人参二醇在制备抑制PD-L1、肿瘤细胞增殖蛋白的表达的药物中的应用的制作方法

本发明属于天然小分子药物应用技术领域，尤其涉及人参二醇在制备抑制pd-l1蛋白、肿瘤细胞增殖蛋白的表达的药物中的应用。

背景技术：

结肠癌属于我国九大常见恶性肿瘤之一，据who统计，结肠癌发病率位居常见肿瘤第三位。大多数结肠癌的发展过程是由局灶性的隐形性损伤到腺瘤再到恶性肿瘤的过程，此过程通常是由局部组织损伤引起的慢性炎症所介导的。在肿瘤的生长、侵袭和转移的过程中，肿瘤需要逃逸宿主免疫监视，使机体对肿瘤抗原无免疫应答。在这种肿瘤微环境下，免疫系统通常处于一种被抑制的状态，不仅有助于结肠肠癌侵袭和转移，也促使肿瘤产生抗药性，降低传统放化疗对肿瘤细胞的杀伤效果。

在这种情况下，消除肿瘤区域特有的免疫逃逸微环境，解除其对免疫系统，尤其是细胞毒性t淋巴细胞的抑制，也成为结肠癌治疗的全新方向。

程序性死亡受体1配体(programmedcelldeathligand1,pd-l1)属于b7家族成员，它是程序性死亡受体1(programmedcelldeathprotein1,pd-1)的天然结合配体，pd-l1通过与pd-1结合，负向调节t细胞活性，抑制t细胞产生的免疫应答。在正常情况下，pd-1/pd-l1信号可以维持机体免疫耐受，防止过度炎症反应和自身免疫疾病的发生；而在肿瘤环境下，此信号通路却使机体抗肿瘤免疫受到抑制，降低肿瘤患者体内t细胞的数量与功能。阻断pd-1/pd-l1相互作用，可以恢复体内抗肿瘤免疫效应和t细胞功能，从而抑制肿瘤生长和转移，近年来pd-1/pd-l1信号途径已经成为免疫治疗的新靶标。

有临床样本研究显示，pd-l1在结肠癌患者肿瘤组织中均有不同程度表达，并且表达程度与肿瘤恶性程度，患者生存时间相关联，表明pd-l1不仅是判断结肠癌患者预后的预测指标之一，抗pd-l1治疗也是治疗结肠癌的有效手段。

目前pd-1/pd-l1抑制剂的开发主要集中在单克隆抗体领域，已有尼伏单抗(nivolumab)、潘利珠单抗(pembrolizumab)、阿维单抗(avelumab)等多种药物上市，应用于多种恶性肿瘤，治疗效果显著，与之对比，小分子抑制剂的药物研发却进展缓慢，亟待开发。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供人参二醇在制备抑制pd-l1蛋白、肿瘤细胞增殖蛋白的表达的药物中的应用；所述人参二醇能够剂量性依赖的抑制pd-l1蛋白表达，抑制肿瘤细胞增殖相关蛋白的表达，能够增强肿瘤相关细胞毒性t淋巴细胞活力，降低肿瘤细胞增殖能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了人参二醇在制备抑制pd-l1蛋白表达的药物中的应用。

本发明提供了人参二醇在制备抑制pd-l1基因转录的药物中的应用。

本发明提供了人参二醇在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

本发明提供了人参二醇在制备抑制肿瘤细胞增殖蛋白表达的药物中的应用。

优选的，所述肿瘤细胞增殖蛋白包括cyclind1，c-myc和vegf。

本发明提供了人参二醇在制备增强细胞毒性t淋巴细胞活力的药物中的应用。

优选的，所述细胞毒性t淋巴细胞为被肿瘤pd-l1通路抑制的细胞毒性t淋巴细胞。

本发明提供了人参二醇在制备抑制裸鼠移植瘤体积的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的天然小分子化合物人参二醇不但可以抑制pd-l1蛋白表达水平，阻断pd-1/pd-l1信号通路，恢复t细胞活力，同时亦能抑制肿瘤细胞增殖；本发明提供的人参二醇能够作为一种新型小分子药物应用于结肠癌治疗。

根据实施例的记载，人参二醇能够剂量性地抑制pd-l1蛋白的表达，剂量性地抑制pd-l1的rna转录水平；能剂量性地抑制pd-l1阳性细胞率。本发明提供的人参二醇还能剂量性地抑制缺氧诱导的肿瘤增殖相关蛋白cyclind1，c-myc和vegf的表达；剂量性地减少edu阳性细胞数，抑制肿瘤细胞增殖，人参二醇能够显著提高共培养体系中t细胞的活力；人参二醇还能有效地抑制裸鼠移植瘤的体积，并对裸鼠体重无明显影响。

附图说明

图1显示用westernblot法证实人参二醇以剂量依赖性方式抑制三种人结肠癌细胞系中pd-l1蛋白表达；

图2显示用pcr法证实人参二醇以剂量依赖性方式抑制三种人结肠癌细胞系中pd-l1的rna转录；

图3显示用流式细胞术证实人参二醇能够有效抑制肿瘤细胞表面pd-l1阳性率；

图4显示用elisa证实人参二醇能够恢复被肿瘤pd-l1通路抑制的t细胞活力；

图5显示用westernblot法证实人参二醇以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞中增殖相关蛋白表达；

图6显示用edu法证实人参二醇抑制肿瘤细胞增殖能力；

图7显示用集落形成实验证实人参二醇抑制肿瘤细胞增殖能力；

图8显示用裸鼠移植瘤实验证实人参二醇能抑制裸鼠移植瘤体积；

图9为裸鼠移植瘤体积实拍图。

具体实施方式

本发明提供了人参二醇在制备抑制pd-l1蛋白表达的药物中的应用、人参二醇在制备抑制pd-l1基因转录的药物中的应用。

在本发明中，所述人参二醇能够剂量性抑制pd-l1基因的转录和pd-l1蛋白表达；优选的能够抑制三种稳定的人结肠癌细胞株hct116，sw620和ht29中的pd-l1基因的转录和pd-l1蛋白表达；并且能够剂量性地抑制pd-l1阳性细胞率；所述人参二醇能够作为抑制结肠癌中pd-l1基因的转录和pd-l1蛋白表达的药物，进而能够作为抑制结肠癌的药物。本发明对所述药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用本领域常规的剂型和辅料即可。

本发明还提供了人参二醇在制备抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞增殖蛋白表达的药物中的应用。在本发明中所述肿瘤细胞增殖蛋白优选的包括cyclind1，c-myc和vegf；所述人参二醇能够能剂量性地抑制蛋白cyclind1，c-myc和vegf的表达。本发明对所述药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用本领域常规的剂型和辅料即可。

本发明还提供了人参二醇在制备增强细胞毒性t淋巴细胞活力的药物中的应用。在本发明中，所述细胞毒性t淋巴细胞优选为被肿瘤pd-l1通路抑制的细胞毒性t淋巴细胞；所述人参二醇能够显著提高肿瘤细胞/t细胞共培养体系中t细胞的活力。本发明对所述药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用本领域常规的剂型和辅料即可。

本发明还提供了人参二醇在制备抑制裸鼠移植瘤体积的药物中的应用。在本发明中，所述能有效地抑制裸鼠移植瘤的体积，对裸鼠体重无明显影响。本发明对所述药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用本领域常规的剂型和辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

细胞培养技术

选用三种稳定的人结肠癌细胞株hct116，sw620，ht29细胞(购于美国菌种保藏中心atcc)进行培养，待细胞进入对数生长期后，用0.25％胰酶消化，按细胞数5×10⁴密度平均分入6个直径为6cm细胞培养皿中，每个培养皿加入3mlrpmi-1640培养基(含已灭活的10％小牛血清，100u/l青-链霉素)放入恒温培养箱(37℃，5％co2，正常氧浓度和饱和湿度)中培养，缺氧环境由缺氧培养箱(1％o2，94％n2，5％co2)模拟。待细胞完全贴壁后，将细胞分为对照组、药物浓度梯度组(人参二醇的作用剂量分别为1μm、3μm、10μm)，培养12h待用。

蛋白免疫印迹法

(1)蛋白样品的制备：收集对照组和人参二醇处理组(作用剂量分别为1μm、3μm、10μm)细胞，用总蛋白细胞裂解液(购于美国thermofisherscientific)裂解细胞提取总蛋白。

(2)蛋白变性：取样本蛋白15μl分别加入相应的离心管中，加入5μl上样缓冲液，煮沸5min。

(3)将煮沸后的蛋白样品放置sds-page凝胶上电泳。

(4)待电泳停止，将凝胶上的蛋白样品转印至甲醇浸泡的pvdf膜上。

(5)将pvdf膜放入5％脱脂牛奶中室温封闭1h。

(6)一抗杂交：按1:1000的比例用pbs-t20配制一抗，与转印好的pvdf膜共同4℃孵育12小时，之后在pbs-t20中洗涤15min。

(7)二抗杂交：按1:2000的比例配制与一抗相对应的二抗，室温孵育1小时，之后在pbs-t20中洗涤15min。

(8)ecl发光试剂盒(美国millipore)检测。

pd-l1抗体购于美国novusbiologicals，cyclind1，c-myc，vegf和tubulin抗体购于美国santacruzbiotechnology。

实验结果如图1和图5所示，结果表明，人参二醇能够剂量性地抑制pd-l1蛋白的表达，并能剂量性地抑制缺氧诱导的肿瘤增殖相关蛋白cyclind1，c-myc和vegf的表达。

实施例2

pcr法测定人参二醇对pd-l1基因转录的影响

(1)总rna提取：

将对照组和人参二醇处理组(作用剂量分别为1μm、3μm、10μm)细胞用pbs缓冲液清洗三次，加入1mlttizol反复吹打，使其全部裂解。加入200μlccl4使溶液分层，离心(4℃；12000rpm；15min)。取上层至新的离心管中，加入500μl异丙醇，混匀，离心(4℃；12000rpm；10min)。小心弃去上清液，在含rna的离心管中加入1ml75％乙醇，振荡，离心(4℃；12000rpm；5min)。弃去上清液，放置超净台通风干燥。待彻底干燥后，加入30μldepc-ddw，使之完全溶解。

(2)以rna为模板逆转录合成cdna。

体系如下：

rt-pcr反应条件：

42℃20min

99℃5min；

1个循环

(3)pcr反应：由cdna合成双链dna。

体系如下：

pcr反应程序：

上述pcr条件94℃30s、58℃30s、72℃30s为30～40循环，pd-l1：38循环，引物序列：5′-catcagctatttgcgtgtgagga-3′(正)，5′-agcaattcatctgtgctttcatgtc-3′(反)，gapdh：30循环，引物序列：5′-accacagtccatgccatcac-3′(正)，5′-tccaccccctgttgctgta-3′(反).。

实验结果如图2所示，结果表明人参二醇能剂量性地抑制pd-l1的rna转录水平。

实施例3

流式细胞术表面染色法测定人参二醇对人结肠癌细胞中pd-l1阳性细胞率的影响

(1)取生长对数期的细胞，接种6cm培养皿中。

(2)待细胞生长至50-80％时，收集细胞，混匀在pbs缓冲液，收集到1.5ml离心管中。

(3)离心(4℃；1000rpm；5min)，用pbs缓冲液将细胞重新悬浮至浓度为1×10⁶个/ml。

(4)每个样本加入1μlpd-l1抗体(美国novusbiologicals)，冰上避光孵育1h。

(5)离心(4℃；1000rpm；5min)并弃去上清液，重新加入1mlpbs缓冲液混匀。

(6)重复(5)。

(7)加入荧光二抗，冰上避光孵育15min。

(8)离心(4℃；1000rpm；5min)，pbs缓冲液洗涤细胞两次后，重新悬浮在500μl的pbs缓冲液里，用流式细胞仪进行分析。

结果如图3所示，结果表明人参二醇能剂量性地抑制pd-l1阳性细胞率。

实施例4

elisa实验检测人参二醇对t细胞活性的影响

以下操作均遵照elisa试剂盒中提供的说明书步骤进行，tnf-α试剂盒和ifn-γ试剂盒均购于上海酶联生物科技有限公司。

(1)将试剂盒在室温下平衡半小时。

(2)分别取50μl的标准品，样品加入特定的孔中，室温下孵育1h。

(3)清洗：弃去上清液，用300μl的洗涤液清洗五次；最后一次清洗完毕后，将96孔板倒置于滤纸上以除去残留的液体。

(4)于各孔内加入生物素抗原工作液50μl，轻轻摇晃混匀，室温下孵育1h。

(5)清洗：弃去上清液，用300μl的洗涤液清洗五次；最后一次清洗完毕后，将96孔板倒置于滤纸上以除去残留的液体。

(6)于各孔内加入亲和素-hrp50μl，轻轻摇晃混匀，室温下避光孵育15min。

(7)每孔加入50μl终止液终止反应，在30min内用酶标仪于450nm处检测吸光度。

结果如图4所示，结果表明人参二醇能够显著提高共培养体系中t细胞的活力。

实施例5

edu细胞增殖检测法

以下操作均遵照edu细胞增殖试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)中提供的说明书步骤进行

(1)取对数生长期的细胞均匀分到96孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度药物处理12h

(2)取细胞培养基按3000：1的比例稀释edu溶液，每孔加入稀释的100μledu溶液，孵育6h。

(3)弃去培养基，pbs缓冲液清洗细胞2次，每次5min。

(4)每孔加入50μl4％的多聚甲醛，室温培养30min，弃去多聚甲醛。

(5)每孔加入50μl2mg/ml的甘氨酸，在摇床上孵育5min，弃去甘氨酸。

(6)每孔加入100μl的pbs缓冲液，摇床清洗细胞5min，弃去pbs缓冲液。

(7)每孔加入100μl0.5％triton-100，在摇床上透化细胞10min。

(8)每孔加入10μl的pbs缓冲液，摇床清洗细胞5min，弃去pbs缓冲液。

(9)每孔加入100μlapollo染色液，在摇床上室温避光孵育30min，弃去染色液。

(10)用三蒸水按100:1比例稀释hoechst33342反应液。每孔加入100μlhoechst33342反应液，在摇床上室温避光孵育30min，弃去反应液。

(11)每孔加入100μl的pbs缓冲液清洗细胞3次，每次2min，用荧光荧光显微镜拍照。

结果如图6所示，结果表明人参二醇能剂量性地减少edu阳性细胞数，抑制肿瘤细胞增殖。

实施例6

细胞集落形成试验

(1)取对数生长期细胞微量均匀分到6孔板中。

(2)细胞贴壁后，在显微镜下时时观察，待到细胞出现小集落时，用不同浓度人参二醇(0μm、1μm、3μm、10μm)处理12h后更换培养基继续培养，定期观察细胞更换培养基。

(3)待集落数目和大小都显著增大时进行结晶紫染色。

(4)弃去培养基，1ml的pbs缓冲液清洗三次，清洗后用10％甲醛(500μl)固定5min。固定后，用500μl，1％的结晶紫染色30s，吸掉结晶紫后用1ml的pbs缓冲液洗三次除去多余染料。

(5)风干，拍照保存。

实验结果如图7所示，结果表明随着人参二醇浓度上升，肿瘤细胞集落大小和数量均受到抑制。

实施例7

裸鼠移植瘤实验

(1)取15只4-5周龄，18-22g裸鼠(购于北京华阜康生物科技股份有限公司)，随机分成三组，每组5只，适应性喂养一周后，进行裸鼠皮下肿瘤移植。

(2)用生理盐水收集细胞，重悬至1×10⁸个/ml，用注射器将200μl细胞悬液注射到小鼠皮下。

(3)待实体瘤形成，进行灌胃给药，共给药30天，每3天称量小鼠体重，用游标卡尺测量肿瘤大小，通过公式体积＝(长度×(宽度)²)/2计算出裸鼠肿瘤的体积。

结果如图8和图9所示，结果表明人参二醇能有效地抑制裸鼠移植瘤的体积，对裸鼠体重无明显影响。

由上述实施例可知，人参二醇能够剂量性地抑制pd-l1蛋白的表达，pd-l1的rna转录水平、pd-l1阳性细胞率；还能剂量性地抑制缺氧诱导的肿瘤增殖相关蛋白cyclind1，c-myc和vegf的表达；剂量性地减少edu阳性细胞数，抑制肿瘤细胞增殖；能够显著提高共培养体系中t细胞的活力；有效地抑制裸鼠移植瘤的体积；由此可见，人参二醇作为抑制结肠癌的药物，具有显著的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。