一种调控基因、抗衰老、抗动脉硬化、治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病的药物的制作方法

本发明公开一种调控基因，抗衰老，抗动脉硬化，治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病的药物的制备方法。具体涉及从中药材，淫羊藿、西洋参(或西洋参茎叶)、益母草、提取有效活性成分(特征成分)及天然药物(酶制剂)菠萝蛋白酶，按有效成分配比加入菠萝蛋白酶配伍成复方制剂。
背景技术：
：随着人口老龄化的趋向，我国60岁以上的老年人已超过10％，发达城市如：上海，60岁以上的老年人已超过20％；人口老龄化与日俱增，因衰老而动脉粥样硬化引起的“冠心病、高血压、高血脂、糖尿病、中风等”亦日趋增多；防治老年病及延缓衰老已引起医学界重视。心、脑缺血在各国(包括我国)是猝死、突发心、脑血管意外(中风)致残、致废的主因。其发病率逐年上升，严重威胁着中、老年人健康。心肌缺血可引起大脑一系列变化，包括血流量、脑功能、脑血活动及至细胞内某些结构的改变。左心室梗塞可引起大脑颞叶、额叶及其他部位的病灶性病变，临床上发现，一些脑梗塞病人原已存在心肌梗塞，我们在猴的实验看到心肌缺血后引起大脑皮层和肾血流量减少。心功能不全可引起脑功能改变。重度者为“循环性痴呆”。与上相反，大脑缺血可引起心脏功能活动甚至形态的改变，痴呆病人均有心梗，尸检有大脑的多发性坏死灶。精神源心脏病症发作不是罕见，已肯定精神应激可引发室颤，已知刺激下丘脑某些部位会造成心律失常。心肌在不同部位缺血在脊髓和大脑有特定易受损的相应部位。神经源(大脑神经源)心脏病的概念已被承认，心、脑互相关联。心、脑缺血的关系包括两方面：首先，两者有共同规律：以动脉粥样硬化为病变基础；第二，心与脑互为因果。老年人脑血液循环阻力增大，脑血流速度较青年人慢，故脑供血量减少，脑耗氧量减少，若有心血管疾病或脑动脉硬化，则更会影响脑的血供。心脏随着增龄因收缩力进行性减退，平均以每年1％的速度呈直线下降。65岁的老年人与25岁的青年人相比，其心搏出量约减少40％，末梢阻力增大，心率变慢。血压随年龄而逐渐上升，一般以收缩压上升较为明显，因而脉压增大。心脏的潜在力量(储备力)70岁时只相当于40岁时的50％。老年期的代谢特点是蛋白代谢、脂质代谢、糖代谢、无机物代谢异常，它们之间有着相互密切关系。这些代谢的异常成为老年病发生的基础，随着增龄冠状动脉粥样硬化亦渐显著，而引起老年冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)老年高血压病。无论是哪种类型的高血压病，均可增加心脏负荷，导致心肌增厚，心脏增大，心肌超微结构异常，左心功能都存在隐患。当人进入老年阶段，心脏除了有血管粥样硬化的改变外，心肌、心内膜、心瓣膜均可发生退行性改变，而血压与血流以各种方式作用于循环的各个部位。这种血液动力学变化的影响，使疾病与老化相混淆，形成老年心血管的特点：血液流变学和动力学异常，是诸多老年疾病的重要致病因素和基本病理改变，因而中医活血化瘀药以及西医抗凝血药成为治疗老年病的常用之品，但在此类药物大量应用的同时，又带来越来越多诸如荨麻疹、胃溃疡、上消化道出血，以及加重糖尿病、心绞痛病症等明显的副作用，其中尤以出血为最严重，甚至可以成为导致老年患者死亡的主要原因之一。(参考文献1-5)鉴于老龄化、高龄化、日益衰退的整体机能；抗衰老、治疗老年病务必重视三大关键节点：第一，调控基因，增强神经内分泌免疫系统的功能，延缓衰老。第二，抗氧化，抗动脉硬化，对循环系统各种化学介质多途径综合调控。第三，保护心肌细胞，保护心泵功能，增加心、脑血流量，保护心、脑血管。老年人高血压、高血糖(糖尿病)、冠心病的死亡，都存在心功能、心血管、心肌超微结构的异常密切相关，与神经、内分泌、免疫网络系统关联密不可分。这三大环节，环环相扣，缺一不可。随着生命科学的发展，人们深刻认识到脊椎动物，细胞间的信息传递主要依靠神经、内分泌、免疫系统的调控。神经——内分泌——免疫网络是机体极其重要而又相当复杂调控网络。内环境稳态的维护，不但要有各种细胞与组织器官的自身调节，更主要的是依靠神经内分泌免疫网络的整合。神经——内分泌——免疫网络只有在自身之间保持平衡协调的前提下，才有可能完成对循环、呼吸、消化、泌尿、生殖、造血等系统的调节。如若网络的调控机能失常，不仅直接引起网络间病变，而且还间接导致各大系统异常。(参考文献6)无论是活血化瘀的中成药还是西药的抗凝，仅仅是治疗局部的“病”而且还有副作用。殊不知，衰老是生命过程中组织与器官老化，下丘脑——垂体——靶腺之神经、内分泌、免疫、生化代谢等整体生理功能衰退，形成(动脉粥样硬化、冠心病、高血脂、高血压、高血糖、中风等)老年心、脑血管系统疾病。是以神经、内分泌、免疫网络、生化代谢紊乱为主的机体内环境综合调控机能障碍。唯有改变基因调控为契机，调控基因，直接作用于crf(促肾上腺皮质激素释放因子)mrna(信使核糖核酸)表达，才能有效改善hpat轴功能，尤其是crf神经元和神经纤维的作用，通过神经肽、激素、细胞因子三者互相作用，如下丘脑和皮质β——内啡肽，血促性腺激素(lhfsh)、睾酮(t)、雌二醇(e2)、白细胞介素——2(il——2)、自然杀伤细胞(nkc)活性，增强神经内分泌免疫网络的调节功能，达到抗衰老，抗心律失常，纠正心肌细胞紊乱，保护心肌细胞，保护心功能；多途径综合调控循环系统各种化学介质(降低血清cpk，ldh活性，降低lpo含量，抑制脂质过氧化，并提高内源性抗氧化酶sod，cat，gsh-px活性。降低血浆txa2水平，增高pgi1α/txa2的比值，纠正pgi1α/txa2之间的平衡)；抗氧化、抗动脉粥样硬化，抗心、脑缺血、缺氧，降低脑血管阻力，降血压，治疗冠心病、高血压等心、脑血管系统老年病。迄今为止，无论是中成药还是西药都没有涉及基因表达调控(神经、内分泌、免疫、生化代谢紊乱的)机体内环境综合机能障碍的药物，没有调控基因，直接作用于crf(促肾上腺皮质激素释放因子)，mrna(信使核糖核酸)表达，使神经肽、激素、细胞因子三者互相作用，增强神经、内分泌、免疫网络系统；达到抗衰老、抗氧化、抗动脉硬化，治疗冠心病、高血压等老年病的药物。(详见药效学研究1-10)本发明是传统的中医学、中药学结合现代生命科学研究基因调控的结晶，历经五十余年不懈探索，旨在研发完全创新的药物，用新的复方，针对调控基因，抗衰老，抗动脉硬化，治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病，筛选对应药靶，在药效显著的基础上，反复研究筛选有效成分，用有效活性成分，配伍组合制剂，组分清楚，具有特异性鉴别指标和可定性定量的质量控制标准，实现调控基因，抗衰老，抗动脉硬化，治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病；提供全新的技术解决方案。参考文献1、王赞舜，薛邦祺、马永兴等、大剂量维生素e对血凝纤溶、血脂的作用及血清浓度观察，中华老年医学杂志，1984；3(2)：692、赵春方、老年人消化道出血的有关问题，中华老年医学杂志，1990；9(2)：1163、孙世骥、英勇、老年人脑叶出血13例临床分析，中华老年医学杂志，1986；5(4)：1964、王忠良，王士雯、老年人疾病的死因和误诊，中华老年医学杂志，1988；7(2)：1165、于春枚，高柏玲、老年人心脏病引起潜源性胃肠道出血44例临床分析，老年学杂刀1991；11(1)：306、胡春白、神经内分泌免疫为何是衰老过程的重要因素，国外医学老年医学分册，1989；10(2)：63技术实现要素：本
发明内容在于提供一种从中药材(天然药物)中提取有效成分配伍组成的复方制剂，其特征①本发明专利采用现代科学先进的(动态逆流)提取，(加快提取速率，降低后续浓缩能耗，提高工效)。高速离心10000r/min，(改变传统的醇沉法，减少危险品使用，缩短工时，简化工艺，提高有效成分)。大孔树脂吸附，纯化，(缩小剂量，提高制剂质量，产品不吸潮，去除重金属污染，提高工效)。超滤，浓缩，精制富集，(浓缩兼除杂同时除菌，节能降耗，降低成本，因为不加热，没有相的变化，稳定药效，延长贮存期)；并解决了长期以来中药浸膏(片剂，胶囊剂，浓缩丸)崩解缓慢的难题。简化生产工艺，提高质量控制。其特征②在于它是下述原料和提取物配伍组成的复方制剂，在制备调控基因，抗衰老、抗动脉硬化、治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病药物中的应用，(包括口服制剂、注射剂、输液剂、透皮吸收、粘膜吸收等剂型)，在临床使用中可以缩小剂量(只有原药材的2％)，提高疗效，方便使用。本发明是通过以下技术方法来实现的：1、淫羊藿总黄酮：其特征是从中药材，淫羊藿别名仙灵脾，系小檗科淫羊藿属(epimediumbrevicnummaxim)植物。淫羊藿地上部分粉碎，第一次用水20倍量或用60％乙醇10倍量浸泡6h(70℃温度)动态逆流提取1h过滤，第二次用水18倍或60％乙醇8倍量(70℃温度)动态逆流提取1h过滤，第三次用水15倍或60％乙醇8倍量(70℃温度)动态逆流提取1h过滤，合并三次滤液，高速离心10000r/min)，除去叶绿素、树胶等杂质，离心液用ab-8大孔树酯吸附，蒸馏水洗脱杂质，再用40％、55％、60％乙醇梯度洗脱，洗脱液高速离心10000r/min，离心液(高效液相色谱法)检测有效成分含量，重复用大孔树脂吸附，40％、55％、60％乙醇梯度洗脱，洗脱液高速离心10000r/min，离心液(高效液相色谱法)检测有效成分含量，检测是否达到要求的有效成分含量，否则重复大孔树脂吸附，直至达到目标含量(60％-80％淫羊藿总黄酮)为止，超滤，(分离分子量为14万道尔顿)浓缩回收乙醇至浸膏(d＝1.2左右)备用。其主要有效成分是朝藿定a、b、c(epimedina，b，c)、淫羊藿甙(icariin)、宝藿甙-1(baohuoside-i)等。淫羊藿总黄酮[含量测定]hplc法1.1色谱条件色谱柱为hypersilbds-c18(4mm×250mm，5μm)：流动相为甲酸水(ph＝3.0)a和乙腈b，梯度洗脱。起始时：0min，a75％，b25％；3min，a75％，b25％；20min，a70％，b30％35min，a55％，b45％；45min，a27％，b73％；流速为0.9ml/min，检测波长270nm，柱温为室温。1.2对照品溶液的配制分别精密称取朝藿定a、朝藿定b、朝藿定c、淫羊藿甙、宝藿甙i各适量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品贮备液，分别精密吸取各对照品溶液30μl于1ml量瓶中混合定容，作为对照品溶液。1.3样品处理由于样品是提取液，为尽量保留提取液中各物质的实际存在状态，简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用提取液直接进样的方式。精密量取“提取液”1ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。摇匀，作为供试品溶液。1.4测定准确吸取混合对照品溶液及样品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得淫羊藿总黄酮高效液相色谱图(见说明书附图第1页图1)。2、西洋参二醇组皂甙：其特征是用药材为西洋参(或西洋参茎叶)，西洋参叶系五茄科(araliaceac)人参属植物西洋参(panaxquingueflinuslinu)的干燥根茎或叶。西洋参粉碎，用水或50％乙醇20倍量浸泡8h、(90℃温度)动态逆流提取三次，每次提取1h，合并提取液，高速离心(10000r/min)，沉淀去除杂质，取上清液，用d101大孔树脂柱吸附，先用蒸馏水洗去水杂后，依次用25％、40％、80％不同浓度乙醇梯度洗脱，收集80％乙醇洗脱液。测定含量，含有20(s)-人参皂甙-rb3、20(s)-人参皂甙-rb2、20(s)-人参皂甙-rb1、20(s)-人参皂甙-rd、20(s)-人参皂甙-rc等人参二醇型皂甙，达到有效成分为西洋参二醇组皂甙含量85％以上，否则重复用d101大孔树脂吸附，依次用25％、40％、80％不同浓度乙醇梯度洗脱，收集80％乙醇洗脱液，超滤(分离分子量为10万道尔顿)浓缩回收乙醇至浸膏(d＝1.2左右)备用。检测方法高效液相色谱法2.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(36∶64)为流动相；检测波长为203nm，柱温40℃，流速1.0ml/min。理论板数按人参皂rb3，峰计算应不低于2500。2.2对照品溶液的制备精密称取人参皂甙-rb1、-rb2、-rb3、-rd、-rc配制五种人参皂甙对对照品各7.5mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含人参皂甙-rb1、-rb2、-rb3、-rb、-rc0.3mg)。2.3样品处理由于样品是提取液，为尽量保留提取液中各物质的实际存在状态，简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用提取液直接进样的方式。精密量取“提取液”1ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。摇匀，作为供试品溶液。2.4测定法分别精密吸取对照品溶液与5种供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得西洋参总皂甙高效液相色谱图(见说明书附图第1页图2)。3、益母草总生物碱：为唇形科植物leonurusheterophyllussweet(益母草)的全草，含有益母草碱、水苏碱、益母草定、益母草宁等多种生物碱.以及延胡索酸、苯甲酸、氯化钾、黄酮类等成分。益母草地上部分粉碎，第一次用12倍量水浸泡6h(100℃温度)提取1.5h，过滤，第二次用9倍量(100℃温度)煮1.5h，过滤，第三次用9倍水量(100℃温度)煮1.5h过滤合并三次滤液，高速离心(10000r/min)除去叶绿素、树胶等杂质。离心液用ab-8大孔树脂吸附，蒸馏水洗脱(高效液相色谱检测)，含有盐酸水苏碱20％～25％为目标。否则重复用大孔树脂吸附，蒸馏水洗脱，洗脱液(高效液相色谱检测)，合格后用(分离分子量10万道尔顿)超滤浓缩至浸膏(d＝1.2)备用。3.1检测方法3.1.1仪器与试药waters2690液相色谱仪，milliq超纯水仪。益母草提取液样品由课题组提供。乙腈为色谱纯，其他试剂试药为分析纯。超纯水(电阻率18.2mω.cm)。3.1.2色谱条件色谱柱：aichrombond-aq-c18(5μm，4.6mm×250mm，水性柱)，柱温：30℃；流动相：0.1ml·l-1磷酸二氢钠溶液(用0.1nol.l-1磷酸二氢钠溶液调ph至5.5)，流速：1.0ml.min-1；检测波长：242nm。3.1.3样品处理由于样品是提取液，为尽量保留提取液中各物质的实际存在状态，简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用提取液直接进样的方式。精密量取“提取液”1ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。摇匀，作为供试品溶液。，注入液相色谱仪，测定，即得益母草总生物碱高效液相色谱图(见说明书附图第1页图3)4、菠萝蛋白酶：属凤梨科(broneliaceue)凤梨属(ananoscomosus)多年生单子叶常绿草本果树植物。菠萝果实，切块，打浆，压榨，过滤，高速离心(10000r/min)分离，取上清液，用截留分子量(7万道尔顿)聚砜膜(ps)超滤，浓缩，浓缩液冷冻升华干燥，即得菠萝蛋白酶(紫外分光光度检测酶活力比)。检测方法菠萝蛋白酶加蒸馏水匀浆，用福林比色法(50t菠萝蛋白酶检测试剂盒)紫外分光光度计于680nm处检测酶活力单位。上述三种超滤浓缩液，经高效液相检测(有效成分，特征成分)达到目标含量合格后按配比混匀，喷雾干燥，或流化床干燥；最后加入菠萝蛋白酶，混匀。装入胶囊或制成薄膜片剂或固体分散片或肠溶片或磷脂复合制剂或微囊缓释剂或针剂。实施例康尔健制备工艺(见流程：)ab-8大孔树脂吸附→蒸馏水洗脱杂质→低醇洗脱杂质→40％、55％、60％乙醇梯度洗脱有效成分→高速离心10000r/min→离心液(高效液相色谱检测)→重复用大孔树脂吸附→40％、55％、60％乙醇梯度洗脱(高效液相色谱检测)→洗脱液→高速离心10000r/min离心液(高效液相色谱检测)→超滤浓缩(备用)检测方法特征成分hplc法(1)色谱条件色谱柱为hypersilbds-c18(4mm×250mm，5μm)：流动相a，乙腈；流动相b，水-36％乙酸(100∶4)，梯度洗脱。起始时，a20％，b80％；10min，a25％，b75；40min，a48％，b52％；41min，a20％，b80％；检测波长272nm；流速为1.0ml/min，柱温为室温。(2)对照品溶液的配制分别精密称取朝藿定a、朝藿定b、朝藿定c、淫羊藿甙、宝藿甙i各适量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品贮备液，分别精密吸取各对照品溶液30μl于1ml量瓶中混合定容，作为对照品溶液。(3)样品处理由于样品是提取液，为尽量保留提取液中各物质的实际存在状态，简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用提取液直接进样的方式。精密量取“提取液”1ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。摇匀，作为供试品溶液。(4)测定准确吸取混合对照品溶液及样品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得淫羊藿甙、朝藿定c、朝藿定b、朝藿定a、宝藿甙高效液相色谱图(见说明书附图第1页图4)。→ads-7大孔树脂吸附→蒸馏水洗脱杂质→25％乙醇洗脱色素、多糖、继以95％乙醇洗脱，收集95％的洗脱液→高速离心10000r/min→离心液(高效液相色谱)→重复用大孔树脂吸附→40％乙醇洗脱，继以80％乙醇洗脱，收集80％的洗脱液(高效液相色谱)→超滤浓缩、浓缩液备用。检测分析方法[含量测定]高效液相色谱法(1)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(36∶64)为流动相；检测波长为203nm，柱温40℃，流速1.0ml/min。理论板数按人参皂rb3，峰计算应不低于2500。(2)对照品溶液的制备精密称取人参皂甙-rb1、-rb2、-rb3、-rd、-rc配制五种人参皂甙对对照品各7.5mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含人参皂甙-rb1、-rb2、-rb3、-rb、-rc0.3mg)。(3)样品处理由于样品是提取液，为尽量保留提取液中各物质的实际存在状态，简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用提取液直接进样的方式。精密量取“提取液”1ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。摇匀，作为供试品溶液。(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与5种供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得西洋参特征成分人参二醇组皂甙-rb1、-rb2、-rb3、-rd、-rc高效液相色谱图(见说明书附图第1页图5)。→ab-8大孔树脂吸附→蒸馏水洗脱、洗脱液(液相色谱检测)含有盐酸水苏碱20％～25％为目标→否则重复用大孔树脂吸附→蒸馏水洗脱、洗脱液(高效液相色谱检测有效成分)→超滤浓缩→浸膏(d＝1.2)备用。益母草生物碱(特征成分：盐酸水苏碱)。检测方法特征成分6.3.1仪器与试剂asilent1100高效液相色谱仪，盐酸水苏碱对照品(中国药品生物制品检定所)益母草提取物(由课题组提供)磷酸二氢钾为分析纯，超纯水。6.3.2色谱条件watersspherisorbscx阳离子交换树脂柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：15mmol·l-1磷酸二氢钾溶液(含有0.04％三乙胺和0.15％磷酸)；柱温：室温；检测波：192mm，流速：1.0ml·min-1；理论板数以盐酸水苏碱峰计算应不低于3000。6.3.3对照品溶液的制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相制成0.1mg·ml-1的溶液，即得盐酸水苏碱对照品hplc图(见说明书附图第1页图6)。6.3.4样品处理由于样品是提取液，为尽量保留提取液中各物质的实际存在状态，简化样品制备过程，保证信息的完整性，并能与流动相匹配，采用提取液直接进样的方式。精密量取“提取液”1ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度。摇匀，作为供试品溶液。6.3.5测定准确吸取对照品溶液及样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得益母草中、水苏碱高效液相色谱图(见说明书附图第1页图7)。6.4菠萝蛋白酶：属凤梨科(broneliaceue)凤梨属(ananoscomosus)多年生单子叶常绿草本果树植物。菠萝果实，切块，打浆，压榨，过滤，高速离心(10000r/min)分离，取上清液，用截留分子量(7万道尔顿)聚砜膜(ps)超滤，浓缩，浓缩液冷冻升华干燥，即得菠萝蛋白酶(紫外分光光度检测酶活力比)。检测方法菠萝蛋白酶加蒸馏水匀浆，用福林比色法(50t菠萝蛋白酶检测试剂盒)紫外分光光度计于680nm处检测酶活力单位。上述三种超滤浓缩液，经高效液相检测(有效成分，特征成分)达到目标含量合格后按配比混匀，喷雾干燥，或流化床干燥；最后加入菠萝蛋白酶，混匀。装入胶囊或制成薄膜片剂或固体分散片或肠溶片或磷脂复合制剂或微囊缓释剂或针剂。发明目的本发明是传统的中医学、中药学结合现代生命科学研究基因调控的结晶，历经五十余年不懈探索，旨在研发完全创新的药物，用新的复方，针对调控基因，抗衰老，抗动脉硬，治疗冠心病、高血压等心、脑血管系统老年病(筛选对应药靶)；围绕抗衰老，多途径综合调控循环系统各种化学介质，抗氧化(提高内源性抗氧化酶)，提高血管内皮细胞代谢，pg11α/txa2比值，抗动脉硬化，降低血小板的聚集，改变血液流变，抗心、脑缺血、缺氧，增加脑血流量，降低脑血管阻力，降血压、抗心律失常，保护心肌细胞，保护心功能等全方位观察，进行药效实验研究。1、调控基因，直接作用于下丘脑(促肾上皮质激素释放因子)(crf)信使核糖核酸(mrna)表达，增强神经——内分泌——免疫网络系统的调节功能，维护机体内环境的稳定，达到抗衰老、治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病。(详见药效学研究1)2、再次实验表明，本发明专利，调控基因，使神经肽、激素、细胞因子三者相互作用，促进下丘脑、垂体、靶腺轴，增强神经、内分泌、免疫网络功能，维护内环境稳定。(实现科学研究中可测性和可重复性)为抗衰老、抗动脉硬化、治疗冠心病、高血压等心、脑血管老年病，提供现代科学依据。(详见药效学研究2)3、耐缺氧作用与西药“心得安”“潘生丁”无差异，可使垂体后叶素所致的大鼠缺血性心电图改善，降血压、抗心律失常(详见药效学研究3)。4、剂量依赖性地抗大鼠冠脉结扎引起的心肌梗死，明显缩小梗死范围，明显保护大鼠急性心肌缺血；(详见药效学研究4)。5、对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血有明显保护作用及缺西洋参二醇皂甙差异明显。对异丙肾上腺引起心肌缺血、缺氧小鼠均能明显延长生存时间及缺西洋参二醇皂甙的差异显著；有效成分协同增效显著；为处方设计合理性，提供科学依据。(详见药效学研究4)6、通过减少左心室作功，降低心肌耗氧量，增加缺血心肌供血等环节。发挥抗心肌缺血作用。(详见药效学研究5)7、对衰老大鼠，心、脑、肝、血清脂质过氧化的影响，明显降低老年大鼠tc、tg、ldl-c，升高hdl-c的水平，抑制高血脂症衰老大鼠血小板聚集，提高pgi2的分解产物6-酮-pgi1α的含量，降低txa2的含量。提高6-酮-pgi1α/txa2比值；通过维持pgi1α/txa2的平衡，防止血栓的形成和动脉硬化的产生、发展。(详见药效学研究6)8、通过小鼠心肌86rb摄取率研究，观察对小鼠心肌营养性血流量的影响，及拆方研究(减去淫羊藿)；实验结果证实，可明显增加小鼠86rb摄取率，表明明显增加心肌营养性血流量，缺淫羊藿组亦有增加小鼠心肌86rb摄取率的趋势，但与对照组比较差异显著；淫羊藿总黄酮在处方中显示出设计合理性，有效活性成分之间有协同增效的作用，提供科学依据。(详见药效学研究7)9、多途径综合调控循环系统各种化学介质，抗氧化(提高内源性抗氧化酶)、抗动脉硬化(详见药效学研究8)。10、增加脑血流量，降低脑血管阻力，抗脑缺血、缺氧(详见药效学研究9)。11、钙通道阻断作用与异搏定相似，(作用温和持久)抗心律失常(详见药效学研究10)。康尔健药效学研究1对下丘脑——垂体——肾上腺——胸腺轴及crf基因表达的作用表明了“康尔健”调控基因的物质基础我们在“康尔健”抗心肌缺血、缺氧，抗心律失常，降血压的药效基础上，现采用逆转录多聚酶链反应(rt-pcr)化学发光定量法、放射免疫及细胞免疫技术，观察“康尔健”对皮质酮大鼠下丘脑——垂体——肾上腺——胸腺(hpat)轴及下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(crf)信使核糖核酸(mrna)表达的影响，本实验从调控基因表达来阐明“康尔健”能直接作用于下丘脑的-crfmrna表达，表明了“康尔健”调控基因的物质基础，实现了现代生命科学研究中从基因表达调控(神经、内分泌、免疫、生化代谢紊乱)，为抗衰老、治疗冠心病、高血压、糖尿病等老年病，提供现代科学依据。1、方法1.1雄性sprague-dawleydd大鼠30只，体重190±15g，随机分为“康尔健”、模型、对照三组、每组各10只。“康尔健”组10mg/kg体重皮下注射cort，同时100mg/kg体重康尔健灌胃，每天各1次，连续14天。模型组以等体积蒸馏水代替康尔健灌胃，余同康尔健组。对照组以等体积灭菌豆油代替cort，余同模型组。实验第15天，所有动物断头处死，1分钟内取出下丘脑、垂体，再依次取出脾脏、左侧肾上腺、胸腺，所有组织(脾脏仅取0.5cm厚，余置1640液中作细胞免疫)标本都固定于无冰醋酸bouin液中，分离包膜，4℃过夜。1.2下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺的形态学观察：将固定12小时的垂体、肾上腺、胸腺快速用滤纸吸干，librorl-160d型电子天平称重。然后与下丘脑一起，室温下50％-100％酒精梯度脱水，氯仿透明，石腊包埋。下丘脑从视交叉起至正中隆起止作冠状连续切片，全垂体作水平连续切片，每片均厚5um，依次分置于10张载玻片上，各组取相同序号片作免疫组织化学染色。crf抗血清终浓度为1∶1000，acth抗血清终浓度为1∶4000，第二抗体为羊抗兔igg，终浓度为1∶200，dab显色。肾上腺、胸腺常规切片作苏木素-伊红染色。日本olympusbh-2型显微镜观察结果。1.3血浆cort及acth放射免疫法检测：大鼠断头取血，cort用肝素抗凝，acth用edta抗凝。皮质酮待测标本用二氯甲烷抽取，加h-cort及cort抗血清，4℃过夜，当h-cort与样品cort同抗血清竞争性结合达到平衡后，用葡聚糖加膜活性炭分离抗原-抗体结合物及游离cort，离心后上清液加入ppo-popop-甲苯-无水乙醇闪烁液中，lkb-1214型液闪仪测量总脉冲数。acth待测标本加入i-acth及acth抗血清，4℃16小时平衡后再加入抗acth抗血清，离心后弃上清，beckman-5500型r计数仪测沉淀物的脉冲数。1.4淋巴细胞增殖试验：无菌取脾，置200目不锈钢铜网上，10ml注射器芯轻压脾脏，再用1640液冲洗过网，1000g×5分钟离心弃上清，加2ml1.7％氯化钠溶液，50秒后加入2ml蒸馏水，用1640液1000g×10分离心洗3次，悬浮于prmi-1640完全培养液中(100ml含小牛血清10ml，hepes20mmol，青霉素10000万单位，链霉素10mg)，10％碳酸氢钠调ph7.0-7.2。计数，调节细胞至1×10，加入96孔平底细胞培养板，每孔0.1ml，每鼠3复孔，同时加cona5ug/o.1ml，对照孔以完全培养液补足，共设12复孔。每孔反应总体积为0.2ml。培养30小时后每孔加入h-tdrluci(10ul)，继续培养18小时，收集细胞，测cpm值。2、结果2.1康尔健对皮质酮-大鼠垂体-肾上腺-胸腺轴重量的影响：如表1所示，大鼠皮下注射皮质酮后垂体、肾上腺、胞腺重量比对照组明显减轻，p≤0.001；400mg/kg康尔健灌胃后重量显著上升，p≤0.0。表1康尔健对皮质酮-大鼠垂体-肾上腺-胸腺重量的影响(mgx±sd)2.2康尔健对皮质酮-大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的形态学影响：大剂量cort明显抑制大鼠hpat轴。模型组大鼠下丘脑室旁核(paraventricularnucleus)小细胞区crf阳性细胞及正中隆起(medianeminence)外层cpf阳性纤维明显减少，染色变淡。垂体缩小，垂体前叶acth阳性细胞数量明显减少，胞体变小，染色变淡。肾上腺明显萎缩，特别是束状带明显变薄。胸腺明显萎缩，以皮质萎缩为最严重，皮质淋巴细胞数量显著减少，因此整个胸腺的苏木素染色变浅，髓质内胸腺小体数量减少。脾髓缩小，以白髓为著，淋巴细胞数减少，脾小结的生发中心亦明显减少(模型组图片见说明附图第2页图9b1～b6)。(对照组图见说明书附图第2页图8a1～a6)康尔健组的上述病理变化程度远较模型组轻。提示康尔健能有效保护cort对hpat轴的抑制(康尔健组图片见说明书附图第2页图10c1～c6)有效改善hpat轴功能，尤其是crf神经元和神经纤维，表明了“康尔健”调控crf基因表达的物质基础。2.3康尔健对皮质酮-大鼠血浆cort及acth的影响：如表2所示，大鼠注射大剂量cort后，血浆cort、acth明显降低，p≤0.001。康尔健能有效提高模型组大鼠的血浆cort、acth含量，p≤0.001。表2康尔健对皮质酮-大鼠血浆皮质酮及促肾上腺皮质激素的影响(x±sd)2.4康尔健对皮质酮-大鼠脾细胞的促增殖作用：如图1所示，与对照组比较，皮质酮抑制模型组大鼠脾细胞的体内增殖，使脾细胞的绝对数减少，p≤0.001；康尔健能有效促进皮质酮-大鼠脾细胞的体内增殖，使其绝对值增加，p≤0.01。2.5康尔健促进皮质酮大鼠淋巴细胞增殖反应的作用：模型组大鼠注射皮质酮后其淋巴细胞对有丝分裂原cona的刺激反应较对照组明显减弱，h-tdr掺入量显著减少，p≤0.001；康尔健能提高模型组大鼠的淋巴细胞增殖反应，p≤0.01。表3康尔健促进皮质酮-大鼠的淋巴细胞增殖反应的作用(详见：说明书附图第2页图8a1～a6，图9b1～b6，图10c1～c6，形态学观察照片18张)讨论在神经内分泌免疫网络中，由于糖皮质激素的重要生理学意义及广泛的药理学效应，使下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴(hpat)备受注目。hpat轴的反馈调节步骤为：1、肾上腺皮质如果分泌过高的皮质醇或皮质酮；2、抑制下丘脑crf的分泌；3、抑制垂体acth的分泌；4、继1.2.3之后，肾上腺皮质分泌糖皮质激素降低。低水平循环肾上腺皮质激素刺激各种成熟淋巴细胞的活性，加速未成熟前淋巴细胞发育成为效应淋巴细胞。5、低水平的糖皮质激素能增强胸腺分泌胸腺激素，影响淋巴细胞的成熟机能。6、高水平胸腺激素通过刺激淋巴细胞和单核细胞分泌il-1、il-2、gif(糖皮质激素刺激因子)等对下丘脑-垂体-肾上腺实行正反馈调节而升高肾上腺糖皮质激素(3)。gif是淋巴细胞培养产生的类淋巴因子物质，能使垂体acth和肾上腺皮质激素升高。il-1能直接或间接地作用在下丘脑-垂体-肾上腺的各个水平而升高crf-acth-cort(4)。糖皮质激素即是hpa轴的终末物质，又是hpa与胸腺联系的重要介质。已知下丘脑和垂体都有与糖皮质激素负反馈机制有关的受体。垂体前叶分泌的acth对糖皮质激素生成的各个环节都有激活作用。acth的分泌受到多方面的调节，其中主要是受下丘脑crf和循环皮质激素水平的调节。1981年vale从绵羊下丘脑分离到crf。人crf含有41个氨基酸，与大鼠crf具有100％同源。crf主要由下丘脑室旁核的小细胞神经元合成与分泌，其神经纤维投射到正中隆起，在此处释放后经垂体门脉到达垂体前叶，与该处acth细胞上的crf受体结合，通过camp的介导，刺激acth分泌和释放(5)。本研究结果表明，大剂量外源性cort抑制了hpat轴，血浆acth，cort含量显著降低，下丘脑室旁核crf阳性神经元和正中隆起crf阳性神经纤维以及垂体前叶acth阳性细胞等数量减少，染色变淡；肾上腺明显萎缩，束状带变薄，束状结构排列不齐；胸腺严重萎缩，以皮质为著，胸腺细胞大量减少；脾细胞显著减少，白髓萎缩，中央动脉周围的细胞减少。关于糖皮质激素抑制淋巴细胞的机理，主要是与淋巴细胞受体结合，形成“激素-受体”复合物，抑制细胞代谢，复合物进入细胞核，还可以抑制dna的合成和转录。康尔健灌胃能有效阻止cort对hpat轴的抑制。与copt组比较，康尔健组的血浆acth，cort含量明显上升，下丘脑室核和正中隆起的crf神经元和纤维增多，染色加深；垂体acth阳性细胞增多；肾上腺皮质特别是束状带增宽，结构完整；胸腺皮质萎缩减轻，细胞数量增多；脾细胞及中央动脉周围细胞增多。其作用的机理是：1、在受体水平拮抗cort对hpat轴的反馈抑制；2、改善内环境，调动机体各种内在因素，从而降低hpat轴的受抑程度；3、直接促进免疫系统，通过神经肽、激素、细胞因子三者相互伤作用。如：“下丘脑和皮质β-内啡肽(β-end)、血促性腺激素(lhfsh)、睾酮(t)、雌二醇(e2)、白细胞介素-2(il-2)、自然杀伤细胞(nkc)活性”，增强机体神经内分泌免疫网络的调节功能，维持机体内环境稳定，从而延缓衰老(详见“康尔健”药效研究之二)。康尔健”对老年大鼠神经内分泌免疫调节作用的研究，衰老是生命过程中组织与器官老化，下丘脑——垂体——靶腺之神经、内分泌、免疫生化代谢等整体生理功能衰退(动脉粥样硬化、冠心病、高血压、高血糖、中风等)老年心脑血管系统疾病。是以神经、内分泌、免疫网络、生化代谢紊乱为主的机体内环境综合调控机能障碍。“康尔健”实现了从基因表达调控为切入点，直接作用于crf(促肾上皮质激素释放因子)，mrna(信使核糖核酸)表达，促进下丘脑——垂体——靶腺轴，增强神经——内分泌——免疫网络系统。达到抗衰老、治疗心脑血管系统老年病开辟了一个新途径。成为治疗冠心病、高血压、糖尿病等老年病升级换代的现代中药。康尔健药效研究2对老年大鼠神经内分泌免疫调节作用的研究再次表明康尔健调控基因表达使神经肽、激素、细胞因子三者互相作用，促进下丘脑——垂体——靶腺轴，增强神经——内分泌——免疫网络系统的调节功能，维护机体内环境的稳定。神经内分泌免疫网络调节功能的增龄变化是机体衰老进程的重要因素。为探索康尔健抗衰老作用的机理，本研究采用自然衰老动物，用21月龄自然衰老雄性大鼠观察了康尔健对老年大鼠神经内分泌免疫网络“下丘脑和皮质β-内啡肽(β-end)含量、血促性腺激素(lh、fsh)、睾酮(t)、雌二醇(e2)、白细胞介素-2(il-2)、自然杀伤细胞(nkc)活性”，因老年性变化的影响。表明与青年鼠比较，衰老大鼠上述指标有不同程度的降低。康尔健每天ig给药1次，连续1月老年大鼠上述指标得到明显改善。结合前期工作，“康尔健”对下丘脑——垂体——肾上腺——胸腺及crf基因表达的影响，显示“康尔健”调控基因为切入点，直接作用于crf(促肾上腺皮质激素释放因子)mrna(信使核糖核酸)表达；本次实验再次表明“康尔健”调控基因表达，使神经肽、激素、细胞因子三者互相作用，促进下丘脑——垂体——靶腺轴，增强神经——内分泌——免疫网络系统的调节功能，维护机体内环境的稳定。达到抗衰老、抗氧化、抗动脉硬化。多途径综合调控循环系统各种化学介质，抗心脑缺血，抗心律失常，保护心肌细胞，保护心功能，改变血液流变，扩张脑血管，保护脑细胞抗凝、降脂、降糖、降血压，为治疗“冠心病、高血压、高血糖(糖尿病)，防治中风等老年病提供科学依据(详见“康尔健”药效学研究1-10)。1、材料和方法1.1动物6月龄sd雄性大白鼠体重230±20g，21月龄体重470±50g，由白求恩医科大学实验动物部供给。1.2药品康尔健颗粒剂，治疗因衰老而动脉粥样硬化引起的“冠心病、高血压、高血脂、糖尿病等心脑血管系统老年病——到对应药靶，历经五十余年的不懈探索，依证随方确认各药味中有效成分，采用现代生化制剂技术提取有效成分，以提取的有效成分，经科学的配伍，按配比入药(中间体)，选喷雾干燥一步制粒成颗粒剂，每包1000mg，用时溶解成需要的浓度。1.3试剂促黄体生成素(lh)、促卵泡生成素(fsh)、睾酮(t)、雌二醇(e2)放射免疫试剂盒为天津德普生物技术及医学产品有限公司(dpc)产品；β-内啡肽(β-end)放射免疫药盒由第二军医大学神经生物学教研室提供。1.4仪器fj-2008p型y-免疫计数仪为西安二六二厂生产。1.5实验方法取6月龄雄性大白鼠10只作为青年对照组，另将30只21月龄雄性大鼠随机分为3组，除青、老年对照组每天ig生理盐水1ml/100g外，其它2组ig康尔健200mg/kg或100mg/kg(1ml/g)，每天一次，连续30天，第31天将动物处死，取空腹血检测血清中lh、fsh、t、e2含量，取下丘脑及额叶皮质测β-end含量(均按试剂盒说明书进行操作。)脾细胞经cona诱生制备含il-2的培养上清液，以il-2依赖细胞株(ctll)的3h-tdr掺入法测il-2活性。制备脾细胞悬液用体外同位素释放法测定并计算其nkc活性(％)。2、结果2.1对老年大鼠下丘脑和皮质中(β-end含量的影响)见表1.老年大鼠下丘脑和皮质中β-end含量明显低于青年鼠，康尔健能明显增加老年大鼠下丘脑和皮质中β-end含量。表1康尔健对老年大鼠下丘脑和皮质中β-end含量的影响n＝10，与老年对照组比较*p＜0.05，**p＜0.012.2对老年大鼠血清lh、fsh、t、e2含量的影响见表2老年雄性大鼠血清中t含量明显降低，e2/t比例明显升高，血清中lh、fsh有下降趋势，e2含量变化不大。康尔健能明显增加老年雄性血清中fsh和t含量，使e2/t比例明显降低。表2康尔健对老年大鼠血清lh、fsh、t、e2含量的影响n＝10，与老年对照组比较*p＜0.05，**p＜0.012.3对老年大鼠il-2、nk细胞活性的影响见表3。老年大鼠il-2、nk细胞活性明显降低，两种剂量康尔健都能明显增加老年大鼠il-2、nk细胞活性。表3康尔健对老年大鼠il.2、nk细胞活性的影响组别剂量(mg/kg)il-2活性(u/ml)nkc活性(％)青年对照组42.69±13.30**52.4±10.6*老年对照组20.11±5.6927.5±8.1康尔健10033.26±10.62**42.2±8.9**康尔健20037.82±9.77**44.3±11.8**n＝10，与老年对照组比较*p＜0.05，**p＜0.013、结论本实验结果表明，较之青年鼠，老年雄性大鼠下丘脑、皮质中β-end含量明显减少，睾酮(t)含量明显下降，e2/t比值明显升高，同时老年大鼠il-2、nk细胞活性也明显下降。本研究采用“康尔健”观察了对老年大鼠神经内分泌免疫网络老年性变化的影响，康尔健能明显提高老年大鼠下丘脑和皮质中β-end含量和血中lh、fsh含量，降低e2/t比值，并使老年大鼠il-2、nk细胞活性也明显升高，再次证明“康尔健”能调控基因，提高机体神经、内分泌、免疫系统的整体功能，延缓各机能的衰退。“康尔健”抗衰老、抗氧化、抗动脉硬化、对循环系统各种化学介质多途径综合作用，保护心脑血管系统，是抗衰老、防治心脑血管系统老年病最佳的现代中成药。康尔健药效研究3药效研究数项抗缺氧、改善缺血心电图、降血压、抗心律失常“康尔健”是在数十年肾本质研究的基础上，对衰老而动脉粥样硬化引起“冠心病、高血压、高血糖、颈椎病”等老年病症状有明显改善。冠心病、高血压、糖尿病等老年病是以神经、内分泌、免疫网络、生化代谢紊乱为主的机体内环境综合调控机能障碍。“康尔健”实现了从基因表达调控为切入点，直接作用于crf(促肾上腺皮质激素释放因子)，mra(信使核糖核酸)表达，促进下丘脑——垂体——靶腺轴，增强神经——内分泌——免疫网络的调节功能，维护机体内环境稳定，抗衰老。本实验数项研究显示“康尔健”耐缺氧作用与西药“心得安”“潘生丁”无差异。可使垂体后叶素所致的大鼠缺血性心电图改善。对家兔有明显降压作用。能显著拮抗氯化钡、乌头碱诱发的大鼠心律失常和肾上腺素诱发的豚鼠心律失常，经多项药效研究，表明“康尔健”对治疗心、脑血管系统老年病具有良好的应用前景。1、药效作用研究1.1对小白鼠低压缺氧耐受力的影响：选健康小白鼠，随机分成“康尔健”、心得安、潘生丁和生理盐水四组，分别于腹腔内注射“康尔健”0.2毫升/10克，心得安20毫克/公斤，潘生丁100毫克/10克，放入真空干燥器内，密闭，减压，观察死亡半数时，记录各组存亡数。其结果如下：注：统计学处理：“康尔健”组与盐水组比较，x2＝8.378(p＜0.01)“康尔健”组与心得安、潘生丁组比较，组间无显著差别。1.2对豚鼠心电图的影响：取豚鼠10只，体重245-401克，麻醉后，仰位固定。记录正常心电图，切开豚鼠颈部，分离颈静脉，刺入连有滴定管的头皮针，固定，静脉滴注垂体后叶素，描记心电图。再腹注“康尔健”20毫升/公斤，记录心电图。并于给“康尔健”后分别重复给垂体后叶素，描记心电图，比较其变化情况。心电图分析：正常时st段平坦，静滴垂体后叶素后st段上移，t波增高，最大值为0.5～3毫米，r～r由正常延长达0.55秒，心率减慢，最慢为108次/分，心律出现不整。腹腔注射“康尔健”一小时后静滴垂体后叶素，st段平坦，上移不明显，最大值0.2～0.5毫米，t波最大值1毫米，心率正常，心律整。可见“康尔健”有对抗垂体后叶素所致的心电图改变。1.3对家兔血压的影响：取家兔，静注乌拉坦，麻醉，正中切开颈部，分离气管和左右侧颈总动脉，测加压反射。切开气管，插入y型管，结扎固定，描记呼吸。在右侧颈总动脉的近心端夹上动脉夹，远心端结扎，将水银检压计与已充满3.8％枸椽酸钠的动脉套管(套管尖内注入肝素)向心脏方向插入颈总动脉内，结扎固定，先将水银检压计加压到120毫米汞拄，开放动脉夹，描记血压。腹注“康尔健”25毫升/公斤，2分钟血压即开始下降，30分时，下降到最低值，给药前血压97.8±3.4毫米汞柱，给药后下降33±6.6毫米汞柱)，较正常血压下降33.74％(平均值)，一小时三十分钟后，血压仍维持下降过程，其给药前后血压变化的t值测定为5(p＜0.01)。“康尔健”降压效果非常显著。腹注“康尔健”20分钟左右，静注去甲肾上腺素的升压作用减弱。在“康尔健”所致的降压过程中，去甲肾上腺素所致的升压作用被抑制，阻断颈总动脉血流30秒所致的加压反应也减弱，被抑制。1.4抗氯化钡诱发的心律失常1.4.1氯化钡诱发的大鼠心律失常大白鼠，性别不拘，体重200～220g；大鼠用水合氯醛ip麻醉，剥离颈静脉，进行电动恒速注射器静脉插管，连结心电图机及示波器。观察描记正常心电图后，恒速推注0.4％氯化钡4mg/kg，待出现心律失常后，各实验组分别由颈静脉缓慢推注“康尔健”60mg/kg、120mg/kg或利多卡因10mg/kg。以示波器监视心电图的变化，以ii导联描记心电图，以造型有效时间内恢复窦性心律的例数及窦性心律持续的时间进行x2检验和t检验。评价药物的抗心律失常作用。1.4.2抗氯化钡诱发的大鼠心律失常注射氯化钡后各组各例动物均很快出现室性早搏或室性心动过速。盐水组12只动物有11只心律失常持续60min以上，只有1只持续27min。小剂量组给药后有10只动物恢复了窦性心律，窦性心律持续4～10min不等，窦性心律过后又出现室早或室速，但心电图异常表现较盐水组轻，且持续时间也较盐水组缩短。大剂量组作用明显较小剂量组强，结果见表1。表明“康尔健”具有显著抗氯化钡诱发的大鼠心律失常作用。“康尔健”抗氯化钡诱发的大鼠心律失常作用n＝12.**p＜0.011.5抗乌头碱诱发的大鼠心律失常1.5.1乌头碱诱发的大鼠心律失常大鼠处理同上，描记正常心电图后，由颈静脉分别缓推注“康尔健”60mg/kg、120mg/kg或利多卡因10mg/kg，3min后恒速推注乌头碱1μg/min(0.5ml/min)，以出现室性早搏、室性心动过速所用乌头碱的量评价药物的抗心律失常作用。1.5.2注入乌头碱后，生理盐水组5min内可出现室性早搏或二联律，10min内可出现短阵性室性过速或连续性室性过速给“康尔健”小剂量组、大剂量组出现室早和室速的时间显著延迟，表明“康尔健”可显著提高大鼠对乌头碱的耐受量，结果见表“康尔健”抗乌头碱诱发大量心律失常作用n＝12，*p＜0.05，**p＜0.011.6抗肾上腺素诱发的豚鼠心律失常1.6.1肾上腺素诱发的豚鼠心律失常豚鼠处理同大鼠，乌拉坦ip麻醉，描记正常心电图后，缓慢推注“康尔健”60mg/kg、120mg/kg或利多卡因10mg/kg，给药3min后立即快速推注肾上腺素100μg/kg以注射肾上腺素后至出现心律失常的时间和心律失常持续的时间评价物的抗心律失常作用。1.6.2注射肾上腺素后，对照组每鼠均于0.5min内先后出现一源性或多源性室性早搏，并很快发展为室性心动过速，一般持续3-6min。“康尔健”小剂量组、大剂量组心律失常出现时间晚，持续时间亦短，表明“康尔健”具有显著的抗肾上腺素诱发的豚鼠心率失常作用，结果见表。“康尔健”抗肾上腺素诱发豚鼠心律失常作用**p＜0.01氯化钡能增加浦氏纤维na+内向电流，提高舒张期去极化的频率而诱发室性心律失常；乌头碱能使钠通道开放，加速钠内流，促使细胞膜去极化，加速起搏点的自律性，可形成多源性异位节律；肾上腺素兴奋β受体，提高其自律性。“康尔健”具有阻断β受体，减少na+、ca++内流，降低自律性作用可能是其抗心律失常的机理之一。康尔健药效研究4抗心肌梗死、抗心肌缺血、缺氧、抗心律紊乱本研究采用二种不同配比组成，三种缺血、缺氧模型。一、结扎大鼠冠状动脉造成心肌缺血。二、注射垂体后叶素致心肌缺血、缺氧。三、用异丙肾上腺产生强烈的b1受体作用致心律紊乱，然后置观察“康尔健”对大鼠急性心肌缺血、缺氧的保护作用，为“康尔健”提供药效依据。1、材料1.1药品与试剂康尔健颗粒由课题组针对基因调控为切入点(筛选对应药靶)，筛选有效成分，经现代生化制剂技术提取其有效成分，经喷雾干燥制成颗粒，每包1000mg，用时溶解成需要的浓度。维拉帕米(verapamil，vet)(上海第十制药厂)，批号20081；垂体后叶素注射液由上海生物化学制药厂生产，批号为201101；盐酸异丙肾上腺素注射液为中国上海天丰药厂产品，批号200501。2、方法2.1“康尔健”对抗大鼠冠脉结扎引起的心肌梗死健康wistar大鼠50只，体重(226.4±18.8)g，随机分为对照组(生理盐水组)，“康尔健”大、中、小3个剂量组和维拉帕米5mg·kg-1组，各组分别ig给药7天，于第7天给药1h后，用戊巴比妥钠40mg·kg-1ip麻醉，于第3～4肋间开胸，剪开心包膜，挤出心脏，按selge方法用无损伤线结扎冠脉前降支，闭合胸腔，分别记录各组结扎后1，15～30min时s-t段变化，并于4h剪取心脏，去除左右心房，将心肌从心尖至心基底平行切成0.1cm厚的切片，放入nbt染色液中，37℃染色15min，然后剪下缺血坏死组织称重，计算占全心室肌重量的百分比，结果见表1。表1“康尔健”对大鼠心肌梗死的作用，n＝12，注：与生理盐水组比较，1)p＜0.05，p＜0.01本研究发现，“康尔健”能剂量依赖性缩小大鼠心肌梗死面积，并能明显地减轻缺血后s-t段变化。“康尔健”小剂量对大鼠心肌梗死的保护作用类似于维拉帕米；大剂量胜过维拉帕米。(表1)。2.2“康尔健”对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的影响：将50只大鼠随机分为5组，每组10只，分组及给药剂量见表2，连续ig给药7d，于末次给药后40min，在戊巴比妥纳(ip30mg/kg)麻醉下，测定正常ii导联心电图后，于舌下静脉恒速注射垂体后叶素0.75u/kg[3]，用心电图机记录iv垂体后叶素后0.5，1，3，5，10，15，20，25，30min等时间点的ii导联心电图，观察t波及s-t段的变化，用来判断急性心肌缺血的标准，结果见表2，3。表2“康尔健”对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血心电图的影响(x±s，mv)n＝10，与对照组比较，·p＜0.05··p＜0.01表3“康尔健”对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血心电图的影响(x±s，mv)n＝10，与对照组比较，·p＜0.05··p＜0.01由表2、3可见，“康尔健”各剂量组及“康尔健”(缺二醇皂甙)组大鼠给药后对垂体后叶素所致的急性心肌缺血有明显的保护作用，减轻心肌缺血损伤程度，缺二醇皂甙组亦有减轻心肌损伤程度，但与“康尔健”组比较差异明显，“康尔健”组疗效显著超过缺二醇皂甙。(见说明书附图第3页图11-图15)垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌缺血坏死形态学观察及对照康尔健组存活大鼠(心肌细胞正常)显微照片5张。图11垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌细胞断裂；图12垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌细胞肌浆凝聚；图13垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌细胞肌浆凝聚；图14垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌缺血坏死；图15垂体后叶素引起大鼠心肌缺血缺氧(死亡)康尔健高剂量(500ml/kg)组存活大鼠(心肌细胞正常)显微照片2.3对异丙肾上腺素引起心肌缺血小鼠生存时间的影响：取健康昆明种小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为5组，按表4所示剂量分组给药，连续ig给药7d，末次给药后30min，ip异丙肾上腺素20mg/kg，15min后将小鼠放入250ml三角烧瓶内塞紧橡皮塞，记录每只小鼠从入瓶到死亡的时间，结果见表4。表4“康尔健”对异丙肾上腺素引起心肌缺血缺氧小鼠生存时间的影响(x±s)与异丙肾上腺素对照组比较：·p＜0.05··p＜0.01结果表明，“康尔健”各剂量组均能明显延长小鼠生存时间，与对照组比较有显著性差异。心肌梗死的病理基础是心肌部分心肌细胞的不可逆性坏死，这主要是由于心肌组织代谢和血营养成分及氧气的供应不平衡所致，使心肌严重而持久地急性缺血导致心肌不可逆的坏死即为梗死。心梗范围是影响心功能的主要基础。如心梗范围大，心肌收缩力减弱，心输出量降低，左心室舒张末期压和容积量增加，因此，缩小心梗范围是治疗急性心肌梗死的主要途径之一。也是评价抗心肌缺血药物的主要疗效指标。康尔健能剂量依赖性地抗大鼠冠脉结扎引起的心肌梗死，明显缩小梗死范围，明显保护大鼠急性心肌缺血，康尔健各剂量组对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血有明显的保护作用，而且缺西洋参二醇皂甙差异显著；与康尔健之间疗效明显差异，康尔健剂量对异丙肾上腺素引起心肌缺血缺氧小鼠均能明显延长小鼠生存时间，与对照组比较有显著性差异。有效成分协同增效显著；为处方设计合理性，提供科学依据。证明该药抗心肌缺血作用明显，为临床防治冠心病、心绞痛等疾病奠定了坚实基础。参考文献1.李连达，等新医学杂志，1978，(7)；3452.徐叔云，等.药理实验方法学(第二版).北京：人民卫生出版社，1994：938药效学研究5本实验旨在从血流动力学及心肌氧化谢探讨“康尔健”的抗心肌缺血作用机制。——减少左心室作功，降低心肌耗氧量，增加心肌供血，改善心肌代谢。1、实验杂种犬，体重(13.8±2.5)kg30只，**兼用，随机分为5组，每组6只。空白对照组，lad不结扎，给生理盐水4ml·kg-1；梗死对照组，lad结扎，给生理盐水4ml·kg-1；阳性药物组，lad结扎，给维拉帕米(ver)2mg·kg-1；“康尔健”小、大剂量组，lad结扎，分别康尔健，10、20mg·kg-1，注射容积为4mg·kg-1。试验时戊巴比妥钠30mg·kg-1iv麻醉。颈部切开气管插管，连人工呼吸机维持正常通气。右劲总动脉插管，经压力换能器接ap-621g载波放大器记录动脉血压(map)。分离右侧股动脉，切开插入8#心导管至左室腔内，连压力换能器接ap-621g载波放大器，记录左室内压(lvp)，并测定左室舒张期末压(lvedp)及左室内压变化最大速率(+dp/dtmax)。于左第4肋间开胸，打开心包膜做悬床，充分暴露心脏。分离升主动脉，安置适宜内径电磁流量计控头，接mf-27型电磁流量计记录每分钟血流量作为输出量(co)。分离冠状动脉左旋支根部，以适宜内径电磁流量计探头记录冠脉血流量。分离lad以备结扎。记录ii导联心电图，同时监测心率(hr)。术后稳定20min，在rm-6000型多道生理记录仪上同步记录诸指标为给药前数据。结扎lad，立即用多通道电子蠕动泵静脉输注120min。给药5，10，30，60，120，180，240，300，360min重复记录上述各项指标。于结扎前及结扎后60，120min分别从冠状静脉窦及左股动脉同时取血，用corning178型血气分析仪测定动、静脉血氧，计算心肌耗氧量、心肌氧利用率及心肌耗氧指数。按文献通用公式计算心肌血流量(mbf)、冠状血管阻力(cvr)、总外周阻力(trp)、心脏指数(ci)、心博指数(si)及左室作功指数(lvmi)。实验数据x±s表示，以给药前后差值变化百分率进行组间t检验分析。2、结果2.1康尔健对急性心肌梗死犬血流动力学的影响空白对照组于lad结扎6h内血流动力学无明显改变。梗死对照组可见hr减慢，map下降，心肌舒、缩功能明显减弱，lvwi，co，ci，si明显降低，lvdep，tpr明显升高。各指标变化随时间延长逐渐加重康尔健10，20mg.kg-1于lad结扎60min可见hr明显减慢，map，lvp，+dp/dtmax，lvwi及tpr明显降低，而si及ci明显增加，且-dp/dtmax的降低幅度及lvedp的升高幅度均明显减少，约120～180min达高峰，结果与维拉帕米组类似(表1，2)。2.2康尔健对急性心肌梗死犬冠脉循环的影响空白对照组于lad结扎6h内mbf，cvr无明显改变。梗死对照组可见mbf明显降低，cvr增加。康尔健两剂量组均能明显增加mbf，降低cvr，与梗死对照组比较差异显著(见表3)。2.3康尔健对急性心肌梗死犬氧代谢的影响与梗死对照组比较，康尔健两剂量组均能显著降低急性心肌梗死犬心肌耗氧量、心肌氧摄取率及心肌耗氧指数(见表4)。3、讨论本实验结果表明，康尔健对急性心肌梗死犬能明显减慢hr，降低map，lvp，+dp/dtmax，lvwi及tpr，提示可减少左室作功，降低心肌氧耗，有利于缩小心肌梗死面积。现已知，心内膜血流供应主要取决于左室舒张期压力。本实验证实，康尔健能明显减慢hr，使舒张期延长，延长心内膜供血时间；加之可减少lvedp的升高幅度，降低左室舒张期内压，亦可增加心内膜心肌供血；此外，康尔健还可增加mbf，降低cvr，从而改善缺血区血流供应。有文献报道，急性心肌缺血发生较早、程度较严重的病理生理变化是左心室舒张功能的损伤，即-dp/dtmax降低。同时，心肌缺血时lvedp升高，使缺血心肌的顺应性降低，舒张期心肌血流灌注压差减小，导致严重的心内膜下心肌缺血。康尔健能使心肌梗死后lvedp的升高幅度及-dp/dtmax的降低幅度均明显减少，不仅使前负荷降低，心肌灌注增加，还可增加心肌顺应性，保护缺血心肌的舒张功能，有助于改善心功能或延缓心力衰竭的发生。此外，康尔健可明显减少心肌耗氧量及心肌耗氧指数，亦能明显降低心肌氧利用率，提示康尔健不仅通过影响心脏血流动力学，降低心肌耗氧量，还可通过改善心肌氧的供求关系，提高心脏的工作效率。目前认为，抗心肌缺血药物主要是通过减少左室做功，降低心肌耗氧量，增加心肌供血和改善心肌代谢三个环节来发挥作用。康尔健在这三个环节上均能显示出较好的药理活性，表明其保护缺血心肌，缩小心肌梗死面积的机制是多途径综合利用的结果。表1康尔健对急性心肌梗死犬血流动力学的影响。n＝6，注：表内药后数据为给药前后差值变化百分率：与梗死对照组相比，1)p＜0.05，2)p＜0.01，3)p＜0.01表2康尔健对急性心肌梗死犬血流动力学的影响。n＝5，表3康尔健对急性心肌梗死犬冠脉循环的影响，n＝5，表4康尔健对急性心肌梗死犬冠脉循环的影响，n＝6，康尔健的药效学研究6降低血小板聚集，改变血液流变，调节血脂，提高pgi1。和txa2比值，抗动脉粥样硬化动脉粥样硬化是众多老年心、脑血管疾病(如：高血压、糖尿病、冠心病)的主要病理基础。由于增龄自由基对组织器官的损害有密切关系，自由基主要在线粒体内产生，它可与细胞的磷脂和蛋白质等发生脂质过氧化反应，损伤组织细胞，形成过氧化脂质，而其分解产物丙二醛(mda)与蛋白质的一级氨基因反应产生大分子交联，可形成脂褐素荧光物质。本研究主要观察“康尔健”对衰老大鼠心、脑、肝、血，消中脂质过氧化反应，对心、大脑中脂褐素荧光物和血脂的影响，对实验性高脂血大鼠心血.脂、血小板、6-酮-pgi1α和txa2的影响，研究证实“康尔健”不仅可以降低血小极聚集、调节血液流变性、调节脂代谢，提高血管内皮细胞代谢产物(pgi1α和txa2)比值，改善血浓、粘、凝、聚，同时是防治动脉粥样硬化作用的有效药物。1、材料和方法1.1实验动物wistar大鼠由上海中医药大学实验动物中心供给1.2仪器和试剂岛津uv-260分光光度计、液体闪烁计数仪(贝克曼公司)930荧光光度计(上海市仪器厂)、ppp电脑自动平衡血小板聚集仪spa-3型(上海市第一医科大学)、四乙氧基丙烷fluka865707、6一酮-pgi1α试剂盒、txa2试剂盒(均由中国科学院动物研究所制备)。1.3实验药物康尔健是经现代生物制剂技术提取其有效成分、经合理配伍，浓缩干燥，每包1000mg，制成的颗粒剂。(用时生理盐水配成需要的浓度)。1.4实验方法1.4.1对衰老大鼠脂质过氧化的影响wistar大鼠，24月龄，♀皆用，随机分为4组，每组10只。设正常对照组，“康尔欣”-a组、b组，阳性药对照组。“康尔欣”-a组按300mg·kg-1·d-1灌胃给药，“康尔欣”-b组按150mg·kg-1·d-1灌胃给药，阳性药组按3.5mg·只-1灌以ve，正常对照组灌以等容水。连续3个月，实验结束后，动物饥饿过夜，次日，戊巴比妥钠麻醉，心脏采血，分离血清，处死动物分离心、脑、肝。用tab法[4]测定心、脑、肝、血清mda的含量。取上述各组大鼠心肌、大脑各250mg，按soho[1]方法在em440nm和ex360nm波长处测荧光强度。1.4.2对衰老大鼠血脂的影响wistar大鼠，24月龄，♀皆用，每组10只，按血脂水平随机分为5组：老年对照组、青年对照组(6月龄)、“康尔欣”-a组、b组、阳性药对照组。给药剂量同1.1项下，阳性对照组按0.3ml·kg-1·d-1灌以月见草油。连续30日，实验结束后，尾巴采血，按常规方法分离血清。用高铁-硫酸显色法[4]测定血清总胆固醇(tc)、用洋地黄皂苷沉淀法[2]测血清游离胆固醇(fc)、用正庚烷-异丙醇混和液提取法[3]测定血清甘油三脂、用肝素比浊法[3]测定低密度脂蛋白(ldl-c)、用肝素-mn2+法[4]测定血清高密度脂蛋白(hdl-c)。1.4.3对实验性高脂血症大鼠血脂的影响wistar大鼠，18月龄，♀各半，每组10只，按tc水平随机分为5组，正常对照组、高脂模型对照组、“康尔欣”a组、b组、阳性药对照组。除正常组外，各组均以高脂饲料饲养(5％猪油、2％胆固醇、0.2％甲基硫氧嘧啶，加入基础饲料中至100g)给药剂量同1.1项下，阳性药按150mg·kg-1·d-1灌以月见草油。连续6周，实验结束停药2天，心脏采血，测定血脂(tc、fc、tg、ldl-c、hdl-c)(同上法)。1.4.4对实验性高脂血症大鼠血小板聚集和前列腺素的影响取实验1.3项大鼠血，按adp诱导血小板聚集法测血小板聚集；按放免法测定前列腺素(6-酮-pgi1α和txa2)。2、结果2.1.1对衰老大鼠心、脑、肝、血清脂质过氧化的影响“康尔欣”-a组、b组对衰老大鼠心、脑、肝、血清mda的含量有抑制作用(见表1)表1“康尔欣”对衰老大鼠心、脑、肝、血清脂质过氧化的影响(nm·g-1组织)与对照组比较2)p＜0.05，2＝p＜0.01。2.1.2对衰老大鼠脂褐素沉积的影响“康尔欣”-a组、b组对衰老大鼠脑和心肌的脂褐素的形成有抑制作用(见表2)表2“康尔欣”对衰老大鼠脂褐素沉积的影响(mg·g-1)与对照组比较1)p＜0.05，2＝p＜0.01。“康尔欣”-a组、b组大鼠心、脑、肝、血清mda的含量明显低于对照组，与ve组相似。对衰老大鼠脑和心肌的脂褐素的形成有抑制作用。2.2对衰老大鼠血脂的影响“康尔欣”能降低衰老大鼠的tc、fc、tg、ldl-c水平，同时升高其hdl-c的水平，与月见草油组相似(见表3)。表3“康尔欣”对衰老大鼠血脂的影响(±s，mmol·l-1)与青年组比较1)p＜0.01，与老年组比较2＝p＜0.05，3＝p＜0.01。结果发现老年组大鼠血清总胆固醇、血清游离胆固醇、血清甘油三酯、低密度脂蛋白明显高于青年组，而高密度脂蛋白低于青年组；”康尔欣”-a组、b组均可显著地降低衰老大鼠的tc、fc、tg、ldl-c的水平，而升高hdl-c的水平，与月见草油组相似。2.3对实验性高脂血症大鼠血脂的影响“康尔欣”能降低实验性高脂血症大鼠的tc、fc、tg、ldl-c水平，同时升高其hdl-c的水平，与月见草油组相似(见表4)。表4“康尔欣”对实验性高脂血症大鼠血脂的影响(x±s，mmol·l-1)与正常组比较1)p＜0.05与模型组比较2＝p＜0.053＝p＜0.014＝p＜0.001结果发现高脂血症模型对照组大鼠血清总胆固醇、血清游离胆固醇、血清甘油三酯、低密度脂蛋白显著高于正常对照组，而高密度脂蛋白显著低于青年组；“康尔欣”-a组、b组均可显著地降低高脂血症模型对照组大鼠的tc、fc、tg、ldl-c的水平，而升高其hdl-c的水平，与月见草油组相似。2.4对实验性高脂血症大鼠6-酮-pgi1α和txa2的影响“康尔欣”-a、b组均有抑制高脂血症大鼠血小板聚集的作用(见表5)。均可提高pgio2的分解产物6-酮-pgi1α的含量，降低txa2的含量，提高6-酮-pgi1α/txa2比值。(见表6)。表5“康尔欣”对实验性高脂血症大鼠血小板聚集的影响(x±s，)与正常组比较1)p＜0.05，2)p＜0.01，与对照组比较3)p＜0.05，4)p＜0.01。表6“康尔欣”对实验性高脂血症大鼠pgi1α和txa2的影响(±spg·ml-1)与正常组比较1)p＜0.05，与高脂血症比较2＝p＜0.05，3＝p＜0.01。综上实验发现“康尔欣”可以抗心、脑血管缺血、缺氧，可能通过以下几个方面有效地预防和治疗高脂血症和动脉粥样硬化的形成。(1)调节脂代谢。降低tc、tg、ldl-c的水平，升高hdl的水平。(2)降低血小板的聚集，使血液处于低聚状态。(3)提高血管内皮细胞代谢产物6酮-pgi1α的含量，降低血小板中txa2的含量，并通过维持pgi1/txa2的平衡，防止血栓的形成和动脉硬化的发生。参考文献：[1]sohol，r.s.etal.effeatofexperimentalprolongationoflifespan.onlipofuseionandlysosomalenzymeactivityinthebrainofhouseflyj.ofgerontologyvol，134489-4961979.[2]徐淑云，药理实验方法学(1994版第二版)北京：人民卫生出版社，1047.[3]《临床生物化学》高等临床教材[m](1983版)[4]大石诚子：过酸化脂质测定法[j]最新医学1978.33(4)：66康尔健的药效学研究7康尔欣对小鼠心肌营养性血流量的影响——及缺淫羊藿的药效研究本实验通过小鼠心肌86rb摄取率研究，观察康尔欣对小鼠心肌营养性血流量的影响，及康尔欣拆方研究(减去淫羊藿)；为康尔欣中淫羊藿总黄酮有协同增效作用提供科学依据。1、方法昆明种小鼠，雄性，体重22～24g，取50只雄性小鼠随机分为5组，康尔欣颗粒剂，(含淫羊藿总黄醇、人参二醇皂甙、水蛭多肽)及缺淫羊藿的不同配比，实验时以生理盐水配制成所需浓度。即：对照组，阳性药物(维拉帕米5mg/kg)组。实验药物缺淫羊藿(75mg/kg)组及康尔欣同等剂量组(75mg/kg)、大剂量组(150mg/kg)组，每组10只。每日均灌胃给药1次，连续5日；灌胃容积10ml/kg。末次药后30分经尾静脉注射86rbc1生理盐水溶液0.1ml/只(86rbc1为中国科学院原子能研究所提供，放射比强度166.7mci/g，试验时以生理盐水稀释成0.1ml，16000cpm/min)，在5分秒内匀速注毕。30秒后断头处死，取心脏，剪去心房并剪开心腔，常水冲净血液，滤纸吸干表面水分，放入含有2ml(2mol)hno3试管中，在沸水浴内消化。将消化液转至玻质样品盘中，置红外线灯下烘干，在fj-2101型y计数器自动测定放射强度，测定时间1分钟。以每只动物心脏测得放射性计数占注入总放射性的百分数为摄取率，再按下式计算心肌摄86rb的增减率，并用t检验进行组间统计分析。摄取86rb增减率(％)＝(给药物组摄取率一对照组摄取率)×100％2、结果结果表明，康尔欣可明显增加小鼠心肌86rb摄取率(p＜0、05或0、01＝。缺淫羊藿组亦有增加小鼠心肌86rb摄取率的趋势，但与对照组比较差异显著，提示康尔欣能增加心肌营养性血流量。阳性药物维拉帕米亦能明显增加小鼠心肌86rb摄取率(p＜0.01)，但与康尔欣之间无明显差异(p＞0、05)，结果见表1。表1康尔欣对小鼠心肌86rb摄率的影响(x±s，n＝10)剂量(mg/kg)86rb摄取量(cpm/min)摄取增减率(％)对照组-423±86-维拉帕米5523±79*+23.64康尔欣(缺淫羊藿)75487±76*+15.13康尔欣75516±91*+21.99康尔欣150537±84**+26.95与对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01冠状动脉血流除通过毛细血管为心肌提供营养血流外，还可经过动脉-静脉吻合支分流入静脉，两者构成冠脉总血流量。因此，测定心肌营养血流量较冠脉总血流量更有意义。86rb的化学生物特性与42k相似，对心肌有高度亲和力。在一定条件下，组织摄取86rb能力与组织血流量成正比。本实验结果证实，康尔欣可明显增加小鼠86rb摄取率，以150mg/kg剂量作用最显著.表明康尔欣能明显增加心肌营养性血流量；淫羊藿总黄酮在康尔欣中显示出处方设计合理性，有效活性成分之间有协同增效的作用。康尔健药效学研究8对老龄大鼠心肌缺血作用及其机制——多途径综合调控循环系统各种化学介质、提高内源性抗氧化酶活性、维持pgi1α/txa2比值本研究通过对老年大鼠急性心肌梗死模型，观察康尔健对mis，血清cpk及ldh活性的影响，以及康尔健对血清自由基代谢，心肌ffa及la代谢的影响，本实验结果表明，康尔健3个三个剂量组均能明显降低血清cpk，ldh活性，均能明显降低血中lpo含量，升高sod，cat，gsh-px活性。提示其可能通过抑制脂质过氧化过程，并提高内源性抗氧化酶活性而减轻氧自由基对心肌的损伤。康尔健3个剂量组均可明显降低心肌梗死区、非梗死区ffa及la含量，表明能纠正心肌缺血时ffa代谢紊乱，阻止ffa对心肌的损伤和la堆积。康尔健3剂量组可明显降低血浆txa2水平，并能明显维持pgi1α/txa2比值，提示康尔健可通过纠正pgi1α与txa2之间的平衡发挥抗心肌缺血作用。本研究显示康尔健保护缺血心肌，是通过对循环系统各种化学介质多途径作用的结果。是一种较理想的抗氧化、抗衰老、抗动脉硬化、抗心肌缺血药物。1、实验材料1.1药品与试剂“康尔健”是由中药组成的，经现代生物制剂技术提取其黄酮类有效成分，经合理配伍。氯化硝基四氮唑蓝(上海前进试剂厂)，6-酮-前列腺素pgi1α放免药盒及血栓素txa2放免药盒(中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所)。1.2动物wistar大鼠，24月龄，♀各半，(上海中医药大学实验动物中心)。2、方法2.1实验分组120只大鼠随机分为5组，每组24只。空白对照组，lad不结扎，iv生理盐水2ml·kg-1；梗死对照组，lad不结扎，iv生理盐水2ml·kg-1；康尔健小、中、大剂量组，lad结扎，分别iv康尔健12.5，25，50mg·kg-1。2.2缺血模型制备大鼠冠脉结扎按文献方法稍加改进，在乙醚麻醉下仰位固定于手术台，自左侧3-4肋间开胸，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠脉左前降支，以0号线立即结扎冠脉，将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，开胸时间不超过30s。假手术组仅置缝线而不结扎冠脉。各组动物在术后立即和6h分别舌下iv给药1次。2.3组织学观察待结扎冠脉24h后，以戊巴妥钠30mg·kg-1ip麻醉，每组一半动物腹主动脉插管取血，用cobas-fara自动生化分析仪测血清磷酸肌酸激酶(cpk)及乳酸脱氢酶(ldh)活性；取血后剖取大鼠心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称重，将左心室心肌横切4-5片，然后浸入氯化硝基四氮唑蓝(n-bt)磷酸绶冲液中，置37℃恒温水浴，待染色完全后取出，正常组织染色，缺血组织不染色。切下缺血心肌称重，用缺血心肌与左心室湿重的百分比计算梗死范围(mis)。2.4生化指标测定每组另一半动物腹主动脉插管取部分非抗凝血测血清脂质过氧化物(lpo)含量，超氧化歧化酶(sod)，过氧化氢酶(cat)谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性；另部分抗凝血分离血浆，用放免法测血浆6-酮-前列腺素f1a(pgi1α)、血栓素b2(txa2)活性。取血后剖取大鼠心脏，取缺血区及非缺血区心肌各100mg，用一次提取比色法测心肌游离脂肪酸(ffa)含量，用对羟基联苯法测心肌乳酸(la)含量。2.5统计学分析实验数据以x±s表示，用组间t检验进行统计分析。3、结果3.1“康尔健”对急性心肌梗死大鼠mis及血清cpk，ldh活性的影响。梗死对照组与空白对照组相比，mis及血清cpk，ldh活性明显增加，表明急性心肌梗死模型建成。“康尔健”12.5.25.50mg·kg3个剂量组均能明显缩小mis，降低，血清cpk，ldk活性，见表1。表1“康尔健”对急性心机梗死大鼠mis及血清cpk，ldh活性的影响。x±stba1effectof“康尔健”onmisandserumcpk，ldhactivityinacutemyocardialinfarctrats.x±s注：与梗死对照组相比，1)p＜0.05，2)p＜0.01，表2，3，4同note：1)p＜0.05，2)p＜0.01comparedwithinfarctcontrol，tab2，3and4arethesameastab13.2康尔健对急性心肌梗死大鼠血清lpo含量及sod，cat，gsh-px活性的影响梗死对照组与空白对照组相比，血清lpo含量明显增加，而sod，cat，gsh-px活性明显降低，表明急性心肌缺血可产生氧自由基引起心肌损伤。康尔健12.5，25，50mg·kg-13个剂量组均可显著降低血清lpo含量，并显著提高血清sod，cat，gsh-px活性，见表2。表2康尔健对急性心肌梗梗死大鼠血清lpo，sod，cat，gsh-px的影响，n＝9，x±stab2effectof“康尔健”onserumlpo，sod，catandgshpxinacutemyccardialinfarctrats.n＝9，x±s3.3康尔健对急性心肌梗死大鼠心肌ffa，la含量的影响梗死对照组与空白对照组相比，心肌梗死区、非梗死区ffa含量及梗死区la含量均明显增加，非梗死区的la含量有增加趋势，但与空白对照能相比无明显差异(p＞0.05)。康尔健12.5，25，50mg·kg-1组均可明显降低梗死区、非梗死区ffa水平及非梗死区la含量；康尔健25，50mg·kg-1组对梗死区la含量明显降低；康尔健12.5mg·kg-1组对梗死区la含量无明显影响，见表3。表3康尔健对急性心肌梗死大鼠心肌ffa，la含量的影响，n＝9，x±stab3effectof“康尔健”onmyocardialffaandlainacutemyccardialinfarctrats.n＝9，x±s，3.4“康尔健”对急性心肌梗死大鼠血浆pgi1α及txa2水平的影响梗死对照组与空白对照组相比，血浆txa2比值明显降低，表明急性心肌缺血可产生txa2，pgi1α水平，而12.5，25mg·kg-1组对血浆pgi1α水平无明显影响；txa2水平，并提高pgi1α/txa2比值，见表4。表4“康尔健”对急性心肌梗死大鼠血浆pgi1α及txa2水平的影响。n＝9，x±stab4effectof“康尔健”onplasmapgi1αtxa2levelinacutemyocardialinfarctrats.n＝9，x±s，4、综述本实验结果表明，“康尔健”3个剂量组均能明显降低血清ck，ldh活性，与其缩小mis相吻合，证实康尔健对缺血心肌具有保护作用，此结果与我课题组前期工作所得结果一致。心肌缺血时，不仅氧自由基生成增多，而且对自由基的清除能力减低，从而造成心肌组织中产生的自由基大量蓄积，引起心肌组织的严重损伤，其损伤程度可通过lpo含量变化及内源性抗氧化酶(sod，cat，gsh-px)活性变化间接评定。本实验结果表明，“康尔健”3个剂量组均能明显降低血中lpo含量，升高sod，cat，gsh-px活性。提示其可能通过抑制脂质过氧化过程，并提高内源性抗氧化酶活性而减轻氧自由基对心肌的损伤。急性心肌梗死时，血清中ffa水平明显增高。高ffa血症可增加心肌耗氧量而加重心肌缺血，扩大缺血或梗死范围，又可减弱心肌收缩力，诱发心律失常。此外，因冠脉血流量减少而不能清除代谢产物，使乳酸堆积，进一步减弱心功能。“康尔健”3个剂量组均可明显降低心肌梗死区、非梗死ffa及la含量，表明能纠正心肌缺血时ffa化谢紊乱，阻止ffa对心肌的损伤和la堆积，这可能也是“康尔健”保护缺血心肌的机制之一。心肌缺血时，动脉内皮受损，使主要产生于冠状动脉血管内皮细胞的pgi1α合成受干扰，血小板黏附于内皮下胶原组织，进一步释放以txa2为主的缩血管物质。txa2通过抑制腺苷酸环化酶，使血小板和血管平滑肌细胞内camp减少或作为ca2+载体直接促进ca2+内流和致密管道系统ca2+释放，从而促进血小板聚集和局部血管收缩，加重内皮损伤。因此txa2/pgi1α平衡失调是心肌缺血或心肌坏死的主要原因。“康尔健”3剂量组可明显降低血浆txa2水平，并能明显增高pgi1α/txa2比值，提示“康尔健”可通过纠正pgi1α与txa2之间的平衡发挥抗心肌缺血作用。综上所述，“康尔健”保护缺血心肌，缩小mis是通过对循环系统各种化学介质多途径综合调控作用的结果。本研究显示“康尔健”是一种抗动脉硬化、抗氧化、抗衰老、抗心肌缺血的药物，值得开发推广。参考文献[1]方允中，张嘉麟，刘智峰，等.几种血液病病人血液中谷光甘肽过氧代物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力观察[j].中华血液学杂志，1986，7(4)：220.[2]莫简.医用自由基生物导论[m].北京：人民卫生出版社，1989，：224.[3]brodygl，beldingwa，beldingm.theindentificationandde-lineationofmyocardialinfarcts[j].archpathol，1967，b4：312.[4]徐叔云.药理实验方法学[m].北京：人民卫生出版社，1982：933.[5]张龙祥.生化实验方法和技术[m].高等教育出版社，1981：282.[6]石湘云.血管活性物质与临床[m].北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：145.康尔健药效研究9对脑血流与脑缺血的作用增加脑血流量，降低脑血管阻力，抗脑缺血、缺氧心、脑缺血在各国(包括我国)是猝死、突发心、脑血管意外(中风)致残、致废的主因，其发病率逐年上升，严重威胁着中、老年人健康。心肌缺血可引起大脑一系列变化，包括脑血流量、脑功能、脑活动、脑细胞的某些结构的改变与此相反，大脑缺血可引起心功能活动甚至形态的改变。心肌不同部位缺血在脊髓和大脑特定的易受损的相应部位。心、脑相互关联。以动脉粥样硬化为基础，心与脑缺血互为因果。前期工作提示：“康尔健”扩张冠脉，降低血管阻力、抗心肌缺血、缺氧。本实验用麻醉兔以电磁流量计测量“康尔健”对脑血流的作用。结果表明：“康尔健”能显著增加脑血流量，降低脑血管阻力；用筒箭毒处理的大鼠，停止人工呼吸，在缺氧、缺血条件下“康尔健”能使脑电图消失的时间延缓，对脑缺氧有保护作用，表明在脑缺血、缺氧的时候，对脑细胞有保护作用。1、实验材料1.1仪器日本光电公司rm-46型生理多导仪；日本光电公司mf-27型电磁流量计；浙江医大d-h-i动物人工呼吸机。1.2品与试剂“康尔健”是由中药经现代生物制剂技术提取其有效成分、经合理配伍，浓缩干燥，每包1000mg，制成的颗粒剂。(用时生理盐水配成需要的浓度)。氯化筒箭毒注射液d-tubocurine(上海第十制药厂、批号993145)。1.3动物杂种兔，大鼠wistar购白求恩医大实验动物中心2、方法2.1“康尔健”对兔脑血流的作用对兔脑血流的作用兔25只，体重1.8～3.5kg，雌雄均用，乌拉坦1g/kg静脉注射麻醉，分离颈总动脉，结扎颈外动脉，颈总动脉卡口径适宜探头，连接于电磁流量计测血流量.分离股动脉插入vp0.5型血压换能器导管，连接于生理多导仪，记录股动脉血压，待血流血压稳定后，给药观察，记录其他变化，实验后取出脑称量，计算每100g脑重/每分血流量和脑血管阻力。随机分3组：潘生丁对照组，“康尔健”组，生理盐水组。静脉注射“康尔健”3mg/kg能显著增加脑血流量，比给药前增加72.4％。脑血管阻力也明显降低。表1康尔健对麻醉兔脑血流的作用n＝5；··p＜0.01康尔健对大鼠脑缺氧作用大鼠190～250g，24只，雌雄均用，乙醚麻醉，插入气管套管，备人工呼吸.颅骨十字缝旁2mm，前后各4mm处用不锈钢电极，双极引导皮层电图(ecog)，同时用针形电极插入四肢皮下，记录标i导联心电图(ecg)。术后腹腔注射氯化筒箭毒，待呼吸停止.人工呼吸机维持呼吸：关闭人工呼吸机，大鼠呼吸停止，缺氧，立即记录脑电图消失时间，停止呼吸后心律减慢，出现心律不齐，脑电消失时间减去心律减慢1/2时间即脑缺氧时间。表2“康尔健”对大鼠脑缺氧的保护作用n＝8；x+sd；*p＜0.05；**p＜0.01结果脑电消失时间为(44.6±7.34)s，较生理盐水对照延长373％，现心律不齐时间，延长35.16％3、结果静脉注射“康尔健”3mg/kg能显著增加脑血流量，比给药前增加72.4％，以上作用显著(p＜0.05)，脑血管阻力也明显降低.结果脑电消失时间为(44.6±7.34)s，较生理盐水对照延长373％，出现心律不齐时间延长35.16％见表1，2。本实验用静脉注射“康尔健”在血压基本平稳稍有下降的情况下，脑血流量明显增加，有显著延长脑电图消失时间，对常压耐缺氧有一定保护作用。“康尔健”有扩张脑血管，降低血流阻力，增加脑血流量的作用，为治疗心、脑血管系统老年病奠定基础。“康尔健”药效学研究10对培养大鼠肌细胞钙通道阻断作用与异搏定相似、抗心律失常我们前期工作发现“康尔健”对大鼠培养心肌细胞氧化损伤具有保护作用。本研究主要观察“康尔健”对培养大鼠心肌细胞动作电位的波幅、波宽、阈电位、最大舒张电位，最大除极速度及复极50％水平的动作电位波宽。与二氧化锰(0.1μg/ml)和异搏定(1μm0l/l)比较可产生相似作用。钙离子(200mmol/l)可翻转“康尔健”(300μg/ml)的作用，初步观察表明，该药具有钙通道阻断作用。1、材料和方法1.1心肌细胞培养在无菌条件下，取出生后24-48hwistar大鼠心室肌。用0.1％胰蛋白酶机械搅拌的方法分离心肌细胞，置入体积50ml，底面积25cm2的聚苯乙烯培养瓶(德国greieerlobortechnikinc)，在36.5℃，5％co2+95％的空气的二氧化碳孵箱内进行培养，每2d更换培养基，培养基同80％dmem(美国lifetechnolongiesinc)与20％小牛血清(本课题组自制)组成。1.2电位记录打开培养瓶上壁，在培养基上置一层液体石蜡以保持ph7.2，36.5℃的细胞外环境。用常规微电极电生理技术导出心肌细胞动作电位，经微机(appleplus博士818程序)联机分析以下电位参数；动作电位波幅(apa)、超射(os)、最大舒张电位(mdp)、电位ctp)最大除极速度(vmax)、复极50％水平的动作电位波宽(apd50)。1.3给药将培养心肌细胞于培养的第6-8d按上述方法记录各项电参数变化。自每个培养瓶中随机抽样5-10个细胞簇，先记录正常心肌细胞动作电位，然后向培养瓶内加入“康尔健”二氯化锰、氯化钙、异搏定。给药后稳定5-10min，再记录各电位参数。“康尔健”有效成分纯度＞60％，由本课颗组提取，使用前用生理盐水配成5％的水溶液。给药后的洗脱用脱用培养基冲洗3次。2、结果2.1“康尔健”对培养心肌细胞动作电位的作用与对照组比较，“康尔健”3个剂量组中，100μg/ml作用不明显，而300、500μg/ml可见心肌细胞动作电位参数呈均一性减小，3次洗脱后重又记录，可见各项电参数恢复正常，见表a。“康尔健”(300μg/)和钙对培养心肌细胞动作电位的作用2.2实验时，先行记录正常心肌动作电位各参数后，向培养瓶内加入康尔健(300μg/ml)记录给药后变化，然后再向瓶内加入氯化钙，终浓度为200mmoll，如表中所示，氯化钙可翻转其抑制作用，使各项电参数一致性增大，说明增加培养心肌细胞外钙浓度可对抗康尔健的作用。见表b。附表“康尔健”氯化锰和异博定对培养心肌细胞动作电位的作用(x±s)d1：康尔健100μg·ml-1；d2：康尔健300μg·ml-1；d3：康尔健500μg·ml-1；d+ca2+康尔健300μg·ml-1+ca2+；200mol/l；mncl2；0.1μg·ml-1；ver：异博定1μml/l；p值均为与对照组比较2.3二氯化锰和异搏定对培养心肌细胞动作电位的作用在上述同样实验方法和条件下，我们同时观察了2种具有钙通道阻断作用的药品，结果二氯化锰(0.1μg/ml)，异搏定1μgmol/l均可明显抑制培养心肌细胞的电参数。康尔健(500μg/ml)与上述药物比较，其动作电位波幅、波宽等大致相同。见表c。3、综述我们在前期工作中发现，康尔健可剂量依赖性抑制豚鼠乳头肌的收缩力(刺激频率为1hz)，增加浴槽内营养液的钙浓度可对抗康尔健的作用，提示康尔健可能具有钙通道阻断作用。在培养的大鼠心肌细胞中，呈现自发性搏动的细胞是慢反应自律细胞，其动作电位0相除极化、2期平台形成及4期自动除极都决定于钙离子的内流。在心肌细胞膜损伤与钙通道阻滞时都可能发生培养心肌细胞所有电参数一致减小。但膜损伤过程发生较慢，而本实验中的电参数减小却是康尔健的即时效应，并且在洗脱后立即恢复，提示其电变化可能因钙通道阻滞所致。另外，提高细胞外钙的浓度能翻转钙通道阻滞剂的作用，因为钙和钙通道阻滞剂竞争结合位点，又可使未被阻滞的钙通道部分的电化学驱动力增大。本实验ca2+可翻转康尔健的作用，又为康尔健具有钙通道阻断作用提供了实验依据。附图说明图1、淫羊藿总黄酮高效液相色谱图；图2、西洋参总皂甙高效液相色谱图；图3、益母草总生物碱高效液相色谱图；图4、淫羊藿甙、朝藿定c、朝藿定b、朝藿定a、宝藿甙高效液相色谱图；图5、西洋参特征成分人参二醇组皂甙-rb1、-rb2、-rb3、-rd、-rc高效液相色谱图；图6、盐酸水苏碱对照品hplc图；图7、益母草中、水苏碱高效液相色谱图；图8、康尔健对皮质酮-大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的形态学对照组图片a1-a6；图9、康尔健对皮质酮-大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的形态学模型组图片b1-b6；图10、康尔健对皮质酮-大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的形态学康尔健组图c1-c6；图11-图15垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌缺血坏死形态学观察及对照康尔健组存活大鼠(心肌细胞正常)显微照片5张图11垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌细胞断裂；图12垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌细胞肌浆凝聚；图13垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌细胞肌浆凝聚；图14垂体后叶素引起大鼠(死亡)心肌缺血坏死；图15垂体后叶素引起大鼠心肌缺血缺氧(死亡)康尔健高剂量(500ml/kg)组存活大鼠(心肌细胞正常)显微照片。当前第1页12