的疾病可为急性rsv疾病和/或rsv上呼吸道感染(uri)和/或rsv下呼吸道感染(lri)。所述rsv上呼吸道感染可为支气管炎或咽炎。所述rsv下呼吸道感染可为肺炎。

本发明还保护寡聚核酸sirna-cwf19l1；所述寡聚核酸sirna-cwf19l1由seqidno：4所示单链核酸分子和seqidno：5所示单链核酸分子组成。

rsv(具体为rsva2株)感染细胞(具体为a549细胞)或小鼠(具体为c57bl/6小鼠)后，cwf19l1蛋白的含量显著下降；敲降cwf19l1蛋白能够有效控制rsv复制，同时提高感染细胞存活率；cwf19l1蛋白可以抑制炎性因子il-8的分泌。与此同时，还发现cwf19l1与rsv诱导的自噬相关，过表达cwf19l1能够诱导自噬小体产生。由此可见，cwf19l1蛋白参与rsv复制、炎症与自噬相关的过程。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为rsv感染a549细胞不同时间点cwf19l1蛋白含量变化示意图。a为westernblot检测未感染rsva2株的a549细胞(即0)、rsva2株分别感染a549细胞6h、12h、24h、48h和72h时，cwf19l1蛋白含量的变化；b为灰度分析量化cwf19l1蛋白在未感染rsva2株和感染rsva2株后不同时间点的相对含量。

图2为rsv感染c57bl/6小鼠肺部cwf19l1蛋白含量变化示意图。a为westernblot检测未感染rsva2株的c57bl/6小鼠(即0)、rsva2株分别感染c57bl/6小鼠1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天时，cwf19l1蛋白含量的变化；b为灰度分析量化cwf19l1蛋白在未感染c57bl/6小鼠和感染c57bl/6小鼠后不同时间点的相对含量。

图3为实时定量pcr方法检测提高cwf19l1蛋白表达量对rsva2株复制的影响。

图4为tcid50方法检测提高cwf19l1蛋白表达量对rsva2株复制的影响。

图5为实时定量pcr方法检测降低cwf19l1蛋白的表达量对rsva2株复制的影响。

图6为tcid50方法检测降低cwf19l1蛋白的表达量对rsva2株复制的影响。

图7为实时定量pcr方法和tcid50方法检测尾静脉注射重组蛋白cwf19l1对小鼠肺部rsva2株复制的影响。

图8为cwf19l1蛋白对rsv感染细胞的细胞活力影响。

图9为cwf19l1蛋白参与rsv诱导自噬过程。

图10为实施例5中步骤一的cwf19l1蛋白抑制rsv感染后的il-8相关的炎症应答。

图11为实施例5中步骤二的cwf19l1蛋白抑制rsv感染后的il-8相关的炎症应答。

图12为实施例5中步骤三实时定量pcr方法检测cwf19l1蛋白对小鼠肺部il-8的含量的影响。

图13为实施例5中步骤三elisa方法检测cwf19l1蛋白对小鼠肺部il-8的含量的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

ripa裂解液为solarbio公司的产品，货号为r0010。mrfp-gfp-lc3为汉恒生物科技(上海)有限公司的产品。dmem培养基为gibco公司的产品，货号为11965-092。pbs缓冲液为macgene公司的产品，货号为cc008。胎牛血清为gibco公司的产品，货号为15140071。rsva2株为atcc的产品。p3xflag-cmv载体为sigma公司的产品，产品目录号为e7783。6×蛋白loading为北京全式金生物技术有限公司，货号为dl101-02。

a549细胞由国家实验细胞资源共享平台(北京协和细胞资源中心)提供，资源号为3111c0001ccc000002。

cwf19l1基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。cwf19l1基因编码cwf19l1蛋白。cwf19l1蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

采用方差分析差异性，通过spss16.0实现。*p<0.05，**p<0.001。

实施例1、rsv感染模型中cwf19l1蛋白水平均呈现下降的趋势

一、rsv感染a549细胞中cwf19l1蛋白水平的变化

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取24孔板，每孔铺5×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔分别加入7.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

4、完成步骤3后，弃液相，用pbs缓冲液洗涤2遍。

5、完成步骤4后，向各孔分别加入500μl含2％胎牛血清的dmem培养基，37℃、5％co2培养6h、12h、24h、48h或72h，弃上清液，用pbs缓冲液洗涤2遍。

6、完成步骤5后，向各孔分别加入40μlripa裂解液，冰上裂解10min；之后加入6×蛋白loading，沸水浴5-10min。

7、完成步骤6后，进行westernblot检测。采用cwf19l1抗体(abcam公司的产品，货号为ab150841)作为一抗检测cwf19l1。采用抗兔抗体β-actin(13e5)rabbitmab(cst公司的产品，货号为4970)作为一抗检测β-actin。

8、完成步骤7后，利用quantityone软件对westernblot进行灰度分析，量化cwf19l1蛋白在感染后不同时间点的相对含量。

按照上述方法，将步骤1-5替换为步骤a，其它步骤均不变，得到未感染rsva2株的a549细胞的cwf19l1蛋白水平。步骤a为：取24孔板，每孔铺5×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h，然后加入不含病毒的dmem溶液(无血清的dmem培养基)，37℃、5％co2孵育1h，弃液相，用pbs缓冲液洗涤2遍。

westernblot检测结果见图1中a(beta-actin为β-actin，0为未感染rsva2株的a549细胞)。westernblot灰度分析结果见图1中b(0为未感染rsva2株的a549细胞)。结果表明，随着rsva2株感染a549细胞时间的增加，cwf19l1蛋白水平显著降低，直到72h有所回升。

二、rsv感染小鼠，肺部cwf19l1蛋白水平的变化

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为1×10⁷tcid50/100μl的病毒感染液。

2、完成步骤1后，取c57bl/6小鼠，用戊巴比妥麻醉，然后用20μl病毒感染液滴鼻感染。

3、取完成步骤2后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天或第7天的小鼠全肺组织，按质量体积比1:10加入ripa裂解液(即100mg小鼠肺组织加入1mlripa裂解液)，用电动匀浆器进行研磨；之后8000rpm离心10min，收集上清液；最后向上清液中加入loadingbuffer(北京全式金生物技术有限公司的产品，货号m20612)，100℃水浴6min。

4、完成步骤3后，进行westernblot检测。采用cwf19l1抗体作为一抗检测cwf19l1蛋白。采用抗兔抗体β-actin(13e5)rabbitmab作为一抗检测β-actin。

5、完成步骤4后，利用quantityone软件对westernblot进行灰度分析，量化cwf19l1蛋白在感染后不同时间点的相对含量。

按照上述方法，将步骤1-3替换为步骤b，其它步骤均不变，得到未感染rsva2株的c57bl/6小鼠的cwf19l1蛋白水平。步骤b为：将c57bl/6小鼠用戊巴比妥麻醉，然后用20μl不含病毒感染液(为不含血清的dmem培养基)滴鼻，待小鼠清醒后取小鼠全肺组织，按质量体积比1:10加入ripa裂解液(即100mg小鼠肺组织加入1mlripa裂解液)，用电动匀浆器进行研磨；之后8000rpm离心10min，收集上清液；最后向上清液中加入loadingbuffer，100℃水浴6min。

westernblot检测结果见图2中a(beta-actin为β-actin，0为未感染rsva2株的c57bl/6小鼠)。westernblot灰度分析结果见图2中b(0为未感染rsva2株的c57bl/6小鼠)。结果表明，rsva2株感染c57bl/6小鼠，cwf19l1蛋白水平逐渐降低，直到感染后5、6天有所回升，第7天却又下降。

实施例2、cwf19l1蛋白对rsva2株复制的影响

一、重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1的获得

1、人工合成seqidno：1所示的双链dna分子(即cwf19l1基因)并以其作为模板，采用5’-tctagaatggcacagaaaccgct-3’(下划线为限制性内切酶xbai的识别位点)和5’-ggatccttagtcatccagagtaaa-3’(下划线为限制性内切酶bamhi的识别位点)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

2、取步骤1得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶bamhi和xbai进行酶切，用胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司的产品，货号为dp209-03)回收约1500bp的酶切产物。

3、取p3xflag-cmv载体，用限制性内切酶bamhi和xbai进行酶切，用胶回收试剂盒回收约6.3kb的载体骨架。

4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1。

将重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1进行测序。根据测序结果，对重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1进行结构描述如下：将p3xflag-cmv载体的限制性内切酶识别位点xbai和bamhi之间的dna小片段替换为seqidno：1所示的双链dna分子，得到的重组质粒。

重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1表达seqidno：2所示的cwf19l1蛋白。

二、提高cwf19l1蛋白表达量可以促进rsva2株复制

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取24孔板，每孔铺3×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1或0.5μgp3xflag-cmv载体，采用jetprimetransfectionreagent(polyplustransfection公司的产品，catno114-07)转染24h。

4、完成步骤3后，向各孔分别加入4.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

5、完成步骤4后，弃液相，用pbs缓冲液洗涤2遍。

6、完成步骤5后，向各孔分别加入500μl含2％(v/v)胎牛血清的dmem培养基，37℃、5％co2培养24h。

7、完成步骤6后，向各孔分别加入500μltrizol，室温放置10min；之后加入100μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5min，4℃、13000g离心15min；将上清转移至新的ep管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃、12000g离心10min；弃上清，用75％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，4℃、7500g离心5min；弃上清，将沉淀静置于通风橱中风干；用一定量rnasefreedh2o溶解rna沉淀，用rnase-freednasei(promega)消化基因组后利用nanodrop定量rna；用反转录试剂盒(transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix，全式金，货号at301-03)将rna反转录为cdna。

反转录反应体系为25μl，由12.5μl2×mix、1μl寡聚胸腺嘧啶引物、1μl随机引物、2μgrna和水组成。2×mix、寡聚胸腺嘧啶引物和随机引物均为反转录试剂盒中的组件。

8、完成步骤7后，采用tbgreenpremixextaq(takara公司的产品，货号为rr820q)实时定量pcr检测cdna中人gapdh和rsva2f基因表达量，采用相对定量2^-δδt方法分析数据。

实时定量pcr检测反应体系为20μl，由10μltbgreenpremixcextaq(2×)、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、2μlcdna和水组成。

检测人gapdh的上游引物为5'-ggtggtctcctctgacttcaaca-3'，下游引物为5'-gttgctgtagccaaattcgttgt-3'。

检测rsva2f基因的上游引物为5'-cagtgcagttagcaaaggct-3'，下游引物为5'-gctcgattgtttgttgctggt-3'。

检测结果见图3(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体)。结果表明，与p3xflag-cmv载体相比，重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1转染的a549细胞中rsva2的载量显著提高(p<0.05)。

9、完成步骤6后，将24孔板反复冻融，3000rpm离心5min，弃细胞碎片，收集上清。

10、取步骤9收集的上清，采用tcid50(respiratorysyncytialvirusinfectsprimaryneonatalandadultnaturalkillercellsandaffectstheirantiviraleffectorfunction)方法测定病毒滴度。

检测结果见图4(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体)。结果表明，与p3xflag-cmv载体相比，重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1转染的a549细胞中rsva2的载量显著提高(p<0.05)。

上述结果表明，提高a549细胞中cwf19l1蛋白的表达量，则可以促进rsva2株复制。

三、降低cwf19l1蛋白的表达量可以抑制rsva2株复制

1、sirna-cwf19l1和sirna-nonsense的获得

人工合成sirna-cwf19l1和sirna-nonsense。

sirna-cwf19l1为双链rna，靶细胞序列为：5’-gtaccaggttatagtttta-3’(seqidno：3)。其中正义链(非作用链)的核苷酸序列为5’-guaccagguuauaguuuuadtdt-3’(seqidno：4)，反义链(作用链)的核苷酸序列为5’-uaaaacuauaaccuggtucdtdt-3’(seqidno：5)。

sirna-nonsense为双链rna，从锐博生物公司购买，产品编号为sin0000001-1-5。

2、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

3、取24孔板，每孔铺3×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

4、完成步骤3后，向各孔加入5.3μl浓度为50nmol的sirna-cwf19l1或5.3μl浓度为50nmol的sirna-nonsense，采用jetprimetransfectionreagent转染24h。

5、完成步骤4后，向各孔分别加入4.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

6、完成步骤5后，弃液相，用pbs缓冲液洗涤2遍。

7、完成步骤6后，向各孔分别加入500μl含2％(v/v)胎牛血清的dmem培养基，37℃、5％co2培养24h。

8、完成步骤7后，向各孔分别加入500μltrizol，室温放置10min；之后加入100μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5min，4℃、13000g离心15min；将上清转移至新的ep管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃、12000g离心10min；弃上清，用75％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，4℃、7500g离心5min；弃上清，将沉淀静置于通风橱中风干；用一定量rnasefreedh2o溶解rna沉淀，用rnase-freednasei消化基因组后利用nanodrop定量rna；用反转录试剂盒将rna反转录为cdna。

反转录反应体系同步骤二中7的反转录反应体系。

9、完成步骤8后，采用tbgreenpremixextaq实时定量pcr检测cdna中人gapdh和rsva2f基因表达量，采用相对定量2^-δδt方法分析数据。

实时定量pcr检测反应体系、检测人gapdh的引物和检测rsva2的引物同步骤二中8的体系和引物。

检测结果见图5。结果表明，与sirna-nonsense相比，sirna-cwf19l1转染的a549细胞中rsva2的载量显著降低(p<0.01)。

10、完成步骤7后，将24孔板反复冻融，3000rpm离心5min，弃细胞碎片，收集上清。

11、取步骤10收集的上清，采用tcid50方法测定病毒滴度。

检测结果见图6。结果表明，与sirna-nonsense相比，sirna-cwf19l1转染的a549细胞中rsva2的载量显著降低(p<0.01)。

上述结果表明，降低a549细胞中cwf19l1蛋白的表达量，则可以抑制rsva2株复制。

四、尾静脉注射重组蛋白cwf19l1可以促进rsva2株复制

重组蛋白cwf19l1为abcam公司的产品，货号为ab163045。

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为1×10⁷tcid50/100μl的病毒感染液。

2、取c57bl/6小鼠，尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液(约10μg重组蛋白cwf19l1)或等体积的pbs缓冲液。

3、完成步骤2后3h，取所述c57bl/6小鼠，用戊巴比妥麻醉，然后用20μl病毒感染液滴鼻感染。

4、取完成步骤3后第3天的小鼠全肺组织，按质量体积比1:10加入dmem培养基(即100mg小鼠肺组织加入1mldmem培养基)，用电动匀浆器进行研磨；之后8000rpm离心10min，收集上清液。

5、完成步骤4后，将500μl上清液和500μltrizol混合，室温放置5min；之后加入100μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5min，4℃、13000g离心15min；将上清转移至新的ep管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃、12000g离心10min；弃上清，用75％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，4℃、7500g离心5min；弃上清，将沉淀静置于通风橱中风干；用一定量rnasefreedh2o溶解rna沉淀，用rnase-freednasei消化基因组后利用nanodrop定量rna；用反转录试剂盒将rna反转录为cdna。

反转录反应体系同步骤二中7的反转录反应体系。

6、完成步骤5后，采用tbgreenpremixextaq实时定量pcr检测cdna中小鼠gapdh和rsva2f基因表达量，采用相对定量2^-δδt方法分析数据。

实时定量pcr检测反应体系和检测rsva2的引物同步骤二中8的体系和相应的引物。

检测小鼠gapdh的上游引物为5'-acagccgcatcttcttgtgcagtg-3'，下游引物为5'-ggccttgactgtgccgttacct-3'。

检测结果见图7中a(正常感染组为尾静脉注射pbs缓冲液，cwf19l1蛋白注射组为尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液)。结果表明，与尾静脉注射pbs缓冲液相比，尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液能够促进rsva2在小鼠肺部复制。

7、将步骤4收集的上清液反复冻融，3000rpm离心5min，弃细胞碎片，收集上清。

8、取步骤7收集的上清，采用tcid50方法测定病毒滴度。

检测结果见图7中b(正常感染组为尾静脉注射pbs缓冲液，cwf19l1蛋白注射组为尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液)。结果表明，与尾静脉注射pbs缓冲液相比，尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液能够促进rsva2在小鼠肺部复制。

上述结果表明，向c57bl/6小鼠尾静脉注射重组蛋白cwf19l1，可以促进rsva2株在小鼠肺部复制。

实施例3、cwf19l1蛋白降低rsv感染细胞的细胞活力

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取24孔板，每孔铺3×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1、0.5μgp3xflag-cmv载体、50nmolsirna-cwf19l1或50nmolsirna-nonsense，采用jetprimetransfectionreagent转染24h。

4、完成步骤3后，向各孔分别加入4.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

5、完成步骤4后24h，弃液相，mts法检测细胞活力，即为rsva感染组的细胞活力。

按照上述方法，将步骤1-5替换为步骤c，其它步骤均不变，得到未感染rsva2株的a549细胞的细胞活力。步骤c为：取24孔板，每孔铺3×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h；向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1、0.5μgp3xflag-cmv载体、50nmolsirna-cwf19l1或50nmolsirna-nonsense，采用jetprimetransfectionreagent转染24h；然后37℃、5％co2培养1h；24h后，弃液相，mts法检测细胞活力，即为未感染rsv组的细胞活力。

检测结果见图8(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体，nonsensesirna为sirna-nonsense，si-cwf19l1为sirna-cwf19l1，medium为未感染rsv组，rsva为rsva感染组)。结果表明，rsv感染敲降cwf19l1的a549细胞，使得a549细胞活力大大提高；rsv感染过表达cwf19l1的a549细胞，使得a549细胞活力显著降低。

实施例4、cwf19l1蛋白参与rsv诱导自噬小体的生成

一、westernblot检测实验

lc3ⅰ/ⅱ、atg5和atg3均为自噬相关蛋白。

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取24孔板，每孔铺5×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1或0.5μgp3xflag-cmv载体，采用jetprimetransfectionreagent转染24h。

4、完成步骤3后，向各孔分别加入7.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

5、完成步骤4后24h，弃液相，用pbs缓冲液洗涤2遍。

6、完成步骤5后，向各孔分别加入40μlripa裂解液，冰上裂解10min；之后加入6×蛋白loading，沸水浴5-10min。

7、完成步骤6后，进行westernblot检测。采用cwf19l1抗体作为一抗检测cwf19l1。采用抗兔抗体β-actin(13e5)rabbitmab作为一抗检测β-actin。采用lc3a/b抗体(cst公司的产品，货号为4108)作为一抗检测lc3ⅰ/ⅱ。采用atg3抗体(cst公司的产品，货号为3415)作为一抗检测atg3。采用atg5抗体(cst公司的产品，货号为2630)作为一抗检测atg5。

westernblot检测结果见图9中a(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体)。结果表明，转染重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1的a549细胞，cwf19l1蛋白水平显著升高，lc3i/ii的转化率降低，atg3蛋白水平和atg5蛋白水平均显著降低。

二、激光共聚焦观察自噬小体的形成与降解

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取装有载玻片的24孔板，在每孔的载玻片上铺5×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1或0.5μgp3xflag-cmv载体，采用jetprimetransfectionreagent转染24h。

4、完成步骤3后，向各孔分别加入2μlmrfp-gfp-lc3，37℃、5％co2培养2h。

5、完成步骤4后，向各孔分别加入7.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

6、完成步骤5后24h，将细胞铺在载玻片上；加入500μl预冷的丙酮，4℃静置20min；吸出丙酮，向载玻片上加入1-2滴封片剂，固定好的载玻片倒扣放在玻璃载玻片上，切忌出现气泡。避光晾干，拍照分析。

通过激光共聚焦显微镜观察自噬体的形成与降解，检测结果见图9中b

(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体)。利用mrfp-gfp-lc3监测追踪lc3，gfp的增强代表自噬小体形成，而gfp的减弱表明自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。结果表明，转染重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1的a549细胞，单个细胞内绿色荧光增强，红色荧光加强。

上述结果表明，cwf19l1蛋白参与rsv诱导自噬过程，即cwf19l1蛋白参与rsv诱导自噬小体的生成。

实施例5、cwf19l1蛋白参与rsv诱导的炎症

一、cwf19l1蛋白抑制rsv感染后的il-8相关的炎症应答的实验一

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取24孔板，每孔铺3×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1、0.5μgp3xflag-cmv载体、50nmolsirna-cwf19l1或50nmolsirna-nonsense，采用jetprimetransfectionreagent转染24h。

4、完成步骤3后，向各孔分别加入7.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

5、完成步骤4后24h，弃液相，向各孔分别加入500μltrizol，室温放置10min；之后加入100μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5min，4℃、13000g离心15min；将上清转移至新的ep管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃、12000g离心10min；弃上清，用75％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，4℃、7500g离心5min；弃上清，将沉淀静置于通风橱中风干；用一定量rnasefreedh2o溶解rna沉淀，用rnase-freednasei消化基因组后利用nanodrop定量rna；用反转录试剂盒将rna反转录为cdna。

反转录反应体系同实施例2、步骤二中7的反转录反应体系。

6、完成步骤5后，用tbgreenpremixextaq实时定量pcr检测cdna中人gapdh基因和il-8基因表达量，采用相对定量2^-δδt方法分析数据。

实时定量pcr检测反应体系和检测人gapdh的引物同实施例2、步骤二中8的体系和相应的引物。

检测il-8的上游引物为5'-gagagtgattgagagtggaccac-3'，下游引物为5'-cacaaccctctgcacccagttt-3'。

检测结果见图10(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体)。结果表明，过表达cwf19l1蛋白抑制rsv感染a549细胞产生il-8，敲降cwf19l1蛋白反而会增加rsv感染a549产生il-8的含量。

二、cwf19l1蛋白抑制rsv感染后的il-8相关的炎症应答的实验二

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为10⁷tcid50/ml的感染溶液。

2、取24孔板，每孔铺3×10⁴个a549细胞，37℃、5％co2培养12h。

3、完成步骤2后，向各孔加入0.5μg重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1、0.5μgp3xflag-cmv载体、50nmolsirna-cwf19l1或50nmolsirna-nonsense，采用jetprimetransfectionreagent转染24h。

4、完成步骤3后，向各孔分别加入7.3μl步骤1制备的感染溶液，37℃、5％co2培养1h。

5、完成步骤4后24h，弃上清液，加入50μlpbs缓冲液，然后反复冻融，8000rpm离心5min，收集上清。

6、取步骤5收集的上清，采用elisa方法测定il-8含量。

检测结果见图11(p3xflag-cmv-cwf19l1为重组质粒p3xflag-cmv-cwf19l1，p3xflag-cmv为p3xflag-cmv载体)。结果表明，过表达cwf19l1蛋白抑制rsv感染a549细胞产生il-8，敲降cwf19l1蛋白反而会增加rsv感染a549产生il-8的含量。

由此可见，cwf19l1蛋白抑制rsv感染后的il-8相关的炎症应答。

三、cwf19l1蛋白抑制rsv诱发的il-8升高

1、取rsva2株，用dmem培养基溶解，得到滴度为1×10⁷tcid50/100μl的病毒感染液。

2、取c57bl/6小鼠，尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液(约10μg重组蛋白cwf19l1)或等体积的pbs缓冲液。

3、完成步骤2后3h，取所述c57bl/6小鼠，用戊巴比妥麻醉，然后用20μl病毒感染液滴鼻感染。

4、取完成步骤3后第3天的小鼠全肺组织，按质量体积比1:10加入dmem培养基(即100mg小鼠肺组织加入1mldmem培养基)，用电动匀浆器进行研磨；之后8000rpm离心10min，收集上清液。

5、完成步骤4后，将500μl上清液和500μltrizol混合，室温放置5min；之后加入100μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5min，4℃、13000g离心15min；将上清转移至新的ep管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃、12000g离心10min；弃上清，用75％(v/v)乙醇水溶液重悬沉淀，4℃、7500g离心5min；弃上清，将沉淀静置于通风橱中风干；用一定量rnasefreedh2o溶解rna沉淀，用rnase-freednasei消化基因组后利用nanodrop定量rna；用反转录试剂盒将rna反转录为cdna。

反转录反应体系同实施例2、步骤二中7的反转录反应体系。

6、完成步骤5后，采用tbgreenpremixextaq实时定量pcr检测cdna中小鼠il-8，采用2^-δδt方法分析数据。

实时定量pcr检测反应体系同实施例2、步骤二中8的体系。

检测小鼠il-8的上游引物为5'-cctaggcatcttcgtccgtc-3'，下游引物为5'-ttcacccatggagcatcagg-3'。

检测结果见图12(正常感染组为尾静脉注射pbs缓冲液，cwf19l1蛋白注射组为尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液)。结果表明，与尾静脉注射pbs缓冲液相比，尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液能显著降低肺部il-8的含量。

7、将步骤4收集的上清液反复冻融，8000rpm离心5min，收集上清。

8、取步骤7收集的上清，采用elisa方法测定il-8含量。

检测结果见图13(正常感染组为尾静脉注射pbs缓冲液，cwf19l1蛋白注射组为尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液)。结果表明，与尾静脉注射pbs缓冲液相比，尾静脉注射含重组蛋白cwf19l1的pbs缓冲液能显著降低肺部il-8的含量。

上述结果表明，cwf19l1蛋白可以抑制rsv诱发的il-8升高。

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>抑制cwf19l1蛋白活性和/或表达量的物质在抑制rsv复制中的应用

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