促进毛发生长的组合物及其使用方法与流程

本发明涉及一种生发组合物，具体涉及一种促进毛发生长的组合物及其使用方法。

背景技术：

目前防脱生发的方法很多：

(1)手术类：毛发移植技术。毛发外科移植技术起源于19世纪20年代。其中已经广泛应用的植发技术主要有三种，即头皮缩减术、头皮自体移植术以及毛囊单位移植技术。毛发外科移植技术一般可从本体切取，排异性较少，但如果患者受区面积较大，植发时间久，对于消费者和医生都需要体力和耐力的考验，还有植发后激活毛囊也是一大难题。

(2)干细胞防脱生发。专利cnl06635973a公开了“一种促进毛发再生的细胞营养液的制备方法”。采用成纤维细胞的条件培养液(fibroblastconditionedmedium，fb-cm)培养脂肪间充质干细胞(adipose-de-rivedstemcells，adscs)，收集细胞培养上清制备而成的。adscs条件培养液在毛囊周期性重建过程中，能激活毛囊干细胞微环境，调控毛囊正常生长，促进毛发再生。而且制备细胞营养液的细胞可取材于临床抽脂后的脂肪废弃物及其他外科手术切除的皮片，来源广泛，便于临床推广。对于此种方法，就抽脂本身而言，危险性要高于血液采集，来源也没有血液方便。如果没有抽脂或做其他外科手术，就影响到产品的原料来源。

(3)寡肽、多肽及角蛋白防脱生发。专利cn200410051990.8公开的“生物角蛋白在制药中的应用”涉及到在制备生发护发的药物中的应用，其生发液的基本成分是由天然生物材料角蛋白，经过一系列化学处理成含药用功能蛋白、功能肽类物质和19种氨基酸。其生发液能为头发生长提供营养，诱导、促进蛋白合成和分泌，调节细胞角化速度和扩张表皮毛细血管，促进血液循环，激活毛母质细胞，缩短毛发异常休止期，有效抑制皮脂腺的分泌，改善毛囊生理功能从而达到防治脱发和促进毛发生长的效果。

(4)中医防脱生发，涉及内治、外治、针灸治疗、按摩治疗、刮痧治疗等。中药有以当归、熟地黄、丹参、白芍、川芎、黄芪、牡丹皮、赤芍、红花、桑椹等补血活血化瘀；以何首乌、菟丝子、枸杞、女贞子、墨旱莲等补肝益肾填精；以茯苓、甘草、党参、泽泻等健脾渗湿等。

(5)化学制剂防脱生发常见的化学防脱生发制剂有米诺地尔、非那雄胺、维a酸类等。虽然化学合成生发剂促进生发的作用较为明显，但其副作用大。

脱发的机制是多方面、多层次、多维度且极度复杂的，如果能使用一种有效生发组合物及使用方法，从根本上、源头上解决生发问题，持续促进毛发再生，就能给大多数求美者带来福音，增强信心。

综上所述，亟需一种非手术安全有效的生发组合物，从细胞学、生物技术角度出发，提供生长因子、营养液、免疫细胞，改善头皮微环境，激活毛囊干细胞及毛母质细胞，缩短毛发异常休止期，有效抑制皮脂腺的分泌，改善毛囊生理功能，速效、中效、长效促进毛发持续再生。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种促进毛发生长的组合物及其使用方法，克服现有技术的缺陷。

本发明所采用的技术方案为：

促进毛发生长的组合物，其特征在于：

所述组合物包括冻干的富血小板血浆。

所述组合物还包括自体血清、免疫细胞、血管基质组分中的一种或多种。

所述组合物还包括生发营养液、生理盐水中的一种或多种。

冻干的富血小板血浆含血小板浓度为10亿/ml。

自体血清是制备冻干的富血小板血浆后剩下的所有血液组分，通过离心、灭活得到的。

免疫细胞的获得过程为：

将制备冻干的富血小板血浆后剩下的血液组分进一步分离获得人外周血单个核细胞，放置于含有活化细胞因子的细胞培养基中进行诱导培养；离心收集细胞,用新鲜含有活化细胞因子溶液的细胞培养基重悬细胞,继续培养；每24-48h进行一次换液，然后收集细胞。

血管基质组分的获得过程为：

取废弃脂肪或者皮片，采用酶消化法及差速离心方法分离得到基质血管分离段，收集细胞。

生发营养液中包含有侧柏叶提取液、首乌提取液、当归提取液及维生素。

促进毛发生长的组合物的使用方法，其特征在于：

所述使用方法为注射方式。

所述使用方法为注射结合激光光疗、喷涂生发营养液以及口服生乌胶囊中的一种或多种手段。

本发明具有以下优点：

本发明中冻干的富血小板血浆fdp-2b制剂中含有多种高浓度的生长因子，由于制剂来源于自体全血，各生长因子的比例和体内正常比例几乎一致，使生长因子之间有最佳的协同作用，并且不会出现外源性生长因子的免疫排斥，也不会出现异体移植中存在的疾病传播的风险。含有的大量的细胞粘合蛋白、纤维素、纤粘连蛋白和亲玻粘连蛋白，为皮肤修护提供了良好的3d立体支架结构。

自体血清，能够提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白。有免疫，维持酸碱平衡和渗透压的作用。含有多种化学成分，包括白蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白,甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶等。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。提供激素：胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。提供各种生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

免疫细胞能够吞噬代谢产物,并能够分泌丰富的白细胞介素、转化生长因子及各类生长因子等,包括tgf-β、egf、fgf、il-2等,能够促进细胞和组织的修复,能够改善头皮的微环境，进而改善头皮的菌群分布，促进头皮健康。

血管基质组分svf，svf中除了adscs外，还有脂肪前体细胞、成纤维细胞、周细胞、基质细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞等。具有局部抗炎、免疫调节等重要作用，能够从另外层面改善头皮微环境，促进头皮血管再生和改善头皮局部微循环。

生发营养液，作为溶媒溶解fdp-2b冻干粉，和自体血清一起重悬免疫细胞、svf。其中包含干细胞生长因子，它是一种具有刺激内源性干细胞生长的高效蛋白质、酶组合。脐带间充质干细胞在培养过程中可分泌表皮生长因子(egf)、纤维细胞生长因子(fgf)、神经生长因子(ngf)、肝细胞生长因子(hgf)、脑源性神经营养因子(bdnf)、血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子(tgf)等多种干细胞生长因子。这些干细胞因子能促进细胞更新、促进受损细胞组织愈合、增加细胞活力和头皮免疫力、促进毛发再生等。生发营养液中还包含中草药成分如侧柏叶提取液、首乌提取液、当归提取液。还包含维生素成分如生物素、维生素b12。

所述生发组合物是一种非手术安全有效的生发组合物，长期使用无明显副作用。综合了上述组分的优势，从细胞学、生物技术角度出发，提供生长因子、营养成分、免疫细胞等，改善头皮微环境，促进头皮局部微循环，激活毛囊干细胞及毛母质细胞，缩短毛发异常休止期，有效抑制皮脂腺的分泌，改善毛囊生理功能，速效、中效、长效促进毛发持续再生。

本发明还提供了组合物的使用方法，一般直接注射，或者结合生发激光一起使用，或者注射结合生发营养液喷涂使用。另外根据求美者的具体情况，口服生乌胶囊。这样可以多角度、多层次，结合中西方多手段，外喷/外涂加上口服方法，促进毛发再生。

附图说明

图1为不同储存时间，储存温度为4-8℃下fdp-2b中fgf、egf、pdgf三种生长因子浓度的比较。

图2为不同储存时间，储存温度为-20℃、-80℃下fdp-2b中pdgf浓度的比较。

图3为不同储存时间，储存温度为-20℃、-80℃下fdp-2b中egf浓度的比较。

图4为不同储存时间，储存温度为-20℃、-80℃下fdp-2b中fgf浓度的比较。

图5为传统培养液与添加储存了3个月的fdp-2b培养液培养干细胞对比图。

图6为传统培养液与添加储存了12个月的fdp-2b培养液培养干细胞对比图。

图7为用传统的新鲜富血小板血浆prp与冻干的富血小板血浆fdp-2b分别培养干细胞的生长曲线对比图。

图8为刚分离得到的外周血单个核细胞pbmc。(a为细胞放大200倍的照片，b为细胞放大400倍的照片)

图9为培养16天的免疫细胞形态。(a为细胞放大200倍的照片，b为细胞放大400倍的照片)

图10为免疫细胞生长曲线。

图11为实施例1注射前、注射后3个月毛发镜的图片。

图12为实施例1注射前、注射后3个月的毛发图片。

图13为实施例2注射前、注射后3个月的毛发图片。

图14为实施例3注射前、注射后2个月的毛发图片。

图15为实施例4注射前、注射后2个月的毛发图片。

图16为实施例5注射前、注射后2个月的毛发图片。

图17为实施例6注射前、注射后2个月的毛发图片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一种促进毛发生长的组合物，能够改善头皮微环境，激活毛囊干细胞及毛母质细胞，缩短毛发异常休止期，有效抑制皮脂腺的分泌，改善毛囊生理功能，速效、中效、长效促进毛发持续再生。所述组合物包括冻干的富血小板血浆(fdp-2b)，冻干的富血小板血浆含血小板浓度为10亿/ml。

所述组合物还包括自体血清、免疫细胞、血管基质组分(svf)中的一种或多种。所述组合物还包括生发营养液、生理盐水(0.9％的氯化钠注射液)中的一种或多种。

其中：

自体血清是制备冻干的富血小板血浆后剩下的所有血液组分，通过离心、灭活得到的。

免疫细胞的获得过程为：

将制备冻干的富血小板血浆后剩下的血液组分进一步分离获得人外周血单个核细胞，放置于含有活化细胞因子的细胞培养基中进行诱导培养；离心收集细胞,用新鲜含有活化细胞因子溶液的细胞培养基重悬细胞,继续培养；每24-48h进行一次换液，然后收集细胞。

血管基质组分的获得过程为：

取废弃脂肪或者皮片，采用酶消化法及差速离心方法分离得到基质血管分离段，收集细胞。

生发营养液中包含有侧柏叶提取液、首乌提取液、当归提取液及维生素。混合比例为侧柏叶提取液30份，首乌提取液10份，当归提取液10份，生物素0.0004份，维生素b120.0004份，其余是滤后营养液49.9992份。

具体制备步骤包括：

步骤1、参考专利cn110251533a的制备方法，制备得到fdp-2b冻干粉；

步骤2、制备fdp-2b后剩下的所有血液组分，通过离心、灭活，得到自体血清，放置到-20℃备用；

步骤3、制备fdp-2b后剩下的血液组分进一步制备分离获得pbmc，即人外周血单个核细胞，用以制备免疫细胞；

步骤4、将分离的pbmc放置于含有活化细胞因子的细胞培养基中进行诱导培养；

步骤5、培养12-36h,离心收集细胞,用新鲜含有活化细胞因子溶液的细胞培养基重悬细胞,继续培养；

步骤6、继续培养至120-600h,其中根据细胞的生长状态，每24-48h进行一次换液，然后收集细胞，备用；

步骤7、取外科手术废弃脂肪，采用酶消化法及差速离心方法分离得到基质血管分离段，收集细胞备用。

步骤8、取冻存的uc-mscp4-p5代细胞，复苏，用新鲜培养基培养36-48h。当细胞融合达到70％时，更换无酚红的培养基，再继续培养24h。离心，收集培养液，0.22μml滤膜过滤得到滤后培养液，侧柏叶提取液是30份，首乌提取液是10份，当归提取液是10份，生物素是0.0004份，维生素b12是0.0004份，其余是滤后营养液49.9992份；

上述步骤1具体为：采集自体外周静脉血，2300rpm，20℃离心3min；3900rpm,20℃离心4min；血小板计数，使终浓度达到10亿/ml,每支fdp-2b血小板含量为20亿/ml。

上述步骤2具体为：将制备fdp-2b剩下的所有血液组分，放置于离心管中，2800rpm离心10min。取上层血清至新的50ml离心管中，4℃冰箱15min，接着放置于56℃水浴锅中灭活30min；3500rpm离心10min，转移上层血清至新的离心管中，得到自体血清，-20℃备用。

上述步骤3具体为：用生理盐水将制备fdp-2b后剩下的血样重悬至原体积。取50ml离心管，每管加入20ml淋巴细胞分离液；将血样1:1缓慢叠加于淋巴细胞分离液上；2000rpm，离心20min,慢升慢降；吸取白膜层至新的离心管，补充生理盐水充分稀释重悬。1500rpm,离心10min；弃上清，加生理盐水，1200rpm，离心10min,弃上清，即得到pbmc。

上述步骤7具体为：取废弃脂肪或者皮片,加入脂肪量或皮片量等体积的浓度为0.25％的ⅰ型胶原酶溶液，37℃、100-200r/min,震荡消化90-120min；400g离心5-10min；弃上清，加生理盐水,400g离心5-10min,收集沉淀,所得即为svf。

上述促进毛发生长的组合物的使用方法为注射方式，也可结合激光光疗、喷涂生发营养液以及口服生乌胶囊中的一种或多种手段。

以下为本发明组合物的配伍实施例：

表1组合物实施例

对于组分a冻干的富血小板血浆fdp-2b，有研究如下：

选取8名年龄在20-50岁健康志愿者的外周血来制备新鲜富血小板血浆prp(2b)和冻干的富血小板血浆fdp-2b，确保每支血小板数量达到20亿个单位。将每位志愿者新鲜的富血小板血浆其中的1支用于检测fgf、egf、pdgf三种生长因子原始含量，其他的则被制成冻干粉即fdp-2b，分别放在4-8℃、-20℃、-80℃储存10天、1个月、3个月、6个月、1年的时间。

由图1-图4，我们可以清楚地观察到，与新鲜的富血小板相比，冻干的富血小板血浆fdp-2b每种生长因子都有显著的增加(p<0.05)。结果表明，冷冻干燥是一种有效保存血小板生物活性的方法，不需要任何的化学激活剂就能自然激活其中的生长因子。此外，他们在cgmp实验室中制备该产品fdp-2b，同时考虑了细菌和真菌培养试验以及每个志愿者的血清学试验，以提高产品的安全性并确保其不受污染。此外，与-80℃相比，3种生长因子在冻干后1个月、3个月、6个月和1年的-20℃贮藏温度下均表现出稳定而不降解的特性。与新鲜的富血小板血浆相比，此冻干过程使血小板破裂，释放出更多的生长因子。

其次，如图5，图6所示，我们分别使用储存了3个月、12个月的fdp-2b去培养干细胞，与传统的培养液相比，干细胞生长的数量明显增加；活力明显增强，增长速率明显变快。

再次，如图7所示，与传统的富血小板血浆prp相比，用冻干的富血小板血浆fdp-2b去培养干细胞，能获得显著增加的细胞增长率和近3倍的细胞总量。

对于组分c免疫细胞，有研究如下：

如图8所示，刚分离出来的pbmc，镜下可见少量血小板及红细胞。

由图9看出，培养16天后免疫细胞增殖迅速，形态圆润，边缘清晰，透光度好。

图10所示，免疫细胞在第10天左右进入对数生长期。经过26天的培养，免疫细胞总数由原来的3.2*10^7增殖为5.06*10^9，细胞扩增158倍。免疫细胞培养第23天时，总数达到峰值，之后细胞数量有所下降，说明细胞增殖的速度小于细胞死亡的速度。

实施例1：

用5ml生理盐水溶解fdp-2b，制成生发组合物a。使用方法如下：首先对待促进毛发生长部位进行消毒，然后皮下注射fdp-2b，每针间隔0.5cm，形成均匀小皮丘为佳。每个月注射1次，每次1支fdp-2b。

实施例1，其注射前、注射后3个月的对比图。图11a、图11b分别是注射前、注射后3个月毛发镜的图片。由图可以看出，新发(黑发)显著增生，旧发的发株变粗。图12a、图12b分别是注射前、注射后3个月的毛发图片。由对比图可以看出白发比例减少，待促进毛发生长部位新生头发显著增多。

实施例2：

生发组合物a使用方法如下：首先对待促进毛发生长部位进行消毒，然后皮下注射fdp-2b，每针间隔0.5cm，形成均匀小皮丘为佳。fdp-2b注射后即刻进行半导体生发激光照射15min，每天1次，连续1周，第2周开始半导体生发激光间隔1天进行照射。fdp-2b每个月1次，每次1支，半导体生发激光照射周期为1个月两周。图13a、图13b分别是注射前、注射后3个月的毛发图片。由对比图可以看出待促进毛发生长部位新生头发显著大幅增多，发株变粗。

实施例3：

生发组合物a使用方法如下：首先对待促进毛发生长部位进行消毒，然后皮下注射fdp-2b，每针间隔0.5cm，形成均匀小皮丘为佳。配合口服生乌胶囊使用。图14a、图14b分别是注射前、注射后2个月的图片。由对比图可以看出待促进毛发生长部位白发转黑，发株变粗。

实施例4：

生发组合物a使用方法如下：首先对待促进毛发生长部位进行消毒，然后皮下注射fdp-2b，每针间隔0.5cm，形成均匀小皮丘为佳。fdp-2b注射后即刻进行半导体生发激光照射15min，每天1次，连续1周，第2周开始半导体生发激光间隔1天进行照射。fdp-2b每个月1次，每次1支，半导体生发激光照射周期为1个月两周。配合口服生乌胶囊使用。图15a、图15b分别是注射前、注射后2个月的图片。由对比图可以看出待促进毛发生长区域面积减小，新发增生显著。

实施例5：

用5ml生发营养液溶解fdp-2b，制成生发组合物b。使用方法如下：首先对待促进毛发生长部位进行消毒，然后皮下注射fdp-2b，每针间隔0.5cm，形成均匀小皮丘为佳。每个月注射1次，每次1支fdp-2b。图16a、图16b分别是注射前、注射后2个月的图片。由对比图可以看出，待促进毛发生长部位新生头发明显增多，待促区域面积减少。

实施例6：

生发组合物b的使用方法如下：首先对待促进毛发生长部位进行消毒，然后皮下注射fdp-2b，每针间隔0.5cm，形成均匀小皮丘为佳。每个月注射1次，每次1支fdp-2b。并将生发营养液e另制成喷雾剂，每天早晚各一次喷涂于待促进毛发生长部位。图17a、图17b分别是注射前、注射后2个月的图片。由对比图可以看出，待促进毛发生长部位新生头发明显增多，待促区域面积显著减少，发株变粗。

表2实例7-56的生发组合物组分、使用方法及生发效果

表2结果显示，单以疗效而言，包含全部组分的生发组合物(包含冻干的富血小板血浆fdp-2b、自体血清、免疫细胞、血管基质组分svf、生发营养液)与包含部分组分的生发组合物，在效果方面均表现优异。除fdp-2b以外的其他组分能在其他方面促进使用效果，如自体血清能提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。免疫细胞能够吞噬代谢产物，并能够分泌丰富的白细胞介素、转化生长因子及各类生长因子等，能够促进细胞和组织的修复，能够改善头皮的微环境，进而改善头皮的菌群分布，促进头皮健康。血管基质组分svf具有局部抗炎、免疫调节等重要作用，能够从另外层面改善头皮微环境，促进头皮血管再生和改善头皮局部微循环。生发营养液中含有的多种干细胞因子能够通过旁分泌作用促进细胞增殖、分化；生发营养液中含有的侧柏叶提取液、首乌提取液、当归提取液及维生素，有补血活血化瘀、补肝益肾填精、健脾渗湿等作用。这些组分从不同的角度、不同的层次、不同的维度起到了对头皮、头发再生协同增效作用，可以说是强强联合。

此外，就使用方式而言，注射联合激光联合喷雾联合口服，是一种全方位、中西医结合的方法，效果更佳稳定明显；激光第一周连续7天进行，第二周间隔1天进行；喷雾每天喷涂。

表3：实施例57-62的生发组合物组分、使用方法及生发效果

表3显示，生发组合物中不含冻干的富血小板血浆fdp-2b，短时间的生发效果不明显。考虑其来源及操作可实现性、简便性而言，生发组合物中含冻干的富血小板血浆fdp-2b无疑是最佳选择。

本发明涉及一种生发组合物，包含冻干的富血小板血浆fdp-2b、自体血清、免疫细胞、血管基质组分svf、生发营养液、生理盐水。冻干的富血小板血浆fdp-2b富含多种生长因子：如血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf-β)、胰岛素样生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血管内皮生长因子(vegf)等。它并且还含在三种蛋白质：纤维素、纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白，为头皮的修护提供了良好的3d立体结构支架。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。免疫细胞能够吞噬代谢产物,并能够分泌丰富的白细胞介素、转化生长因子及各类生长因子等,包括tgf-β、egf、fgf、il-2等,能够促进细胞和组织的修复,能够改善头皮的微环境，进而改善头皮的菌群分布，促进头皮健康。血管基质组分svf具有局部抗炎、免疫调节等重要作用，能够从另外层面改善头皮微环境，促进头皮血管再生和改善头皮局部微循环。生发营养液中包含干细胞生长因子，干细胞因子是一种具有刺激内源性干细胞生长的高效蛋白质、酶组合。所有组分能够起到很好的协同增效作用。

本发明涉及使用方法可以是单独注射、离子导入、电导，也可以注射联合激光，注射联合喷雾、注射联合口服药物、注射联合激光和喷雾、注射联合激光和喷雾和口服药物。

本发明包含一种非手术安全有效的生发组合物，长期使用无明显副作用。还包含生发组合物的使用方法。从细胞学、生物技术角度出发，提供生长因子、营养成分、免疫细胞等，多角度、多层次、多维度地改善头皮微环境，促进头皮局部微循环，激活毛囊干细胞及毛母质细胞，缩短毛发异常休止期，有效抑制皮脂腺的分泌，改善毛囊生理功能，速效、中效、长效促进毛发持续再生。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。