单碘代芳香酸作为CVB3病毒抑制剂的应用的制作方法

本发明涉及抗病毒药物技术领域，具体是指一种单碘代芳香酸作为柯萨奇病毒抑制剂的应用。

背景技术：

柯萨奇病毒(coxsaekievirus，简称cv)是小核糖核酸病毒(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)成员，其感染可引起多种疾病，如手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、流行性肌炎、疱疹性咽峡炎等。已报道的cv共有29个血清型，根据其对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，可将其分为a和b两组，即cva(cva1-22,24)和cvb(cvb1-6)。以cvbs的感染最为常见，其中cvb3是cvb六个血清型中致病性最强的一型，是病毒性心肌炎最主要的致病原因。据美国疾病预防控制中心(cdc)统计数据发现，cvb(1-6型)每年可导致约500万人患肠道系统疾病，其中10％-20％是由cvb3引起的急性心肌炎。近年来cvb3引起手足口病的趋势也在上升，在我国也有很多cvb3引发疾病流行的报道。目前对于柯萨奇病毒感染无特效药物，临床尚无有针对性的治疗手段。很多研究者找到了众多在体内外具有抑制cvb3活性的化合物，但是这些基本还处于实验室试验的初级阶段，距离在临床上的实际应用还比较遥远。因此开发特异有效的抗cvb3药物势在必行。

碘代芳香酸是一类具有生物活性的有机化合物。例如对碘苯甲酸是肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate4-hydroxylase)的有效抑制剂，肉桂酸-4-羟化酶是类苯基丙烷途径合成木质素构筑单元的关键酶(dorienvandewouwer,et.al.plantphysiology,2016,172,198-220)；间碘苯甲酸的金属盐对酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌均表现出较好的抑制活性(p.koczon,et.al.j.agric.foodchem.2001,49,2982-2986)。如2,3,5-三碘苯甲酸(tiba)是一种优良的植物生长调节剂(颜季琼,et.al.植物生理通讯,1958,3,27-30)。3,5-双(乙酰氨基)-2,4,6-三碘苯甲酸，又称为泛影酸(diatrizoicacid)，是一种重要的照影剂，配制成泛影钠、泛影葡胺注射液,可用于泌尿系、心血管、脑血管及周围血管的造影(icharles,et.al.1986,us4567034)。然而含碘羧酸的抗病毒活性，包括对于cvb3病毒的抑制活性到目前却未见报道。

因此，寻找具有抗cv活性尤其是抗cvb3活性的含碘羧酸是cv病毒抑制剂的一个新的研究方向。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，开发新的特异有效的抗cvb3药物。本发明通过无数次筛选实验，并通过大量的生物学实验验证，发现单碘代芳香酸能够抑制cvb3在宿主细胞hep-2产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率，对cvb3表现出抑制作用，治疗指数高，提示其有潜力进一步发展成为有效治疗cvb3感染的药物。基于该发现，本发明提供一种单碘代芳香酸的应用。

本发明提供一种单碘代芳香酸作为cv病毒抑制剂的应用，该单碘代芳香酸包括l1、l2、l3，其中l1为2-碘苯甲酸，l1的结构式如下：

l2为3-碘苯甲酸，l2的结构式如下：

l3为4-碘苯甲酸，l3的结构式如下：

优选地，cv病毒为b3亚型，即cvb3病毒。

优选地，所述单碘代芳香酸为l2或l3，即3-碘苯甲酸或4-碘苯甲酸，更优选地，所述单碘代芳香酸为l3，即4-碘苯甲酸。

进一步地，单碘代芳香酸作为cvb3病毒抑制剂的应用包括单碘代芳香酸即2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、4-碘苯甲酸在制备抗cvb3病毒的药物中的应用。

进一步地，单碘代芳香酸作为cvb3病毒抑制剂的应用还包括2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、4-碘苯甲酸中的任意一种、任意两种或三种与利巴韦林的联用。

进一步地，单碘代芳香酸作为cvb3病毒抑制剂的应用还包括l1、l2、l3，即2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、4-碘苯甲酸中任意两种或三种的联用。

本发明还提供一种抗cvb3病毒的药物，包括l1、l2、l3，即2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、4-碘苯甲酸中的一种、两种或三种。

优选地，本发明还提供一种抗cvb3的药物，包括l1、l2、l3，即2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、4-碘苯甲酸中的一种、两种或三种。

进一步地，上述药物还包括药剂学可接受的辅料和载体。

更进一步地，上述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

本发明的有益效果在于：

1、单碘代芳香酸，即l1、l2、l3能够抑制cvb3在宿主细胞hep-2产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率，大幅降低子代病毒产量，且有较高的治疗指数。

2、单碘代芳香酸，即l1、l2、l3对于cvb3有显著的抑制作用，具有比利巴韦林更好的抗cvb3病毒效果，但化学结构与利巴韦林完全不同，很可能具有与利巴韦林完全不同的作用机制。

3、单碘代芳香酸为非核苷类药物，结构简单，易于合成。

4、单碘代芳香酸有潜力进一步发展成为有效治疗cvb3感染的药物。

附图说明

图1为不同浓度的单碘代芳香酸l1、l2、l3对于cvb3作用的hep-2细胞存活率影响的结果图；

图2为l3对于cvb3引起的hep-2细胞cpe的抑制效应图。

图3为l3对于cvb3子代病毒产量抑制作用的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

l1、l2、l3均通过商购获得。

实施例1：单碘代芳香酸l1、l2、l3对宿主hep-2细胞的毒性

将hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别添加含不同浓度l1、l2、l3的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，mtt法测定细胞存活率。mtt法具体步骤为：每孔加入mtt30μl(5mg·ml^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入50μl的dmso溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(od492值)。

用spss11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(mediancyctoxicconcentration，cc50)。

细胞存活率＝(药物组平均od492值/细胞对照组平均od492值)×100％

实施例2：单碘代芳香酸l1、l2、l3对cvb3的抑制活性

将hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100tcid50的cvb3病毒液感染细胞1h，分别加入不同浓度(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)的化合物l1、l2、l3(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，显微镜下观察细胞病变效应(cpe)。cpe的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

cpe观察完毕后，利用mtt方法检测药物对cvb3的抑制率。具体步骤为：每孔加入mtt50μl(5mg·ml^-1)，孵育3～4h后去掉上清液，加入等体积的dmso溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(od492值)。

用spss11.5软件计算药物的半数有效浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)。

利用如下公式分别计算单碘代芳香酸l1、l2、l3对cvb3的抑制率。

单碘代芳香酸l1、l2、l3的治疗指数(ti)

ti＝cc50/ec50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

结合细胞病变效应分析和mtt测定细胞存活率检测方法，分别对单碘代芳香酸l1、l2、l3对抗cvb3活性进行评估，结果见表1、图1和2。

单碘代芳香酸l1、l2、l3的细胞毒性及抗cvb3活性测试结果如表1所示。

表1单碘代芳香酸l1、l2、l3的细胞毒性及抗cvb3活性

浓度依赖的单碘代芳香酸l1、l2、l3对于cvb3作用的hep-2细胞存活率的影响如图1所示。结果表明，本发明检测到除单碘代芳香酸l1外，l2、l3对于cvb3都有一定的抑制活性，其中l3表现出最好的抑制效果，优于阳性对照化合物利巴韦林，具有比利巴韦林更高的治疗指数。

单碘代芳香酸l3抑制cvb3引起的hep2细胞cpe效应如图2所示。cvb3感染的hep-2细胞变圆，从细胞板壁脱离，而50μg/mll3处理的cvb3感染的hep-2细胞生长状态良好，接近于无病毒感染的细胞对照组形态特征。说明l3对于cvb3感染引起的细胞病变有很好的抑制作用，l3表现出优良的抗cvb3活性。

实施例3：单碘代芳香酸l3对cvb3子代病毒产量的抑制

对数生长期的hep-2细胞铺板24孔板，长满单层后100tcid50cvb3感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，pbs洗涤三次，分别加入含50μg/mll3的细胞维持液。分别在12h和36h收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，tcid50方法测定cvb3病毒滴度。

结果如图3所示，cvb3病毒对照组在感染12h已经呈现出明显的病毒滴度，直到感染36h，病毒滴度迅速上升，提升约3.0log。而50μg/mll3处理组的病毒滴度在同等时间条件下均低于病毒对照组，从病毒感染的12h到36h的时间段内，上升幅度较小，在36h时表现出最强的抑制作用。说明这些化合物可以强烈抑制病毒在细胞内的复制增殖。

综上所述，苯甲酸有机衍生物l2、l3具有较强的抑制cvb3活性，包括抑制cvb3病毒引起的hep-2细胞病变效应，大幅降低子代病毒产量，且有较高的治疗指数，优于对照药物利巴韦林。说明这两种化合物有潜力在制备临床上有效对抗cvb3感染药物中应用。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。