本发明涉及组织工程皮肤
技术领域：
：，具体地说，是一种促进创面愈合的具有双层结构的组织工程皮肤及其制备方法。
背景技术：
：：皮肤是人体面积最大的器官，是覆盖于体表的重要组织。皮肤不仅具备感觉、分泌、排汗、呼吸等功能，也是人体与外界环境接触的重要屏障。皮肤软组织缺损极易引发感染，如治疗不及时会逐渐发展加重，甚至导致区域性坏死。在当前临床上，为了治疗皮肤损伤，通常需要取得身体健康部位的皮肤移植到患处，这种方法不仅来源有限、移植存活率低下，在治疗过程中还会在供皮区域产生新的创伤。因此，解决创面难愈问题显得尤为重要和紧迫，探寻一种有效的治疗皮肤缺损伴感染的新方法具有非常重要的意义。随着组织工程学的兴起和蓬勃发展，皮肤缺损的治疗有了新的方向，组织工程学的研究主要包括三个方面的内容：种子细胞、生物支架材料和再生微环境调控。因为组织工程皮肤不仅提供了创面修复所需的细胞及细胞外基质，而且可以通过支架负载并释放生长因子调控创面微环境，促进创面愈合，所以有利于感染性创面的修复。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，利用组织工程和仿生学等相关原理，构建一种能够促进创面愈合的组织工程皮肤及其制备方法。本发明制备的具有双层结构的组织工程皮肤用于修补缺损皮肤、促进创面愈合，所述的组织工程皮肤包含：组织工程化表皮支架(模拟皮肤表皮层的光交联支架)、组织工程化真皮支架(模拟皮肤真皮层的凝胶支架)、和创面修复所需的种子细胞；构建组织工程化表皮支架的主要成分为甲基丙烯酸甲酯修饰的聚乙烯醇(pva-gma)和邻硝基苄基类光扳机分子(nb)修饰的透明质酸(ha-nb)；构建组织工程化真皮支架的主要成分为甲基丙烯酸甲酯修饰的明胶(gelma)；所述的种子细胞选择slit2转染的脂肪间充质干细胞(adscs)。用于构建组织工程化表皮支架的pva-gma/ha-nb，光照后pva-gma上的双键在引发剂的作用下被打断，并迅速与附近其他pva-gma上断裂的双键发生化学键合，形成第一层网络；ha-nb接收光子能量产生的醛基与pva-gma上的羟基反应交联，形成第二层网络，从而极大增强了胶体的力学。胶体与人体皮肤缺损组织接面处，ha-nb的光生醛基还能与组织上的氨基反应，增强胶体在湿面组织上的粘附力，无需缝合即可实现快速止血。用于构建组织工程化真皮支架的gelma是一种光敏生物水凝胶，可在可见光或紫外光下快速固化，无细胞毒性、易降解，降解产物为氨基酸和糖类，且具有适宜细胞生长的三维多孔结构，各孔之间相互贯通，有利于支架上细胞的营养和代谢。组织工程化真皮内引入的细胞选择slit2转染的adscs，通过调控adscs及其slit2表达，可介导创面内slit2-robo信号，进而调控下游vegfr-erk1/2成血管信号通路，维持血管稳定和抗凋亡，加速血管和表皮形成，促进创面愈合。本发明的第一方面，提供一种促进创面愈合的组织工程皮肤的制备方法，所述的组织工程皮肤包括：采用pva-gma/ha-nb构建的组织工程化表皮支架，采用gelma构建的组织工程化真皮支架，采用slit2转染的adscs作为组织工程化皮肤的种子细胞；其制备方法包含以下步骤：步骤s1，制备模拟皮肤表皮层的pva-gma/ha-nb复合凝胶前驱体；步骤s2，制备模拟皮肤真皮层的gelma凝胶前驱体；步骤s3，将slit2转染的adscs重悬后加入s2所得的gelma凝胶前驱体溶液，光交联固化后获得组织工程化真皮组织；步骤s4，将s1中的pva-gma/ha-nb复合凝胶前驱体覆于s3中的组织工程化真皮组织表面，光交联固化后获得具有双层结构的仿生智能组织工程皮肤。进一步的，所述的步骤s1中具体包含以下步骤：(a)将pva溶解在二甲基亚砜(dmso)中；加入gma和dma，溶解后提纯、干燥；(b)以pbs作为溶剂，依次加入质量分数为12.5％～20％的pva-gma和质量分数为3.25％～4.5％的ha-nb，低速搅拌10min～30min，添加0.225wt％～0.35wt％的光引发剂darocur2959(d-2959)到混合溶液中后避光保存。在本发明的一个优选的实施方式中，所述的步骤(a)中，将5.0gpva溶解在100mldmso中；加入0.025mol％gma和1.0mol％dma，60℃搅拌6h后，将混合物在丙酮中沉淀，真空干燥2天后获得pva-gma。在本发明的一个优选的实施方式中，所述的步骤(b)中，以pbs作为溶剂，依次加入质量分数为15％的pva-gma、质量分数为3.75％的ha-nb，低速搅拌10min，将d-2959以0.3wt％的浓度添加到混合溶液中。步骤(2)中的ha-nb获批准后取自上海某高校化学与分子工程学院，具体制备方式可参考文献：yang,y.etal.tissue-integratableandbiocompatiblephotogelationbytheiminecrosslinkingreaction.adv.mater.28,2724–2730(2016).。进一步的，所述的步骤s2中，将gelma以5％～15％(优选5％)的质量分数加入由89％dmem+10％fbs+1％ps配制而成的细胞培养基中。进一步的，所述的步骤s2中，获得的gelma前驱体需在37℃无菌环境下避光保存。进一步的，所述的步骤s3中，slit2转染的adscs购于上海瑞赛(r&s)。将装载细胞的离心管从液氮中取出，37℃水浴1min快速化冻后，800rpm离心3min，去上清，加入1ml细胞培养基(89％dmem+10％fbs+1％ps)重悬；计数后，将细胞移至步骤s2的gelma凝胶前驱体中，405nm蓝光下5s固化成型。进一步的，所述的步骤s3中，加入步骤s2所得的gelma凝胶前驱体溶液中的adscs细胞密度约为5*105/ml。进一步的，所述的步骤s4中，pva-gma/ha-nb复合凝胶前驱体在蓝光405nm下8s固化成型，形成组织工程化表皮组织。进一步的，所述的步骤s4中，固化成型的组织工程化表皮组织的厚度为0.5mm～2.0mm(优选2.0mm)。本发明的第二方面，提供一种促进创面愈合的组织工程皮肤，所述的组织工程皮肤包括：采用pva-gma/ha-nb构建的组织工程化表皮支架，采用gelma构建的组织工程化真皮支架，采用slit2转染的adscs作为组织工程化皮肤的种子细胞。进一步的，所述的组织工程皮肤采用如上任一所述的制备方法制备得到。本发明的第三方面，提供一种如上所述的组织工程皮肤在构建促进创面愈合的仿生皮肤中的应用。和现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、组织工程化真皮选用的材料在固化后具有较强的湿面组织粘附力，能有效密封伤口，具备一定的止血功能；2、模拟皮肤真皮的支架采取光交联法成型，可固化成任意形状，实现与缺损组织的紧密贴合；3、本发明通过制备双层仿生皮肤组织工程支架，负载slit2转染的脂肪间充质干细胞，构建仿生皮肤，有助于维持血管稳定和抗凋亡，加速血管和表皮形成，从而促进难治性创面的愈合。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例1：步骤s1：组织工程化表皮(前驱体)的制备：(a)：将pva(5.0g)溶解在dmso(100ml)中。加入gma(0.025mol％)和dma(1.0mol％)，60℃搅拌6h后，将混合物在丙酮中沉淀，真空干燥2天后获得pva-gma；(b)：将步骤(a)中的pva-gma(15g)与ha-nb(3.75g)依次加入100mlpbs中，搅拌(200r/min)10分钟，将光引发剂darocur2959(d-2959，0.3g)加入上述混合溶液中后，避光保存；步骤s2：将gelma(1g)溶于20ml培养基中(89％dmem+10％fbs+1％ps)获得组织工程化真皮的前驱体，并置于37℃无菌环境下避光保存；步骤s3：将装载细胞(slit2转染的adscs)的离心管从液氮中取出，37℃水浴1min快速化冻后，800rpm离心3min，去上清，加入1ml细胞培养基(89％dmem+10％fbs+1％ps)重悬。计数后，将细胞(密度为5*105/ml)移至步骤s2获得的gelma前驱体中；步骤s4：将步骤s3中搭载了细胞的gelma前驱体填充新鲜的、已接受消毒皮肤缺损组织，405nm蓝光下5s固化后，将步骤s1中的表皮前驱体覆于皮肤创口表面，405nm蓝光下8s固化。上述实施例中，在皮肤表面形成的凝胶具备良好的力学和韧性，伤口封闭后凝胶表现出显著的止血效果，创面未发生继续渗血现象。一周后，创面愈合情况良好，三周后，创面基本愈合，实施过程中未观察到不良反应。实施例2：将实施例1的各个步骤应用到开放性骨折导致皮肤软组织缺损伴感染、已完成清创手术的部位，其余步骤与实施例1相同，一周后，创面处未观察到继发感染；三周后，缺损部位的皮肤组织生长状态良好。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。当前第1页12当前第1页12