序列特异性体内细胞靶向的制作方法

交叉引用本申请要求于2018年4月3日提交的第62/652,150号美国临时申请、2018年8月29日提交的第62/724,199号美国临时申请和2018年3月27日提交的第kr10-2018-0035298号韩国专利申请的权益，所述申请均为了所有目的通过引用整体并入本文。
背景技术：
：为了降解或细胞死亡而靶向特定细胞仍然是一个挑战。癌细胞群体或病原体细胞群体通常难以在不影响非病变宿主细胞群体的情况下靶向。因此，特别是对于虚弱的个体，以及对于通常患有或被确定为患有某种病况的个体，治疗方案会带来负面的健康后果，这些后果可能有害或可能负面地影响治疗方案的功效。技术实现要素：本文提供了与核酸靶向有关的实施方案，其用于改善健康、减轻病症的至少一种症状、降低病原体负荷，或靶向特定细胞如癌细胞以供选择性消除。本文的方法和组合物涉及特定核酸分子的选择性靶向，以用于核酸内切和核酸外切降解。靶核酸通过指导核酸分子，如crispr或其他核蛋白复合物中的指导核酸分子，经由碱基配对来鉴定。切割靶核酸以引入双链断裂。然后，通过核酸外切活性，例如与核蛋白复合物的蛋白质组分相关或融合的核酸外切活性，促进靶核酸降解，这导致核酸从核酸内切引入的切割位点选择性地降解。另外，通过crrna指导的序列特异性内切核酸酶活性诱导crispr或其他核蛋白复合物的非特异性外切核酸酶活性，从而非选择性降解细胞dna/rna分子。进一步的概述部分地通过参考下面列出的权利要求而获得。在各个方面，本公开提供了一种选择性诱导细胞中的细胞死亡的方法，该方法包括：a)向有需要的受试者施用嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域、包含与所述细胞中的靶核酸互补的序列的指导核酸；以及b)切割所述靶核酸，从而诱导细胞死亡。在一些方面，所述靶核酸与病症相关。在一些方面，所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。在一些方面，所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。在一些方面，所述靶核酸包含与癌症相关的序列。在一些方面，所述靶核酸包括rna。在其他方面，所述靶核酸包括dna。在一些方面，所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。在一些方面，所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环、拷贝数变异、插入缺失和等臂染色体。在一些方面，所述细胞在多个细胞中。在进一步的方面，所述多个细胞包含健康细胞。在一些方面，在施用后，健康细胞存活。在一些方面，在施用后，健康细胞增殖。在一些方面，所述切割包括在所述细胞中的一个或超过一个切割位点处切割。在一些方面，所述靶核酸与病症相关。在一些方面，所述癌症包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或宫颈癌。在一些方面，所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性、易位或与癌症进展相关的序列。在一些方面，所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl、her2、kif5a、irx1、adamts16、gnpda2、kcne2、slc15a5、smim11、dach2、herc2p2、cd68shbg、erbb2、krt16、linc00536、trps1、cdk8、trappc9、herc2p2、sirpb1、mrc1、atp11a、poteb、herc2p2、prdm9、cdkn2b、hpv、line2(mt2)、ccr5或hprt1。在一些方面，所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。在一些方面，所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。在一些方面，所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域、cas12a结构域、cas12b结构域、cas12c结构域、cas12d结构域、cas12e结构域、cas12f结构域、cas12g结构域、cas12h结构域、cas12i结构域、cas13a结构域、cas13b结构域、cas14结构域或cas9结构域。在进一步的方面，所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。在其他方面，所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。在另外其他方面，所述第一结构域包括cas9结构域。在一些方面，所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。在一些方面，所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。在一些方面，所述嵌合多肽产生3’oh突出端。在一些方面，所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。在一些方面，所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。在一些方面，所述第二结构域包含绿豆核酸酶。在一些方面，所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。援引并入本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入，包括2018年3月27日提交的韩国专利申请kr10-2018-0035298，其通过引用整体并入本文。附图说明通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得一些理解，在这些附图中：图1显示了crispr/cas复合物单链和双链核酸内切核酸酶和外切核酸酶活性的示意图。图2显示了crisper/cas对靶和非靶核酸底物的活性的示意图。图3描绘了体外核酸酶活性测定结果。图4显示了体内毒性测定结果。图5显示了具有嘌呤霉素抗性的用于spcas9和sgrna转染的px459质粒载体系统。px459质粒载体图谱来自https://www.addgene.org/62988/。spcas9和sgrna在bbsi酶切割后和插入靶序列dsdna寡核苷酸后表达。图6a-6b显示了在靶向拷贝数变异的px459质粒dna的氖电穿孔后六天，cas9指导rna在egfr突变肺癌细胞系hcc827中引起的多切割诱导和细胞死亡。图6a显示了细胞的图像，其从左到右是以下处理：仅电穿孔脉冲而没有任何载体(对照)，用靶向野生型egfr序列的载体进行电穿孔(对照)，以及用靶向突变序列的载体进行电穿孔。图6b显示了上述每种处理后的细胞数的条形图。图7显示了确认图8中每个样品的细胞形态的显微数据。在针对nt1、ccr5和hprt1基因座的处理中，许多细胞存活。在针对mt2、smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2基因座的处理中，大多数细胞死亡。图8显示了每个处理组中的细胞活力的图示，包括针对nt1、ccr5、hprt1、mt2、smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2基因座的处理。图9显示了在靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染后的细胞活力数据，所述基因座包括lipo(仅lipofectamine)、nt1、ccr5、hprt1、mt2、gnpda2、slc15a5和kcne2。图10显示了靶向nt1(阴性对照，在人类基因组中没有匹配序列)和gnpda2的crispr/cas9构建体的亮视野图像和荧光显微术图像。图11显示了在靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染后的细胞活力数据，所述基因座包括ccr5、hprt1、mt2、irx1和adamts16。图12a-12b显示了在靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染后的细胞活力数据。图12a显示了使用细胞滴度glo测定，在转染后24h、42h和72h，用靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染细胞后的细胞活力数据，所述基因座包括仅脉冲、nt1、hprt1、ccr5和mt2。图12b显示了通过细胞计数，用靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染细胞后的细胞活力数据，所述基因座包括仅脉冲、nt1、hprt1、ccr5和mt2。图13显示了用靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染后的细胞的亮视野图像，所述基因座包括仅脉冲、nt1、hprt1、ccr5和mt2，箭头指向活细胞集落。图14显示了在电穿孔后的24hr、44hr和51hr，用靶向不同基因座的crispr/cas9构建体转染细胞后的细胞活力数据，所述基因座包括仅脉冲、pet21a、mt2、cd68、dach2、herc2p2、shbg和无脉冲。图15a-15c显示了具有全基因组序列数据的sk-br-3中erbb2的重复区域。图15a显示了来自nattestad等人的sk-br-3erbb2区域wgs数据。图15b显示了来自nattestad等人的sk-br-3erbb2cnv数据。图15c显示了由nattestad等人推断的sk-br-3erbb2cnv接合序列。图16a-16b显示了用针对不同基因座的crispr/cas9构建体对细胞进行电穿孔的数据。图16a显示了用靶向不同基因座的crispr/cas9构建体对细胞进行电穿孔的数据。样品包括仅脉冲、nt1、mt2、erbb2、krt16和无脉冲。图16b显示了与图16a相关的原始数据。图17显示了用靶向不同基因座的crispr/cas9构建体对细胞进行电穿孔的数据。样品包括仅脉冲、nt1、hprt1、mt2、erbb2和krt16。图18a-18c显示了hela重复序列。图18a显示了来自adey,a.等人,thehaplotype-resolvedgenomeandepigenomeoftheaneuploidhelacancercellline.nature500,207–211(2013)的hpv和hela细胞整合数据。图18b显示了从meissner,j.d.nucleotidesequencesandfurthercharacterizationofhumanpapillomavirusdnapresentinthecaski,sihaandhelacervicalcarcinomacelllines.j.gen.virol.80,1725–1733(1999)，landry,j.j.m.等人.thegenomicandtranscriptomiclandscapeofahelacellline.g3:genes|genomes|genetics3,1213–24(2013)，adey,a.等人.thehaplotype-resolvedgenomeandepigenomeoftheaneuploidhelacancercellline.nature500,207–211(2013)以及liu,y.,lu,z.,xu,r.&ke,y.comprehensivemappingofthehumanpapillomavirus(hpv)dnaintegrationsitesincervicalcarcinomasbyhpvcapturetechnology.oncotarget7,5852–5864(2016)推断的hela细胞中的hpv序列数据。图18c显示了基于meissner等人、landry等人、adey等人和liu等人，在hela细胞中为hpv序列之间的重复区域的pcr产物的电泳凝胶图片。图19a-19b显示了靶向helacnv或hpv基因后的hela细胞死亡。图19a显示了用靶向ccr5、mt2和prdm9的cripsr/cas9对细胞进行电穿孔后的活细胞数。图19b显示了用靶向ccr5、mt2、prdm9和hpv_1的cripsr/cas9对细胞进行电穿孔后的活细胞数。图20a-20b显示了靶向helacnv或hpv基因后的hela细胞死亡。图20a显示了用cripsr/cas9对细胞进行电穿孔后的细胞活力图示。样品包括在转染后24h、48h和72h，仅脉冲(gfp)、ccr5、mt2、hpv_1和prdm9。图20b显示了使用细胞滴度glo测定，通过靶向hpv基因，hela细胞死亡的图示，其中样品为nt1、nt2、nt3、ccr5、mt2和hpv_1。图21显示了用靶向各种基因座的cripsr/cas9转染ht29细胞后的细胞活力。样品包括nt1、ccr5、hprt1、mt2、trappc、linc00536、trps1和cdk8。图22显示了用靶向各种基因座的cripsr/cas9转染h1563细胞后的细胞活力。样品包括ccr5、smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2。图23显示了用靶向各种基因座的cripsr/cas9转染细胞后，细胞活力的显微图像。图24显示了在用靶向各种基因座的cripsr/cas9转染细胞后，通过膜联蛋白v定量的细胞活力。图25在上图显示了用靶向各种基因座的crispr/cas9或crisprplus系统转染细胞后的细胞图像。下图是每种处理的细胞活力图。图26显示了rnp氖电穿孔，其示出了cas9指导rna在egfr突变肺癌细胞系hcc827中引起的多重切割诱导和细胞死亡。图27显示了脂转染后2天，crispr/cas9或crisprplus系统的rnp脂转染，其中cas9指导rna在腺癌细胞系h1563中诱导多重切割和细胞死亡。图28在上图显示了用靶向各种基因座的crispr/cas9或crisprplus系统对细胞进行电穿孔后的细胞图像。下图显示了在腺癌细胞系h1299细胞中电穿孔后的细胞活力。图29显示了在靶向ht-29细胞中的cnv后，通过细胞滴度glo测定所测量的细胞活力。图30显示了ascpf1_crrna和cpf1crrna结合位点wt的靶序列。图31显示了cas12a和单或多靶点crrna引起的序列特异性癌细胞杀伤作用，在上图中包括细胞图像，在下图中包括每个处理组的活细胞条形图。具体实施方式本文公开了与核酸的选择性靶向有关的组合物和方法，所述核酸例如是病原体细胞或通常与癌症相关的生长或增殖失调的细胞中的核酸。通过本文的公开，靶向核酸被选择性降解，从而经常导致它们从个体中清除。细胞dna/rna也被非特异性外切核酸酶活性降解。清除通常通过细胞死亡来实现，从而使携带该核酸的细胞被选择性杀死。然而，细胞外核酸如病毒核酸也通过本文公开的一些实施方案来靶向。靶向清除通过序列特异性核酸检测和核酸内切/核酸外切降解活性的组合来实现。组合物和方法通常包含序列特异性组分。在本文的许多实施方案中，该部分包含指导核酸，如指导rna或指导dna，其通过与靶核酸中的反向互补(通常简称为“互补”)碱基序列进行碱基配对而实现序列特异性。然而，也考虑到诸如talen、锌指或其他可编程的、特异性序列鉴定部分等替代物。在示例性实施方案中，序列特异性通过与靶核酸分子的区段反向互补的指导rna来传递。一旦鉴定出靶核酸，就通过组合的内切核酸酶/外切核酸酶活性来实现清除，该活性例如是通过诸如crispr/cas核蛋白复合物等核蛋白复合物的蛋白质组分所传递的活性。此外，在鉴定靶核酸后，核蛋白复合物的蛋白质组分的非特异性外切核酸酶活性也被激活。该非特异性外切核酸酶活性非特异性地降解细胞dna/rna分子，从而导致细胞死亡。本文中的外切核酸酶活性意指酶通过从多核苷酸链的末端(exo)一次切割一个核苷酸来工作。核酸内切裂解通过crispr/cas核酸内切活性或通过与上述序列指定部分相关或由其指导的其他核酸内切活性来实现。这样的活性在序列指定部分处、附近或以其指导的方式切割靶核酸，从而使携带靶序列的核酸被选择性地裂解。本文中的核酸内切裂解意指由酶切割多核苷酸链内的磷酸二酯键。第二核酸降解活性进一步促进降解。在一些情况下，该活性是序列特异性的，或以其他方式由序列指定部分指导。或者，该活性靶向至双链断裂，而与序列无关，但是使得由上述核酸内切活性产生的双链或单链断裂将被选择性地或非选择性地靶向，以供进一步降解。在本文的示例性复合物和方法中，第二活性是外切核酸酶活性，并且与核酸内切活性相关地递送，例如通过与具有共同磷酸二酯骨架的嵌合多肽中的核酸内切活性融合，使得核酸内切活性指向核酸内切裂解位点。在另一个实现方式中，还考虑第二活性的共同施用或其他递送机制。被特异性鉴定、被核酸内切特异性切割并进一步经历外切核酸酶活性或其他“扩散”由序列特异性部分引导的dna损伤的活性的核酸非常经常地被损伤，以致它们不再编码足够的信息来编码正在进行的细胞或病毒活性。即，在经受如本文公开的组合物或方法时，核酸很可能失去足够的序列，使得其不再编码细胞功能必需的至少一种蛋白质，从而杀死细胞。类似地，经历如本文所公开的组合物或方法的核酸很可能被鉴定为被宿主细胞损伤，而与通过核酸内切和核酸外切活性损失了多少编码能力无关，使得该细胞被靶向，以供通过内部dna完整性检查点降解，从而导致细胞凋亡机制。即，由crrna指导的序列特异性核酸酶活性的激活所诱导的非特异性外切核酸酶活性使细胞dna/rna分子非特异性降解，这在细胞中引起致命作用。通过酶促灭活和经由抗体结合的螯合中的至少一种，通过核酸酶复合物的时间特异性灭活来实现时间调节。时间灭活具有从个体局部或全身清除核酸酶的益处，从而降低了脱靶活性的风险，特别是在靶核酸从个体或个体的特定部位被大量或完全清除的情况下。如上所述，一些组合物和方法包括通过施用影响核酸识别、核酸内切活性和核酸外切活性或与本文公开内容一致的其他活性中的至少一种的处理或组合物来时间调节活性。使个体经历与本文公开内容一致的方法或施用组合物，并施用后续组合物或处理，以使核酸酶活性组合物失活。实例包括但不限于局部热施加、zn2+离子或其变体，例如znso4，或表4中所示的任何其他那些或其变体，灭活、去稳定或以其他方式中和核酸酶活性的施用或其他组合物施用，稳定地结合指导核酸的模板杀伤核酸，使其无法指导进一步的降解，稳定地结合crispr/cas复合物的内切核酸酶杀伤核酸，使其无法以靶标指导的方式持续降解核酸底物，以及结合并影响(直至并包括灭活)负责特定核酸鉴定或靶向降解的复合物的抗体。因此，在本文中，通过本公开的实践，通过核酸内切裂解和通过裂解事件的扩散，实现了特定核酸的特异性靶向和降解，从而在核酸分子中引入了实质性的损伤，或在一些情况下引入了灾难性的损伤，直至并包括整个核酸和/或整个核酸分子的缺失。类似地，如下实现对该活性的特异性控制：通过选择指导rna或其他可编程序列指定部分以将核酸降解活性引导至特定靶标或靶标类别，以及在一些情况下通过暂时终止活性，以便一旦在特定时间段过后就从个体清除该活性。本公开的上下文。癌症是人类的主要健康问题。癌症最突出的特性之一是无限增殖，这已被用来选择并开发针对该性状的抗癌药。针对体内高度增殖细胞的疗法通常用作一线化学疗法或放射疗法。然而，这些方法还靶向体内高度增殖的正常细胞，如毛发和免疫细胞群体，这可导致中度至重度副作用以及患者的痛苦。选择性靶向体内癌细胞的高度特异性抗癌治疗剂的开发为患者带来了实质性益处的可能。最近，使用患者免疫系统进行癌症治疗的免疫肿瘤学在抗癌治疗方面取得了实质性进展。例如，car-t细胞疗法使用源自患者的免疫t细胞，这些t细胞通过遗传操作或其他方法在细胞膜中表达抗原受体。该抗原受体识别癌细胞中的特定膜蛋白并破坏它们。然而，癌细胞与抗癌药之间的生物分子相互作用的强度通常对于完全特异性而言并不令人满意，常常导致脱靶效应或不完全的靶向。因此，尽管靶向癌症疗法和免疫肿瘤学被认为比传统癌症治疗毒性更低，但它们仍具有相当大的副作用。抗原引导的疗法通常同时表现出副作用和缓解作用，随后癌细胞生长和进展复发。另外，在癌细胞中发现特定的膜蛋白仍然具有挑战性。现有方法。靶向癌症疗法显示出希望，并已得到积极开发。靶向癌症疗法是通过抑制癌症发病机理中涉及的特定分子靶标或途径来阻断癌症生长的抗癌疗法。靶向癌症疗法有时被称为“分子靶向药物”或“分子靶向疗法”。目前，靶向疗法是许多抗癌药开发的焦点。靶向方法需要对待消除的一种或另一种细胞类型具有特异性的靶标。许多方法通过比较癌细胞和正常细胞中总蛋白质的量来确定特异性靶标。癌细胞中特异性存在的蛋白质或癌细胞中更丰富存在的蛋白质是潜在的靶标。已知更强的候选物对于癌症发病机理至关重要。差异表达的靶蛋白的一个公知的实例是人表皮生长因子受体2蛋白(her-2)。her-2在某些癌细胞表面高水平表达。已经开发出针对her-2的几种靶向疗法，包括曲妥珠单抗该药物被批准用于治疗某些过表达her-2的乳腺癌和胃癌。另一种方法是检测导致癌症进展的突变蛋白质。例如，细胞生长信号蛋白brca1或braf分别以改变的形式存在于许多乳腺癌和黑素瘤中。已开发出许多靶向疗法来靶向这些突变形式，并且它们被批准用于治疗含有这些改变的蛋白质的无法手术或患有转移性癌症的患者。癌细胞中特特异性存在的染色体异常也可用于潜在靶标。这些染色体异常通常产生基因融合，导致在癌症进展中起关键作用的融合蛋白的表达。癌细胞中特异性存在的这类异常融合蛋白可用于开发靶向疗法。甲磺酸伊马替尼(gleevec)靶向bcr-abl融合蛋白，已知该融合蛋白由两个基因融合形成，并存在于某些白血病细胞中并驱动白血病进展。大多数靶向疗法使用小分子或单克隆抗体来阻断或中和特异性存在于癌细胞中的特定蛋白质或途径。通常通过高通量筛选来鉴定小分子候选物，其中大规模筛选测试化合物对特定靶蛋白的作用。为了产生单克隆抗体，使用癌细胞中特异性存在的特定靶蛋白注射动物(通常是小鼠)，以诱导动物形成针对该靶标的抗体。然后对这些抗体进行测试，以发现与靶标最佳结合而不与非靶蛋白结合的抗体。基于时空特异性核酸的方法。相对于健康细胞，癌细胞通常表现出增加的突变率。这些增加的突变率可能以诸如插入、缺失、重复、颠换或易位等染色体变异中的至少一种表现出来，或者以诸如单碱基或少数碱基插入、缺失或单核苷酸多态性(snp)等局部突变表现出来。这些突变并不总是引起乃至特异性指示肿瘤细胞群体内活跃分裂或转移的细胞。然而，它们通常根据起源的组织和癌症类型将细胞确定为在特定基因组位点上包括在正常细胞中不存在的遗传突变。在本文公开的方法中，那些癌症特异性突变，如snp，用于癌细胞特异性标记。crispr/cas蛋白是核酸指导的酶(例如，rna指导的)，其可识别dna或rna的特定序列，并将其切割为细菌适应性免疫系统的组成部分。这些特定dna/rna切割系统已被视为有吸引力的体内序列特异性基因组编辑工具。例如，基于crispr/cas9的基因组编辑(ge)工具在疾病治疗和农业性状领域显示出前景。crispr/cas-grna复合物的基因组编辑如下实现：通过rna指导的内切核酸酶蛋白如cas12a(或cpf1)、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12i、cas13a、cas13b、cas14或cas9等进行位点特异性dsdna/rna切割，随后进行后续的细胞修复机制。切割核酸的许多不同的可编程内切核酸酶，如cas内切核酸酶，与本公开一致。核酸切割可编程cas内切核酸酶例如在harrington等人(science.2018年11月16日；362(6416):839-842.doi:10.1126/science.aav4294.epub2018年10月18日)中描述，其全部内容通过引用整体并入本文。核酸切割可编程cas内切核酸酶例如在yan等人(science.2019年1月4日；363(6422):88-91.doi:10.1126/science.aav7271.epub2018年12月6日)中描述，其全部内容通过引用整体并入本文。本领域技术人员已知的其他参考文献提供了广泛的cas蛋白，所有这些均与本公开一致，包括cas12a(或cpf1)、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12i、cas13a、cas13b、cas14或cas9中的任一种。与指导rna结合并由其引导以指导序列特异性切割的蛋白质，或以其他方式以序列特异性方式结合核酸序列以触发非特异性切割的蛋白质，与本公开一致。具有与靶dna/rna互补的序列的指导rna赋予crispr/cas-grna复合物依赖性靶位点切割的序列特异性。crispr/cas蛋白成员crispr/cas12和crispr/casl3a的基因组编辑功能被grna指导的dna/rna结合所激活，这随后激活非特异性核酸酶活性，该活性降解单链dna或rna分子(图1)。crispr/cas12和crispr/casl3a的位点特异性dsdna/rna切割和非特异性单链dna/rna切割是独立的活性。这种外切核酸酶活性的增强，例如通过共同施用或嵌合融合靶向双链和单链dna和rna(其被grna指导的靶位点与crispr复合物的结合所激活)的外切核酸酶活性，通过非特异性地和不可逆地破坏必需的细胞dna和rna分子，增加了核酸损伤并可诱导细胞。因此，序列特异性复合物，如crispr/cas12和crispr/cas13a，或本文中提及的其他复合物(其通过grna指导的与癌细胞或其他靶细胞中存在的特定靶位点的结合，使用选择性激活的非特异性核酸酶功能来特异性靶向诸如癌细胞的细胞)允许特异性地去除不需要或有害的核酸或带有它们的细胞，同时减少或消除对健康增殖细胞的负面影响。核酸序列指导的crispr/cas内切核酸酶如crispr/cas12和crispr/cas13a的基因组编辑功能通过grna指导的dna/rna与特定靶位点的结合而被激活，这随后激活降解单链dna或rna分子的crispr/cas蛋白固有的非特异性核酸酶活性。通过添加核酸酶功能的嵌合融合而增强基因组编辑效率的crispr/cas蛋白具有强大的非特异性双链(ds)/单链(ss)dna和rna核酸酶功能，该功能被crispr/cas蛋白的grna指导的靶标结合激活。这些系统通过具有靶序列的分子的特异性切割，及随后的非特异性单链或双链外切核酸酶活性，促进了核酸靶向和降解，例如在癌细胞中。作用完成后，可施用针对crispr/cas蛋白的特异性抑制剂和选择性抗体，以去除体内残留的复合物的功能，从而消除该蛋白质的不希望的副作用。在本公开的一方面，癌细胞特异性突变如snp被crispr核酸酶复合物的grna识别，该crispr核酸酶复合物含有与特定突变如snp互补的序列。癌细胞基因组上的诸如snp等突变与grna之间的序列特异性结合会激活crispr核酸酶蛋白的基因组编辑功能，从而导致靶dna/rna断裂。这种激活随后激活了crispr核酸酶和/或crisprplustm固有的非特异性外切核酸酶功能，该功能不可逆地破坏癌细胞中的细胞ds和ssdna/rna分子，从而导致细胞死亡(图2)。在crispr核酸酶复合物的治疗效果完成后，施用crispr/cas终止剂如znso4或本文所述的其他终止剂，和/或针对crispr核酸酶和/或crisprplustm的特异性抗体，以终止体内残留的不希望的crispr活性，从而最小化副作用或以其他方式清除复合物。因此，在本公开的一个方面，通过crispr/cas核酸酶功能的特异性激活，以及通过特异性抑制剂和选择性抗体在体内终止蛋白质复合物的不希望的活性，在体内实现了前所未有的癌细胞特异性靶向。本文公开的方法的优点。在癌症治疗的背景下和其他方面，本文公开内容的实践均具有许多优点。举例来说，与诸如配体：受体和抗原：抗体的其他生物分子之间的相互作用相比，具有互补序列的核苷酸分子(dna：dna或dna：rna)之间的结合相对较强且高度特异性。作为本公开的一个示例实现方式，本文的本公开的癌细胞特异性治疗效果基于互补dna：rna结合的高特异性，因此可以针对个体患者或细胞类型的需要进行定制。crisprplustm-grna复合物的核酸酶活性可取决于细胞基因组中与细胞中grna序列互补的特定突变如snp的存在。因此，本文的本公开的细胞特异性治疗效果大于当前开发和使用的许多其他抗癌疗法的治疗效果。举例来说，细胞靶向是特异性的并且容易个性化。癌症通常取决于致癌起源和原因而具有自己的特异性标志物。不同的患者可患有不同类型的癌症。因此，同一疗法在不同患者中可能表现出不同的功效。在本文公开的治疗方法中，可以任选地初步分析每名患者的癌症，以鉴别用于鉴定每名患者中的癌症或特定癌细胞的特异性标志物的特定snp。因此，可以将每种crisprplustm-grna复合物或用于该疗法的其他复合物制作成对所讨论的特定癌症基因组具有特异性。因此，由于患者之间癌细胞的潜在变异所引起的治疗效果之间的差异可能会大大降低，因为这是可以靶向的个体的特定癌细胞系。此外，靶标的选择不受先前对癌症的了解或癌症机制所限制。通过本文的本公开内容的实践，可以鉴定出任何数目的序列靶标。诸如snp等特定突变与癌症或其他疾病进展之间无需存在机械联系。相反，可以靶向任何突变，例如被鉴定为与肿瘤群体中的一些或全部细胞相关的snp。由于癌细胞群体的特征通常在于降低的核酸增殖保真度，因此本公开的这一特征极大地增加了靶向细胞以供降解的机会。另外，活性复合物易于清除。这允许本公开的序列特异性补充有时间特异性，从而使得在选定的时间段之后容易停止或抑制治疗方案。这使得人们可以进一步减少脱靶效应，该脱靶效应可能是由于组合物在个体的非靶细胞中的持续存在而产生的。靶标范围。作为本技术的示例性应用或实现方式，本文中的本公开的大部分涉及癌细胞靶向。然而，人们容易理解，本公开的范围和适用性扩展到肿瘤或特定癌细胞之外，并且涵盖其清除可导致治疗效果或改善病况的至少一种症状的其他细胞或核酸。例如，传染病提出了本文的本公开内容所解决的许多挑战，并且类似地适于症状缓解，直至并包括完全治疗。例如，许多疾病病原体呈现出可变性或难以检测细胞表面蛋白质，或驻留在宿主细胞内，从而使通过基于抗体的方法对它们的鉴定变得复杂。类似地，对许多疾病的小分子治疗涉及大量副作用，通常会影响患者的依从性或使姑息性、预防性或防止性治疗方案复杂化。例如，诸如疟疾、昏睡病或结核等疾病的病原难以治疗。细胞要么不呈现表面以供基于抗体的或宿主引导的治疗，要么迅速改变其细胞表面以逃避免疫应答。或者，结核细胞足够缓慢地增殖，以致针对细胞增殖中特定步骤的治疗剂必须施用一段时间，这段时间长到损害治疗依从性。通过本文的本公开内容的实践，可以在细胞或病毒病原体基因组中容易地鉴定出细胞特异性靶核酸序列。使用这些序列，可以容易地获得特异性靶标，其以与以上本公开内容一致的方式促进病原体核酸的序列特异性降解，以上这些在癌症的背景下叙述，但是从本公开内容可以明显看出，其容易地适用于大量病症。因此，本文中的本公开内容与靶向特定癌细胞，例如肺癌或胰腺癌一致，而且还靶向范围广泛的真核、真细菌或病毒病原体，如疟原虫细胞、锥虫细胞、弓形体细胞、机会性酵母或其他细胞、贾第虫细胞、葡萄球菌感染、大肠杆菌或病毒病原体，如hiv、流感、hpv或许多其他可传播或遗传性疾病。本公开提供了指导rna和cas9系统的组合物，其可以在通过在细胞中的一个或多个位置进行切割来诱导细胞死亡的方法中使用。在特定的实施方案中，该细胞是病变细胞，如癌细胞，并且在包含健康细胞和病变细胞(或癌细胞)的大量细胞中。通过将指导rna靶向至仅存在于癌细胞中的突变序列，可以将本文公开的组合物施用于更多的细胞，以仅在癌细胞中诱导细胞死亡。而且，本文公开的指导rna和cas9组合物靶向多个位点以供切割，从而诱导靶核酸的多重切割和有效的细胞死亡。类似地，本文的本公开内容与范围广泛的传染性疾病如疟疾、弓形体病、昏睡病、查加斯病、结核、大肠杆菌感染、链球菌性喉炎、流感、普通感冒、aids以及许多其他病症的症状缓解一致，这些病症具有核酸作为该病症的病原体的组成部分。此外，在本公开的一方面，只要可获得一个或多个靶核酸序列，就可以类似地解决未知的疾病或病原体。因此，例如，通过设计指导序列核酸复合物或其他序列特异性核酸酶部分，以便特异性靶向具有选自未知生物体基因组的靶序列的核酸，仍然可以将患有未知疾病并被鉴定为具有可检测量的未知生物体(该未知生物仅通过例如整个样品非靶向测序来鉴定)的个体作为目标，以供消除。可以监测受试者响应于施用复合物或实施本文公开的方法的症状缓解，直至并包括充分治疗，以便在不首先明确确定病原体的情况下应对该病症。已经提供了总体上与组合物和方法有关的本公开内容，还提供了与本文公开的组合物和方法的特定方面有关的细节和变化。应当理解，下面的特定细节通常是可适用的并且可以彼此组合，以获得对本文中本公开的各个实施方案的全部范围的更广泛理解，并且本公开具有足够的灵活性，以允许变化和替代组合，而不落在本文中本公开内容的范围之外。序列特异性。如上所述，在一个方面，本公开的实施方案得益于序列指定部分，以便将本公开的核酸酶活性引导至特定靶标，而排除其他靶标。在示例性实施方案中，序列特异性通过指导核酸如指导rna或指导dna来传递。这样的分子可被装配成crispr/cas或其他合适的复合物，以通过碱基配对向靶核酸中的反向互补碱基序列传递序列特异性。然而，如上所述，许多替代部分可以与本文的本公开内容一致。特定的替代物可以包括序列特异性或序列识别蛋白，如talen重复、锌指蛋白、转录因子部分，如螺旋-环-螺旋或其他蛋白质结构。这类部分的有益特征是它们在其底物结合中表现出序列特异性，使得它们可以将核酸酶活性复合物引导至特定靶核酸区段，并且在一些情况下，在具有实质同一性的替代物之间进行区分，在一些情况下，它们之间的差异仅在于一个碱基或者也许仅单个表观遗传修饰，如碱基甲基化。优选但非排他地，这些部分是可编程的，从而可以鉴定靶序列，随后选择具有与靶核酸区段相对应的核酸或蛋白质序列的特异性部分。或者，可以选择核酸结合部分的集合，以便并非对特定结构进行编程以传递核酸特异性，而是可以从多样性的核酸结合部分如转录因子核酸部分中选择，以便得到具有足以区分靶核酸区段和健康核酸区段的核酸特异性的部分。特别是，当靶序列与宿主或患者dna明显不同，从而使得变异大于一个或几个碱基时，在特异性部分选择上具有很大的灵活性。例如，在复合物旨在靶向病原体基因组或逆转录病毒基因组或插入的病毒基因组而不是癌症突变细胞类型的情况下，可以从目标生物体自身的转录因子集合中轻松获得特异性部分。因此，本文的一些实施方案可以包含本文其他地方公开的内切核酸酶和外切核酸酶活性，其与包含多肽特异性因子而不是指导核酸的核酸特异性部分组合。在本公开的一个方面，靶核酸大小可根据传递特异性所需的信息量和核酸酶活性通过其传递的系统而变化。在作为本文的先导示例性实施方案提出的crispr或crisprplustm系统的情况下，靶核酸大小以及因此最小指导rna或dna大小受传递特异性所需的大小和装配成核蛋白复合物并导致稳定退火所必需的大小所限制。靶区域必须长到足以传递稳定的退火，但不能长到导致与单碱基错配对区段退火。举例来说，示例性指导核酸可以具有通常为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或超过30个核苷酸的特异性决定区。蛋白质指导的序列特异性部分的靶区域可以表现出更多的变异。许多靶序列类型与本文的本公开内容一致，范围从单核苷酸多态性到指示染色体重排事件的接合，再到包含完全非天然核酸序列的序列靶标。举例来说，在本公开的一个方面，由序列特异性部分如指导rna鉴定的序列类型可包括单碱基置换、单碱基缺失或插入，多碱基置换、插入或缺失，其侧翼通常为在靶核酸与非靶核酸之间没有区别的序列区段(如癌细胞系中单碱基突变侧翼的野生型或健康序列)。或者，选择一些靶序列以跨越指示染色体事件的接合，所述染色体事件例如是大的缺失，指示一个序列区段插入到染色体上另一个序列中或与另一个序列相邻的重复，倒位事件，易位或其他染色体重排。通常，该事件任一侧的序列可以与健康细胞中的序列相对应，但是这些区段相对于彼此的定位可能指示突变，例如与癌症或其他健康状况相关的突变。在本公开的一个方面，举例来说，靶序列可以被选择为与疾病相关。在癌症治疗的情况下，可以选择出现在全部或大部分肿瘤群体中的靶序列。例如，可以选择靶序列以靶向肿瘤群体中的活跃增殖或以其他方式具有危险的细胞，或靶向整个肿瘤群体或靶向特定肿瘤群体之内和之外的细胞。在一些情况下，靶序列可以在机理上与疾病有关(例如，与细胞周期检查点的误调节有关的突变，或诸如p53、rb、e2f、cdk或细胞周期蛋白家族成员等已知癌基因的突变，或诸如mtor或pi3k信号传导途径的成员的生物调节物。然而，在本文的本公开的一个方面，其不限于在机理上与病症有关的靶标；相反，被鉴定为与靶细胞群体相关或在靶细胞群体中特别地、主要地或基本上出现的任何序列区段都可以用作靶序列。鉴于许多癌症或肿瘤细胞群体在核酸复制中表现出缺陷并随后积累突变，因此本公开允许从范围广泛的靶标中进行选择。因此，在本公开的一个方面，可以极大地促进靶序列的选择，因为它不受与参与特定疾病的基因相对应的序列的限制。举例来说，靶序列在一些情况下可以选自先前确定的与癌症或其他疾病有关的序列。例如，已公开的病原体基因组是靶序列的现成来源，并且可以在不进行进一步验证的情况下进行选择，也可以在确认它们也不存在于宿主基因组中的验证之后进行选择。类似地，靶序列候选物通常可以依赖于已公开的癌症基因组信息。以下表1中提供了与靶序列选择有关的公开信息的实例。表1.与各种类型癌症相关的突变的更全面但仍为部分性的列表，可在网站上找到，该网站可从www.mycancergenome.org/上的https链接访问。备选地或组合地，在本公开的一个方面，通过肿瘤细胞或感染的样品测序从头确定靶序列。获得样品，并对其进行任何数量的靶向或非靶向测序方法中的一种或多种。根据等位基因或突变基因座不存在于预测的健康或宿主基因组序列中，对其进行鉴定，并选择以供进一步分析。在一些情况下，证实突变或等位基因仅存在于肿瘤或肿瘤的子集中，例如与肿瘤生长或转移有关的细胞群体中。靶序列选择方法不是互斥的。例如，在一些情况下，治疗方案包括施用具有靶向已知肿瘤突变的指导rna的部分。在观察到至少一些症状没有改善或肿瘤形态学没有表现出实质性变化时，或者在观察到其他任何次优后果时，可以继续对剩余的肿瘤组织进行测序，以鉴定至少一个靶序列，所述靶序列足以用于后续施用具有指导rna或其他序列鉴定部分的核酸酶复合物，该指导rna或其他序列鉴定部分指导具有通过后续肿瘤测序而鉴定的靶序列区段的核酸的降解。本公开提供了用于crispr/cas或crisprplustm系统的指导核酸。指导核酸(例如，指导rna)可以与cas蛋白结合，并将cas蛋白靶向至靶多核苷酸内的特定位置。指导核酸可包含核酸靶向区段和cas蛋白结合区段。可以将指导核酸设计为靶向与癌症相关或有关的途径。可以用本公开的组合物靶向的途径的非限制性实例包括凋亡、β-联蛋白/wnt信号传导、细胞周期控制、细胞架构和微环境、染色质重塑/dna甲基化、细胞毒性化学疗法作用机制、dna损伤/修复、g蛋白信号传导、刺猬(hedgehog)信号传导、激素信号传导、免疫检查点、jak/stat信号传导、激酶融合、map激酶信号传导、代谢信号传导、pi3k/akt1/mtor、蛋白质降解/泛素化、受体酪氨酸激酶/生长因子信号传导、rna剪接和tgfβ信号转导。可以将指导核酸设计为靶向与癌症相关或有关的途径。可以用本公开的组合物靶向的基因的非限制性实例包括akt1、alk、braf、egfr、her2、kras、mek1、met、nras、pik3ca、ret和ros1。本公开的具体靶向策略包括靶向拷贝数变异(cnv)——其可以以更高的丰度存在于癌细胞中，靶向结构变异(sv)接合，如cnv、倒位或易位——其中接合序列可以跨越sv基因座和另一个正常基因座，靶向插入缺失(插入/缺失)，如插入、缺失或单核苷酸多态性(snp)，或靶向整合的序列，如整合到细胞中的病毒dna序列。大多数细胞具有可被靶向的cnv。具有sv的细胞系的实例包括sk-br-3乳腺癌细胞中的erbb2基因区域。具有插入缺失的细胞系的实例包括hcc827中的egfr基因和sk-br-3中的krt16基因。整合的序列的实例包括用整合致瘤病毒如hpv(例如，hela细胞中的hpv序列)或hbv开发的癌细胞。鉴定待靶向的癌症序列包括从ccle和harmonizome网络数据库下载癌细胞系的sv、cnv、插入缺失和snp数据。cnv的预期拷贝数(n)可以从拷贝数值(v)如下计算：n＝〖2×2〗^v。从ucsc基因组浏览器、ncbigenbank和refseq数据库中下载序列数据，并用人类参考基因组(grch38，hg19)进行确认。如果酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9(spcas9)的pam(前间隔区相邻基序)序列5’-ngg-3’位于癌特异性序列周围，则选择pam3’方向的这20个核苷酸序列中的一些，并将其命名为crispr/cas9靶间隔区。选择并设计靶序列的方法可以满足以下三个标准：(1)g或c可以位于序列的两个末端，以实现sgrna的高结合亲和力，(2)序列的gc含量(％)可以是40-60％，以实现sgrna的高结合亲和力，以及(3)a或t可以在pam的3’指导位置的3至4个核苷酸，以实现spcas9的高切割效率，pam是spcas9的切割位点。可以将指导核酸设计为靶向与特定细胞系中的特定基因相关的以下任何靶序列。表2显示了cas9sgrna的间隔区序列数据表。来自ccle数据库(https://portals.broadinstitute.org/ccle/data)和harmonizome(http://amp.pharm.mssm.edu/harmonizome)的拷贝数。来自ccle数据库的插入缺失。来自ucsc基因组浏览器(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)和ncbigenbank、refseq(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq)的靶序列和基因座。*在hela癌细胞系的情况下，无法确保插入缺失突变数据。表2-cas9sgrna的间隔区序列数据表指导rna可以靶向在特定基因中多次出现的序列，从而在将指导rna与cas9一起施用时导致多重切割。换句话说，本文公开的cas9/指导rna组合物诱导基因中多个位置处的靶序列的切割，并诱导细胞死亡。例如，指导rna可以用来靶向ccr5(在某些细胞中具有两个切割位点)、hprt1(在某些细胞中具有两个切割位点)、mt2(在特定细胞中具有超过100个切割位点)、smim11(在特定细胞中具有超过40个切割位)、gnpda2(在特定细胞中具有超过12个切割位点)、slc15a5(在特定细胞中具有超过12个切割位点)和kcne2(在特定细胞中具有超过40个切割位点)。在一些实施方案中，对照包括hprt1(管家基因)。ccr5、hprt1、mt2、smim11和kcne2可以是非必需基因。在特定的实施方案中，本文公开的指导rna和cas9组合物是癌细胞中的致癌和靶突变序列，以诱导有效的细胞死亡。可被本文公开的指导rna和cas9组合物靶向(以在一些情况下引入多重切割，从而导致细胞死亡)的细胞包括肺癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞和胰腺癌细胞。与本文公开的组合物和方法一致的细胞系包括h1299细胞和h1563细胞。本文公开的指导rna和cas9组合物通过多种方法被递送至细胞。所述组合物可以在进行或不进行lipofectamine的情况下电穿孔到细胞中，并且也可以使用核糖核蛋白(rnp)递送至细胞。指导rna和cas9组合物也可以使用表达载体如px459表达载体来递送。说明性的指导rna序列也在表6和第[00303]段以及表7和第[00305]段中提供，分别与包含cas12和cas9核酸酶的多肽一起使用。在本公开中，指导核酸可指可与另一核酸，例如细胞基因组中的靶多核苷酸杂交的核酸。在一个实现方式中，指导核酸可以是rna，例如，指导rna。在另一个实现方式中，指导核酸可以是dna。在又一个实现方式中，指导核酸可包括dna和rna。此外，指导核酸可以是单链或双链的。此外，指导核酸可包含核苷酸类似物或修饰的核苷酸。在本公开的一个方面，指导核酸可被编程为或设计成以位点特异性方式与核酸序列结合。在本公开的另一个方面，指导核酸可包含一个或多个修饰，从而为核酸提供新的或增强的特征。例如，指导核酸可包含核酸亲和标签。此外，指导核酸可包含合成的核苷酸、合成的核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。在本公开的一个方面，指导核酸可以在例如5’端或3’端处或附近包含与靶多核苷酸中的前间隔区序列互补的核酸靶向区域(例如，间隔区)。指导核酸的间隔区可通过杂交(碱基配对)以序列特异性方式与前间隔区相互作用。前间隔区序列可以位于靶多核苷酸中的前间隔区相邻基序(pam)的5’或3’。间隔区的核苷酸序列可以有所变化，并且决定了指导核酸可以与之相互作用的靶核酸中供切割的位置。指导核酸的间隔区可以被设计或修饰用于与靶核酸内的任何所需序列杂交。在本公开的另一个方面，指导核酸可包含两个分开的核酸分子，其可以被称为双指导核酸，或者包含单个核酸分子，其可以被称为单指导核酸(例如，sgrna)。在一些实施方案中，指导核酸是包含融合的crisprrna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含crrna的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含crrna但缺乏tracrna的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含非融合的crrna和tracrrna的双指导核酸。示例性的双指导核酸可包含crrna样分子和tracrrna样分子。示例性的单指导核酸可包含crrna样分子。示例性的单指导核酸可包含融合的crrna样分子和tracrrna样分子。crrna可包含指导核酸的核酸靶向区段(例如，间隔区)和一段核苷酸，这段核苷酸可形成指导核酸的cas蛋白结合区段的双链的双链体的一半。tracrrna可包含一段核苷酸，这段核苷酸形成grna的cas蛋白结合区段的双链的双链体的另一半。crrna的一段核苷酸可以与tracrrna的一段核苷酸互补并杂交，以形成指导核酸的cas蛋白结合域的双链的双链体。crrna和tracrrna可以杂交以形成指导核酸。crrna还可以提供与靶核酸识别序列(例如，前间隔区)杂交的单链核酸靶向区段(例如，间隔区)。可以将包括间隔区的crrna的序列或tracrrna分子设计为对将要在其中使用指导核酸的物种具有特异性。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度可以是18至72个核苷酸。指导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度可以是约12个核苷酸至约100个核苷酸。例如，指导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度可以是约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约12nt至约18nt、约12nt至约17nt、约12nt至约16nt或约12nt至约15nt。或者，dna靶向区段的长度可以是约18nt至约20nt、约18nt至约25nt、约18nt至约30nt、约18nt至约35nt、约18nt至约40nt、约18nt至约45nt、约18nt至约50nt、约18nt至约60nt、约18nt至约70nt、约18nt至约80nt、约18nt至约90nt、约18nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt或约20nt至约100nt。核酸靶向区域的长度可以是至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。核酸靶向区域(例如，间隔区序列)的长度可以是至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为22个核苷酸。与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的指导核酸的核苷酸序列可具有例如至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt的长度。与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的指导核酸的核苷酸序列可具有约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt的长度。可以通过鉴定目的区域内的pam并选择该pam上游或下游所需大小的区域作为前间隔区来鉴定前间隔区序列。可以通过确定前间隔区的互补序列来设计相应的间隔区序列。间隔区序列可以使用计算机程序(例如，机器可读代码)来鉴定。该计算机程序可以使用这样的变量，如预测的解链温度、二级结构形成和预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％gc、基因组出现的频率、甲基化状态、snp的存在等。核酸靶向序列(例如，间隔区序列)与靶核酸(例如，前间隔区)之间的互补性百分比可以是至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在约20个连续核苷酸上，核酸靶向序列与靶核酸之间的互补性百分比可以是至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。指导核酸的cas蛋白结合区段可包含彼此互补的两段核苷酸(例如，crrna和tracrrna)。彼此互补的这两段核苷酸(例如，crrna和tracrrna)可以通过间插核苷酸(例如，在单指导核酸的情况下为连接体)共价连接。彼此互补的这两段核苷酸(例如，crrna和tracrrna)可以杂交以形成cas蛋白结合区段的双链rna双链体或发夹，从而产生茎-环结构。crrna与tracrrna可以通过crrna的3’端和tracrrna的5’端共价连接。或者，tracrrna和crrna可以通过tracrrna的5’端和crrna的3’端共价连接。指导核酸的cas蛋白结合区段的长度可以是约10个核苷酸至约100个核苷酸，例如，约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。例如，指导核酸的cas蛋白结合区段的长度可以是约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的长度。指导核酸的cas蛋白结合区段的dsrna双链体可具有约6个碱基对(bp)至约50bp的长度。例如，该蛋白结合区段的dsrna双链体的长度可以是约6bp至约40bp、约6bp至约30bp、约6bp至约25bp、约6bp至约20bp、约6bp至约15bp、约8bp至约40bp、约8bp至约30bp、约8bp至约25bp、约8bp至约20bp或约8bp至约15bp。例如，cas蛋白结合区段的dsrna双链体的长度可以是约8bp至约10bp、约10bp至约15bp、约15bp至约18bp、约18bp至约20bp、约20bp至约25bp、约25bp至约30bp、约30bp至约35bp、约35bp至约40bp或约40bp至约50bp。在一些实施方案中，cas蛋白结合区段的dsrna双链体的长度可以是36个碱基对。杂交以形成蛋白结合区段的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少约60％。例如，杂交以形成蛋白结合区段的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。在一些情况下，杂交以形成蛋白结合区段的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比为100％。连接体(例如，在单指导核酸中连接crrna与tracrrna的连接体)的长度可以是约3个核苷酸至约100个核苷酸。例如，连接体的长度可以是约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3个核苷酸(nt)至约80nt、约3个核苷酸(nt)至约70nt、约3个核苷酸(nt)至约60nt、约3个核苷酸(nt)至约50nt、约3个核苷酸(nt)至约40nt、约3个核苷酸(nt)至约30nt、约3个核苷酸(nt)至约20nt或约3个核苷酸(nt)至约10nt。例如，连接体的长度可以是约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。在一些实施方案中，dna靶向性rna的连接体为4nt。如上所述，在本公开的一个方面，指导核酸可包括提供另外的所需特征(例如，改变的或调节的稳定性；亚细胞靶向；用荧光标记追踪；蛋白质或蛋白质复合物的结合位点；等等)的修饰或序列。此类修饰的实例包括，例如，5’帽(7-甲基鸟苷酸帽(m7g))；3’聚腺苷酸化尾(3’聚(a)尾)；核糖开关序列(例如，以允许蛋白质和/或蛋白质复合物的调节的稳定性和/或调节的可及性)；稳定性控制序列；形成dsrna双链体(发夹)的序列)；将rna靶向至亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的修饰或序列；提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合、与促进荧光检测的部分缀合、允许荧光检测的序列等)；提供蛋白质(例如，作用于dna的蛋白质，包括转录激活物、转录阻抑物、dna甲基转移酶、dna脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶及其组合)结合位点的修饰或序列。在本公开的另一个方面，指导核酸可包含一个或多个修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，从而为核酸提供新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)。指导核酸可包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖的组合。核苷酸的碱基部分可以是杂环碱基。这类杂环碱基的最常见的两个类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸基团可以与该糖的2’、3’或5’羟基部分连接。在形成指导核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接，以形成直链聚合化合物。进而，该直链聚合化合物的各自末端可以进一步连接以形成环状化合物；然而，直链化合物通常是合适的。另外，直链化合物可具有内部核苷酸碱基互补性，因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。此外，在指导核酸内，磷酸基团通常可被称为形成指导核酸的核苷间骨架。指导核酸的连接或骨架可以是3’至5’磷酸二酯键。在本公开的另一个方面，指导核酸可包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。在其中含有磷原子的合适的修饰的指导核酸骨架可包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒磷酸酯和硼烷磷酸酯，其具有正常的3’-5’键，2’-5’连接的类似物，以及其中一个或多个核苷酸间键是3’至3’、5’至5’或2’至2’键的具有反向极性的那些。合适的具有反向极性的指导核酸可以在最3’的核苷酸间键处包含单个3’至3’键(诸如，其中核碱基缺失或具有代替其的羟基的单个反向核苷残基)。还可包括各种盐(例如，氯化钾或氯化钠)、混合盐和游离酸形式。指导核酸可包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键、特别是-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-(亚甲基(甲基亚氨基)或称mmi骨架)、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键被表示为-o-p(＝o)(oh)-o-ch2-)。指导核酸可包含吗啉代骨架结构。例如，核酸可包含6元吗啉代环来代替核糖环。在一些这样的实施方案中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷间键代替磷酸二酯键。指导核酸可包含由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些可包括具有以下部分的那些：吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的n、o、s和ch2组分部分的其他那些。指导核酸可包含核酸模拟物。术语“模拟物”可以旨在包括其中仅呋喃糖环或者呋喃糖环和核苷酸间键都被非呋喃糖基团代替的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可被称为糖替代物。可以保持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以供与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(pna)。在pna中，多核苷酸的糖骨架可以被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架代替。核苷酸可以被保留并且与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接地结合。pna化合物中的骨架可包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这给予了pna含酰胺的骨架。杂环碱基部分可与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接地结合。指导核酸可包含具有连接到吗啉代环上的杂环碱基的连接的吗啉代单元(吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于吗啉代的非离子寡聚化合物可具有更少的不期望的与细胞蛋白质的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是指导核酸的非离子模拟物。吗啉代类别中的各种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一类多核苷酸模拟物可被称为环己烯核酸(cena)。通常存在于核酸分子中的呋喃糖环可以用环己烯基环代替。可以制备cenadmt保护的亚磷酰胺单体，并将其用于使用亚磷酰胺化学方法的寡聚化合物合成。将cena单体并入核酸链中可提高dna/rna杂合体的稳定性。cena寡腺苷酸可以与核酸互补体形成复合物，其稳定性与天然复合物类似。进一步的修饰可包括锁定核酸(lna)，其中2’-羟基与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-c,4’-c-氧基亚甲基连接，从而形成双环糖部分。该连接可以是亚甲基(-ch2-)，即桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n为1或2。lna和lna类似物可以展现出非常高的与互补核酸的双链体热稳定性(tm＝+3至+10℃)、对3’-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性性质。指导核酸可包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸可包含选自以下的糖取代基：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。特别合适的是o((ch2)no)mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non((ch2)nch3)2，其中n和m为1至约10。糖取代基可选自：c1至c10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善指导核酸的药代动力学性质的基团，或用于改善指导核酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。合适的修饰可包括2’-甲氧基乙氧基(2'-o-ch2ch2och3，也称为2’-o-(2-甲氧基乙基)或2’-moe，烷氧基烷氧基)。其他合适的修饰可包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基(o(ch2)2on(ch3)2基团，也称为2’-dmaoe)和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2’-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-dmaeoe)、2’-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-o-ch3)、氨基丙氧基(--och2ch2ch2nh2)、烯丙基(-ch2-ch＝ch2)、-o-烯丙基(--o--ch2—ch＝ch2)和氟代(f)。2’-糖取代基可位于阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。合适的2’-阿拉伯糖修饰是2’-f。还可以在寡聚化合物的其他位置，特别是在3’末端核苷上的糖的3’位置或者5’末端核苷酸的2’-5’连接的核苷酸中以及5’位置，进行类似的修饰。寡聚化合物还可以具有糖模拟物如环丁基部分以代替呋喃戊糖基糖。指导核酸还可包含核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g))和嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u))。修饰的核碱基可包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-c＝c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-f-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可包括三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)；g夹，如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。杂环碱基部分可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的那些部分，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。核碱基可用于增加多核苷酸化合物的结合亲和力。这些可包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代可以使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且可以是合适的碱基取代(例如，当与2’-o-甲氧基乙基糖修饰组合时)。指导核酸的修饰可包括将能够增强指导核酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物以化学方式连接至指导核酸。这些部分或缀合物可包括与诸如伯羟基或仲羟基等官能团共价结合的缀合物基团。缀合物基团可包括但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团和可增强寡聚物的药代动力学性质的基团。缀合物基团可包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。可以增强药代动力学性质的基团包括改善核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分可包括但不限于脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如，己基-s-三苯甲基硫醇)、巯基胆固醇、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋甘油或三乙铵1,2-二-o-十六烷基-外消旋甘油-3-h-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。修饰可包括蛋白质转导域或称ptd(细胞穿透肽(cpp))。ptd可指促进穿过脂双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或者有机或无机化合物。ptd可以连接至另一分子，该分子的范围可以从极性小分子到大型高分子和/或纳米颗粒，并且ptd可以促进该分子穿过膜，例如从胞外间隙到胞内间隙，或从胞质溶胶到细胞器内。ptd可以共价连接至多肽的氨基末端。ptd可以共价连接至多肽的羧基末端。ptd可以共价连接至核酸。示例性的ptd可包括但不限于最小肽蛋白质转导域；包含足以引导进入细胞的数目的精氨酸(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列，vp22域，果蝇触角蛋白质转导域，截短的人降钙素肽，聚赖氨酸，和转运蛋白(transportan)，从3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨酸均聚物。ptd可以是可激活的cpp(acpp)。acpp可包括经由可切割连接体连接至匹配的聚阴离子(例如，glu9或“e9”)的聚阳离子cpp(例如，arg9或“r9”)，其可以将净电荷降至几乎为零，从而抑制向细胞的粘附和摄取。在连接体被切割后，聚阴离子可以得到释放，从而局部暴露聚精氨酸及其固有的粘附性，从而“激活”acpp以穿过膜。本公开的示例性嵌合多肽包含核酸酶，如位点特异性内切核酸酶或其结构域。适用于本公开的非限制性示例性位点特异性内切核酸酶可以包括但不限于crispr相关(cas)多肽或cas核酸酶，包括1类cas多肽、2类cas多肽、i型cas多肽、ii型cas多肽、iii型cas多肽、iv型cas多肽、v型cas多肽和vi型crispr相关(cas)多肽；锌指核酸酶(zfn)；转录激活物样效应核酸酶(talen)；大范围核酸酶；rna结合蛋白(rbp)；crispr相关的rna结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；argonaute(ago)蛋白(例如，原核argonaute(pago)、古菌argonaute(aago)和真核argonaute(eago))；其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。在一些情况下，本公开的嵌合多肽包含位点特异性内切核酸酶的一个或多个结构域。适用于本公开的结构域的非限制性实例可包括指导核酸识别或结合域；核酸酶结构域，如dna酶结构域、rna酶结构域、ruvc结构域和hnh核酸酶结构域；dna结合域；rna结合域；解旋酶结构域；蛋白质-蛋白质相互作用域；和二聚化结构域。指导核酸识别或结合域与指导核酸相互作用。核酸酶结构域包含用于核酸切割的催化活性。或者，核酸酶结构域可以是缺乏或具有降低的催化活性的突变的核酸酶结构域。位点特异性内切核酸酶可以是各种位点特异性内切核酸酶蛋白质的嵌合体，例如，包含来自不同cas蛋白的结构域。在一些情况下，本公开的位点特异性内切核酸酶是蛋白质的野生型形式。或者，位点特异性内切核酸酶是野生型形式的修饰形式，例如，相对于野生型形式的蛋白质，其包含氨基酸变化，如缺失、插入、置换、变异、突变、融合、嵌合或其任何组合。在一些情况下，本公开的位点特异性内切核酸酶包含与野生型示例性位点特异性内切核酸酶具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，本公开的位点特异性内切核酸酶包含与野生型位点特异性内切核酸酶的核酸酶结构域(例如ruvc结构域或hnh结构域)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。与指导rna结合并由其引导以指导序列特异性切割的蛋白质，或以其他方式以序列特异性方式结合核酸序列以触发非特异性切割的蛋白质，与本公开一致。所述蛋白质包括可编程的内切核酸酶，如可编程的cas内切核酸酶。在一些情况下，本公开的位点特异性内切核酸酶包含cas多肽或其结构域。适用于本公开的非限制性示例性cas多肽包括cas9、cpf1(或cas12a)、c2c1、c2c2(或cas13a)、cas13、cas13a、cas13b、c2c3、casl、caslb、cas2、cas3、cas4、cas5、cas5e(casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a、cas8al、cas8a2、cas8b、cas8c、csnl、csxl2、cas10、cas10d、caslo、caslod、casf、casg、cash、csyl、csy2、csy3、csel(casa)、cse2(casb)、cse3(case)、cse4(casc)、cscl、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3、csxl7、csxl4、csxlo、csxl6、csax、csx3、csxl、csxl5、csfl、csf2、csf3、csf4和cul966；其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。在一些情况下，本公开的位点特异性内切核酸酶除靶标特异性活性外还包含诱导型非特异性核酸酶活性或混杂活性。非特异性活性可以通过位点特异性内切核酸酶对靶核酸的位点特异性切割来激活。包含诱导型非特异性核酸酶活性的非限制性示例性位点特异性内切核酸酶可包括cas12a(cpf1)、cas13、c13a和cas13b。在一些情况下，位点特异性内切核酸酶可包括cas9多肽，包括其任何衍生物；及其任何变体；及其任何片段。cas9被分类为ii类、ii型crispr/cas效应蛋白。示例性的cas9多肽是来自酿脓链球菌的cas9，在本文中被称为spcas9，其由1,368个氨基酸组成。cas9的特征在于具有两个内切核酸酶结构域——hnh和ruvc，以及识别叶(rec)结构域。hnh结构域切割与指导rna序列互补的dna链。ruvc样结构域通过由指导rna/cas9复合物形成的watson-crick碱基配对切割另一条非互补dna链。在一些情况下，cas9蛋白包含突变。例如，将ruvc结构域中第10个氨基酸处的天冬氨酸(d)置换为丙氨酸(a)可除去ruvc依赖性核酸酶功能，仅保留hnh依赖性内切核酸酶功能。cas9的d10a变体(称为切口酶)可用来在靶位点处生成单链切口。另一个置换突变——cas9h840a的hnh结构域中第840个氨基酸处从组氨酸(h)变为丙氨酸(a)——产生失活的cas9蛋白，其缺乏全部核酸酶活性。包含突变d10a和h840a的失活cas9保留了序列特异性结合功能，并且可以充当功能性转录因子，例如，当与激活域或阻抑域框内融合时。与指导rna结合并由其引导以指导序列特异性切割的蛋白质，或以其他方式以序列特异性方式结合核酸序列以触发非特异性切割的蛋白质，与本公开一致。所述蛋白质包括可编程的内切核酸酶，如可编程的cas内切核酸酶。与本公开一致的可编程cas内切核酸酶的实例包括cas12a(或cpf1)、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12i、cas13a、cas13b、cas14、cas9等。在一些情况下，位点特异性内切核酸酶可包括cas12a(cpf1)，包括其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。cas12a被分类为具有约1,300个氨基酸的ii类、v型crispr/cas效应蛋白。cas12a小于cas9。cas12a包含两个主要结构域，如rec和ruvc结构域。cas12a缺少cas9中的hnh内切核酸酶结构域。cas12a切割富含t的(5′-tttn-3′)pam直接下游的双链dna(dsdna)。cas12a生成距富含t的pam为20个核苷酸的4-5nt长的5’突出端。在一些情况下，cas12a产生的粘端增强hr期间dna替换的效率。在一些情况下，位点特异性内切核酸酶可包括cas13a(c2c2)。或者，在一些情况下，位点特异性内切核酸酶可包括cas13b。cas13是一种靶向rna的内切核酸酶，其在识别靶标后会表现出混杂rna活性的附带作用。在一些情况下，位点特异性内切核酸酶如cas多肽可以来自生物体酿脓链球菌(s.pyogenes)。或者，许多真细菌或其他微生物体可以是位点特异性内切核酸酶如cas多肽的合适来源。通过许多标准选择来源生物体，如其编码的蛋白质的gc偏性或密码子偏性、最适生长温度(通常对应于酶的最佳活性)、可用性、调节位点的存在或其他相关标准。以下任何非限制性实例适合用作位点特异性内切核酸酶的来源：韦德纤毛菌(leptotrichiawadei)、沙氏纤毛菌(leptotrichiashahii)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、链球菌属的种(streptococcussp.)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、达松维尔拟诺卡氏菌(nocardiopsisdassonvillei)、始旋链霉菌(streptomycespristinaespiralis)、产绿色链霉菌(streptomycesviridochromogenes)、产绿色链霉菌(streptomycesviridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(streptosporangiumroseum)、玫瑰链孢囊菌(streptosporangiumroseum)、酸热脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(bacilluspseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(bacillusselenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)、海洋微颤菌(microscillamarina)、伯克霍尔德氏菌目细菌(burkholderialesbacterium)、食萘极地单胞菌(polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属的种(polaromonassp.)、瓦氏鳄球藻(crocosphaerawatsonii)、蓝丝菌属的种(cyanothecesp.)、铜绿微囊藻(microcystisaeruginosa)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、聚球藻属的种(synechococcussp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(acetohalobiumarabaticum)、极端制氨菌(ammonifexdegensii)、热解纤维素菌(caldicelulosiruptorbecscii)、candidatusdesulforudis、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大芬戈尔德菌(finegoldiamagna)、嗜热盐碱厌氧菌(natranaerobiusthermophilus)、嗜热丙酸降解菌(pelotomaculumthermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(acidithiobacilluscaldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(acidithiobacillusferrooxidans)、酒色别样着色菌(allochromatiumvinosum)、海杆菌属的种(marinobactersp.)、嗜盐亚硝化球菌(nitrosococcushalophilus)、nitrosococcuswatsoni、盐浮游假交替单胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(ktedonobacterracemifer)、methanohalobiumevestigatum、多变鱼腥藻(anabaenavariabilis)、泡沫节球藻(nodulariaspumigena)、念珠藻属的种(nostocsp.)、极大节螺藻(arthrospiramaxima)、钝顶节螺藻(arthrospiraplatensis)、节螺藻属的种(arthrospirasp.)、鞘丝藻属的种(lyngbyasp.)、原型微鞘藻(microcoleuschthonoplastes)、颤藻属的种(oscillatoriasp.)、运动石袍菌(petrotogamobilis)、非洲栖热腔菌(thermosiphoafricanus)、深海单细胞蓝藻(acaryochlorismarina)、沙氏纤毛菌(leptotrichiashahii)、普雷沃菌(prevotella)或新凶手弗朗西斯菌(francisellanovicida)。其他来源生物体与本文的本公开内容一致。本公开的一些示例性嵌合多肽可包含外切核酸酶或其结构域。适用于本公开的外切核酸酶的非限制性实例包括外切核酸酶，如5'-3'外切核酸酶、3'-5'外切核酸酶和5'-3'碱性外切核酸酶。表3显示了适合与位点特异性内切核酸酶融合以产生本公开的嵌合多肽的示例性外切核酸酶。表3.示例性外切核酸酶增加的部分增加的结构域的来源增加的部分的功能rece大肠杆菌5'→3'外切核酸酶recj大肠杆菌5'→3'外切核酸酶t5噬菌体t55'→3'外切核酸酶exoi原核生物和真核生物3'→5'外切核酸酶exoiii大肠杆菌3'→5'外切核酸酶exovii大肠杆菌5′→3′和3′→5′方向两者lexo大肠杆菌λ外切核酸酶，5′→3′外切核酸酶recbcd大肠杆菌5′→3′和3′→5′方向两者exot大肠杆菌3'→5'外切核酸酶trex1智人(homosapiens)3'→5'外切核酸酶trex2智人(homosapiens)3'→5'外切核酸酶绿豆绿豆(vignaradiata)单链dna消化在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶包含5’-3’外切核酸酶或其催化结构域。适用于本公开的5’-3’外切核酸酶的非限制性实例包括来自原核生物的那些，如rece、recj、rexb和dna聚合酶i的外切核酸酶结构域；噬菌体，如t2、t3、t4、t5、t7或λ噬菌体；以及真核生物，如xrn1或exo15’-外切核酸酶。在一些情况下，使用包含5’-3’外切核酸酶活性的嵌合多肽所获得的突变效率高于使用包含3’-5’外切核酸酶活性的嵌合多肽所获得的突变效率。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含recj或其催化结构域。recj是约60kd的持续性单体外切核酸酶。recj在需要mg2+的反应中以5’至3’极性降解ssdna，导致dna降解为单核苷酸。recj核酸酶可产生具有3’突出端尾的ssdna，该3’突出端尾可被单链dna结合蛋白结合。在一些情况下，recj不需要末端5’磷酸，并且将同样好地消化终止于5’oh的dna。在一些情况下，recj对钝dsdna没有活性。在一些情况下，recj需要至少6个未配对的碱基才能结合并启动降解。一旦与ssdna尾分子结合，recj就可以在有限程度上消化到dsdna区域中，但最常见的是在ds/ssdna边界处终止消化。recj专门用于从单链缺口降解，然后导致从双链末端产生3′ssdna尾重组发生分子。recj可以去除由3’至5’外切核酸酶活性产生的5’突出端ssdna，以提高插入缺失突变率。在一些情况下，recj适合连接至位点特异性内切核酸酶如cpf1的c末端，例如，因为recj能够咀嚼cpf1产生的5-nt突出端。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含rece或其结构域。rece(也称为外切核酸酶viii或exoviii)具有持续性mg2+依赖性5’至3’外切核酸酶活性。rece是λ外切核酸酶的功能等同物。rece的示例性来源是大肠杆菌。rece由约866个氨基酸组成。rece从5’至3’方向切除双链dna。rece的外切核酸酶活性需要5’磷酸。在一些情况下，rece优先作用于由位点特异性内切核酸酶如cas9产生的dsdna平端。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含t5外切核酸酶或其催化结构域。t5外切核酸酶(t5-exo)是276个氨基酸的蛋白质。t5外切核酸酶具有5′→3′外切脱氧核糖核酸酶活性。t5外切核酸酶在5'至3'方向上降解ssdna或dsdna。t5外切核酸酶能够启动从5'末端或在线性或环状dsdna的缺口和切口处去除核苷酸。一些t5外切核酸酶部分不降解超螺旋环状dsdna。t5外切核酸酶可通过位点特异性内切核酸酶如cas9从双链断裂产生3’-突出端，来增强插入缺失突变和hr。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含λ外切核酸酶或其催化结构域。λ外切核酸酶属于外切核酸酶iv，其在5'至3'方向上进行核酸外切裂解，以产生核苷5'-磷酸。λ外切核酸酶偏好平端5'-磷酸化的dsdna。λ外切核酸酶无法在切口或缺口处启动dna消化。λ外切核酸酶可通过从cas9产生的平端产生3'突出端来增强插入缺失突变率和hr。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含dna聚合酶i的外切核酸酶结构域。dna聚合酶i的切割，例如被蛋白酶枯草杆菌蛋白酶的切割，产生小片段和大片段(也称为klenow片段)。该小片段，在本文中称为dnapoli的小片段，包含5'→3'外切核酸酶和5'瓣(从双链体链延伸的5’突出端)内切核酸酶活性，并且适合用作包含5'→3'外切核酸酶活性的dme。较大的片段包含5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含3'-5'外切核酸酶或其催化结构域。适用于本公开的3'-5'外切核酸酶的非限制性实例可包括trex，如trex2、绿豆核酸酶、外切核酸酶i、外切核酸酶iii、外切核酸酶vii和recbcd外切核酸酶。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含trex或其催化结构域。trex酶可以是trex1或trex2。trex2是一种自主真核外切核酸酶，是279个氨基酸的蛋白质。trex1和trex2蛋白形成具有3'切除活性的同型二聚体。trex1和trex2使用单链寡核苷酸，并且在结构上与dnapoliii、exoi和exox的细菌ε亚单位最密切相关。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含绿豆核酸酶或其催化结构域。绿豆核酸酶是355个氨基酸的蛋白质，从绿豆vignaradiata的芽中分离得到。绿豆核酸酶从ssdna或具有游离单链5'端的dsdna的瓣结构中逐步切割核苷酸。在一些情况下，绿豆外切核酸酶不消化双链dna、双链rna、dna/rna杂合体或带切口的双链体dna的完整链。绿豆核酸酶催化单链dna或rna的特异性降解，并产生带有5'-p末端的单核苷酸和寡核苷酸。在一些情况下，绿豆外切核酸酶可通过去除由位点特异性内切核酸酶如cas9产生的5’和3’单链突出端来增加插入缺失突变。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含外切核酸酶i(exoi)或其催化结构域。外切核酸酶i是具有mg2+依赖性的3'至5'单链外切核酸酶活性的846个氨基酸的蛋白质。外切核酸酶i将dsdna消化成单核苷酸。外切核酸酶i是dnaq超家族的成员，其结构类似于dna聚合酶i的klenow片段的3'至5'外切核酸酶活性位点。在一些情况下，外切核酸酶i通过去除由位点特异性内切核酸酶如cas9产生的双链断裂末端双链中的单链突出端来增加插入缺失突变。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含外切核酸酶iii(exoiii)或其催化结构域。外切核酸酶iii催化从双链dna的3'-羟基末端逐步去除单核苷酸。外切核酸酶iii的示例性底物是平端或凹陷的3'末端。在一些情况下，外切核酸酶iii还作用于双链体dna的切口处，产生单链缺口，这可抵抗切割，因为外切核酸酶iii通常可能对通常抵抗切割的延伸4个碱基或更长的3'突出端末端不具有活性。外切核酸酶iii从具有一个抗性3'-突出端和一个5'-突出端或敏感平端的线性分子产生单向缺失。外切核酸酶iii的活性部分取决于dna螺旋结构，并显示出序列依赖性(c>a＝t>g)。外切核酸酶iii还可包含rna酶h、3'-磷酸酶和ap-内切核酸酶活性。在一些情况下，外切核酸酶iii通过加速cas9的3’至5’外切核酸酶活性来增加插入缺失突变。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含外切核酸酶vii或其催化结构域。外切核酸酶vii(exovii)从5'-3'或3'-5'方向切割单链dna，产生5'-磷酸单核苷酸。外切核酸酶vii还包含n末端dna结合域。在一些情况下，外切核酸酶vii通过去除由产生cas9的断裂末端生成的单链突出端来增加插入缺失突变。在示例性的嵌合多肽中，外切核酸酶可包含recbcd外切核酸酶或其催化结构域。recbcd外切核酸酶包含mg2+依赖性recb结构域、recc结构域和recd结构域，这解开dsdna并降解单链dna和双链dna。recbcd从5'-3'或3'-5'方向切割ssdna，产生5'-磷酸单核苷酸。在一些情况下，recbcd通过去除基于cas9的双链断裂中生成的单链突出端来增加插入缺失突变。在另一个实例中，外切核酸酶可包含外切核酸酶t或其催化结构域。外切核酸酶t(exot)包括215个氨基酸的蛋白质，是dnaq样3'-5'外切核酸酶的成员，其deddh结构域包含用于结合两个镁离子的四个酸性dedd残基(d23、e25、d125和d186)，以及一个在3’-羟基末端的活性位点起作用的组氨酸残基(h181)。外切核酸酶t修剪结构化dna的3’端，包括凸起、泡和y结构化的dna。给药途径。核酸酶核糖核蛋白复合物可以通过与本文的本公开内容一致的多种给药途径来施用。在一些情况下，通过口服施用被配制为对消化摄取有抗性的制剂，给药是全身性的。或者，通过吸入或通过复合物的静脉内给药来实现全身性给药，例如通过注射或通过静脉内滴注将制剂引入血流中。局部给药也可以与本文的本公开内容一致。注射组合物，例如作为药膏的一部分或作为贴剂的成分在受影响的细胞的部位局部施用。给药通常受到待靶向的核酸类型的影响。黑素瘤、鳞状细胞癌、皮肤感染或其他可及的表面病症任选地进行局部或全身给药。可触及的肿瘤可以进行局部给药或在肿瘤部位处或附近注射预组装的复合物，或者可以进行全身给药。类似地，涉及肺的病症可通过吸入或通过全身性递送来解决。内部病症、涉及远端组织的病症或怀疑有转移以致癌细胞群体预计不会位于单个部位的病况，很可能使用包含至少一些全身性递送的递送途径来解决。此外，在本公开的一个方面，可以通过使用纳米颗粒作为递送平台来进行给药。举例来说，可以通过使用例如peg化的金纳米颗粒、阴离子金纳米颗粒和某些用于全身性给药非免疫应用的聚合物来进行给药，并且可以通过使用例如基于脂质的纳米颗粒和某些用于免疫、疫苗和需要免疫刺激的其他应用的聚合物来进行给药。在每个递送平台中，可以考虑活性药物成分(api)和纳米载体的免疫毒性，并可以为特定应用选择合适的递送系统。即，当需要免疫调节时，使用免疫反应性载体，而当不需要免疫活性时，不使用免疫反应性载体。这样，基于临床前免疫毒性研究，例如在整体并入本文的dobrovolskaiam,jcontrolrelease.201512月28日；220(00):571–583(ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4688153/)中可获得的研究，可以开发纳米技术配制的药物，并将其用于本公开。同时或顺序进行的用于解决单一病症的多种给药途径也与本文的公开内容一致。核酸酶活性的时间调节。如上所述，核酸酶序列特异性任选地伴有核酸酶活性的时间调节，以进一步降低给药的脱靶或其他副作用。在本公开的一个方面，通过酶促灭活和经由抗体结合的螯合中的至少一种，通过核酸复合物的时间性的特异性灭活来实现时间调节。时间灭活传递了从个体局部或全身性地清除核酸酶的益处，从而降低了脱靶活性的风险，特别是在靶向核酸从个体或个体的特定部位大量或完全清除的情况下。如上所述，一些组合物和方法包括通过施用影响核酸识别、核酸内切活性和核酸外切活性或与本文中本公开内容一致的其他活性中的至少一种的治疗或组合物而对活性的时间调节。使个体经历与本文的本公开内容一致的方法或施用组合物，并且施用同时或后续的组合物或治疗，以使核酸酶活性组合物失活。示例性的灭活组合物包括但不限于znso4或其他影响序列鉴定或核酸酶活性的离子或非离子分子。施用这样的组合物会影响核酸酶活性，使得即使其局部或全身性地保持完整，核酸酶活性也会降低。举例来说，如本公开中使用的“猝灭剂溶液”或“终止剂溶液”可包括抑制核酸酶活性的组合物，并且猝灭剂溶液可包括诸如znso4或其他离子或非离子模块。例如，取决于特定的应用，可以从所附的表4中所示的各种可用的猝灭剂溶液中选择猝灭剂溶液，从而提供预期猝灭剂溶液的可能的组合表。在表4中，各栏代表十二种阴离子(例如，硫酸根、硝酸根、氯离子、铵离子、柠檬酸根、砷酸根、磷酸根、磷酸铵、碳酸根、氟离子、草酸根、氢氧根)，它们能够与金属阳离子发生离子结合，并且每行代表七种金属离子(例如，铝、锌、铁、铅、铜、银和金)。阴离子与金属离子之间的每种组合都是预期的猝灭剂，用以终止crispr或crisprplustm性能。所有84种猝灭剂溶液均由7种金属和12种阴离子生成。反应性较低的金属阳离子铝、锌、铁、铅、铜、银和金可以代替镁，镁是crispr或crisprplustm内切核酸酶活性进行dna切割反应的关键辅因子。阴离子可用于通过与镁结合而从cas9蛋白中消耗镁。以下表4说明了金属(例如，铝、锌、铁、铅、铜、银和金)可以与以下任何阴离子组合：硫酸根(so4)、硝酸根(no3)、氯离子(cl)、铵(nh4)、柠檬酸根(c6h8o7)、砷酸根(aso4)、磷酸根(po4)、磷酸铵(nh4)3po4、碳酸根(co3)、氟离子(f)、草酸根(c2o4)和氢氧根(oh)。表4.预期猝灭剂溶液的组合表另外的实施方案包括但不限于稳定地结合核酸酶如crispr/cas或crisprplustm复合物的内切核酸酶杀伤核酸，使其不能以靶标引导的方式持续降解核酸底物。在本公开的一个方面，核酸酶核蛋白复合物的灭活和螯合都可以通过施用至少一种复合物结合抗体来完成。在各个实施方案中，这样的抗体可以阻断或损害底物结合，阻断或干扰内切核酸酶活性，阻断或干扰外切核酸酶活性，或螯合核糖核复合体，使得它们从组织中的核酸附近去除。因此，抗体可以结合并影响(直至并包括灭活)负责特异性核酸鉴定或靶向降解的复合物。在一些情况下，可以通过注射、局部给药或与核酸酶共同给药，任选地通过延时释放机制，例如本领域已知的那些机制，将这样的组合物局部地施用在为了选择性核酸降解而靶向的肿瘤部位。本领域已知的那些。备选地或组合地，将这样的组合物全身性施用，任选地以隔离的形式施用，以便在有限范围的组织中释放或使其可用于活性。备选地或组合地，通过在肿瘤或其他核酸酶活性部位局部施加热来实现核酸酶的局部灭活。在各种情况下，施加热可降低核酸碱基配对效率，降低核酸酶核糖核蛋白复合物的稳定性，或降低核酸酶核糖核蛋白的活性。共同给药和持续监测或治疗方案。本文公开的核酸酶组合物，如核糖核蛋白复合物，作为独立治疗方案的一部分或与至少一种其他治疗方案组合地施用于个体。特别是，通常向被怀疑或诊断为患有特定癌症的个体施用医护标准化学疗法或放射疗法作为一线治疗，并向其施用本文公开的组合物作为后续或二级治疗。在一些情况下，这样的治疗旨在解决主要治疗结果的不足，或用作确证性治疗，以增加肿瘤或疾病细胞清除的可能性，减少缓解后复发的机会。还考虑了在一些情况下，在一定条件下与前线治疗或常规治疗同时施用本文公开的特定核酸酶，以传递常规治疗的益处，但剂量降低前线治疗的副作用。还考虑了与非药物治疗方案如外科手术干预一起或在其之后的组合物给药，以及与抗生素方案、锻炼方案或饮食改变相组合的给药。或者，在一些情况下，本文的核酸酶组合物作为前线或初始治疗施用，以改善或消除通常用作癌症治疗剂的化学疗法或放射疗法治疗方案所伴随的副作用。本文还考虑了与dna双链断裂修复抑制剂组合的组合物施用。预期使用的抑制剂包括小分子抑制剂和大分子抑制剂，例如，包含指导核酸的核糖核蛋白复合物，该指导核酸靶向与dna双链断裂修复相关的基因如brca基因或brca途径。抑制剂可以在施用本公开的组合物的同时、之前或之后施用。本文的组合物作为单剂量或作为多剂量方案的一部分施用。多剂量方案通常伴随着对治疗功效的持续监测，以便评估对细胞增殖、疾病细胞计数、肿瘤生长的影响，或对疾病或癌症症状改善的影响，以及其他结果。因此，常常根据持续的功效后果来调整治疗方案。通过不同地增加治疗剂量、提高治疗功效或通过改变核酸酶治疗方案或在核酸酶治疗方案中添加其他靶标来解决不利的治疗后果。还考虑了伴随的治疗组合物的添加或改变，并且与本文的公开内容一致。如上所述，一些治疗方案最初采用针对已知靶序列的组合物，当发现治疗后果未导致癌症清除时，通过肿瘤或其他癌性组织测序来切换到或补充从头鉴定的靶序列。表5a显示了具有柄和t7rna聚合酶启动子序列的说明性grna序列，以及使用cas12a核酸酶获得的说明性输出信息。表5b显示了具有柄、tracrrna和t7rna聚合酶启动子序列的示例性grna序列，以及使用cas9核酸酶获得的示例性输出信息。表6和第[00303]段列出了说明性的指导rna序列，其可用于将包含cas12a核酸酶结构域的多肽(例如，包含cas12a核酸酶的嵌合多肽)引导至与癌症如肺癌或胰腺癌相关的靶核酸。表7和第[00305]段列出了说明性的指导rna序列，其可用于将包含cas9核酸酶结构域的多肽(例如，包含cas9核酸酶的嵌合多肽)引导至与癌症如肺癌或胰腺癌相关的靶核酸。表5-表7中带下划线的文本指出了相对于参考序列(例如，野生型、健康或非癌性)的变异。转到附图，可以看到以下内容。在图1中，显示crisprplustm复合物被grna指导的靶位点结合激活，随后激活了非特异性核酸酶功能。dna/rna的降解导致癌细胞的破坏。图1显示了crisprplustm复合物和靶核酸(例如，dsdna和ssrna)的示意图。在每个示意图中，指导rna(grna)的一部分与靶序列退火，该靶序列位于前间隔区相邻基序(pam)的上游并与之相邻。在上方显示了对双链dna的作用。鉴定靶序列，进行内切核酸切割，导致通过与靶序列结合而引导的双链断裂，并且外切核酸酶活性放大该断裂以在核酸分子中形成实质性损伤，从而导致细胞死亡。在下方，复合物鉴别核糖核酸分子中的靶序列。该复合物被激活，并且rna分子被降解。在图2中，在癌细胞中观察到crisprplustm的非特异性核酸酶功能的激活。将crisprplustm复合物施用于具有不均一细胞群体的个体。在该群体中，突变被确定与细胞增殖相关。携带该突变的细胞被靶向以供降解。装配携带鉴定靶突变的指导rna的核糖核蛋白复合物，并施用于个体。在左侧，看到缺少突变(无靶序列)的细胞不受影响，因为未鉴定出靶序列，并且未发生细胞核酸降解。在右侧，看到携带突变(癌症特异性序列)的细胞经历核酸降解。指导rna鉴定靶突变，并引导内切核酸酶活性以切割核酸。crisprplustm的非特异性核酸酶功能在癌细胞中被特异性激活，该癌细胞在基因组中包含互补的grna靶序列。癌细胞中的非特异性核酸酶活性破坏了细胞的双链和单链dna/rna分子，从而导致细胞死亡的诱导。在图3中，显示了体外裂解测定的结果。crispr/cas12a核糖核蛋白复合物围绕靶向人dhcr7的指导crrna进行装配。crrna靶向包含dhcr7的dsdna#1，而它不靶向缺少靶序列的核酸dsdna#2。看到24小时后(从右数第二泳道)，当crispr/cas12a通过切割其靶dna(dsdna#1)被激活时，它也并行地降解非靶dna的dsdna(dsdna#2)。然而，先前未通过与靶dsdna#1结合而被激活的crispr/cas12a复合物显示出明显更低的非特异性降解活性(中心泳道)，如缺乏dsdna#2的降解所见。在图4中，显示了crispr/cas12a(fncpf1-bpnls)对人细胞的细胞毒性作用的体内裂解测定的结果。左图在y轴上显示了细胞活力，范围从0到3.5，增量为0.5，并且在x轴上显示了处理组，包括(从左到右)未经处理的、lipofectamine+cpf1、lipofectamine+sgrna、cpf1(100ng)+sgrna、cpf1(100ng)+sgrna、cpf1(200ng)+sgrna和cpf1(200ng)+sgrna。在每个处理组中有三个条，从左到右分别显示24h时间点、48h时间点和72h时间点。右图在y轴上显示了细胞活力，范围从0.000到3.500，增量为0.500，并且在x轴上显示了处理组，包括(从左到右)经处理的、lipofectamine+cpf1、lipofectamine+sgrna、cpf1(100ng)+sgrna、cpf1(100ng)+sgrna、cpf1(200ng)+sgrna和cpf1(200ng)+sgrna。在每个处理组中有三个条，从左到右分别显示24h时间点、48h时间点和72h时间点。图5显示了具有嘌呤霉素抗性的用于spcas9和sgrna转染的px459质粒载体系统。从左到右显示u6启动子、bbsi、bbsi、grna支架、cmv增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、杂合内含子、3xflag、sv40nls、kozak序列、cas9、核质蛋白nls、t2a、puror、bgh聚(a)信号、aav2itr、f1ori、ampr启动子、ampr和ori。图6a具有示出细胞的一系列三个图像。在每个图像上方，从左到右分别是处理组的描述，分别是仅脉冲、pspcas9(bb)-2a-puro(px459)v2.0–egfr_wt和pspcas9(bb)-2a-puro(px459)v2.0–egfr_e2。仅脉冲组的最左侧图像具有许多细胞，这表明与最右侧图像相比，总体上有更多的活细胞。与最右侧的图像相比，pspcas9(bb)-2a-puro(px459)v2.0–egfr_wt组的中间图像还具有更多的活细胞。与左图和中图相比，实验组pspcas9(bb)-2a-puro(px459)v2.0–egfr_e2的右图包含的细胞更少。图6b显示了标题为hcc827细胞数比较(6dpt)的图，其中x轴显示了三种处理，从左至右包括仅脉冲、egfr_wt和egfr_e2。y轴显示细胞数，范围从0到500000，增量为50000。每个处理组还通过误差条指示误差。图7显示了细胞的两行显微镜图像。该图的左上三幅图像显示了许多存活的细胞，从左到右分别是nt1、ccr5和hprt1。该图的右上方图像和所有底部图像显示的图像中，发现大多数细胞死亡。右上方的图像显示了mt2示例。该图的底行从左到右显示了smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2。图8显示了图示，其在x轴上从左到右显示了包含靶向基因座的质粒的不同处理组。从左到右的组是nt1、ccr5、hprt1、mt2、smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2。y轴显示每孔的活细胞数x104，范围从0到4，增量为0.5。每个条的上方是每孔的确切活细胞数x104，从左到右分别为3.36、3.67、3.52、1.68、0.89、1.42、1.86和0.76。图9显示了条形图，其在x轴上从左到右显示了不同的处理组。这些组从左到右分别是lipo、nt1、ccr5、hprt1、mt2、gnpda2、slc15a5和kcne2。y轴显示每孔的活细胞数x104，范围从0.00至3.50，增量为0.50。每个条的上方是每孔的确切活细胞数x104，从左到右分别为3.02、1.72、2.33、1.50、0.43、0.04、0.02和0.04。图10在最上面一行显示nt1样品，从左到右示出了亮视野图像、具有少数红色斑点的碘化丙啶死细胞染色剂以及具有许多蓝色斑点的nucblue活细胞染色试剂。底行显示了gnpda2样品，从左到右示出了亮视野图像、具有许多红色斑点的碘化丙啶死细胞染色剂以及具有许多蓝色斑点的nucblue活细胞染色试剂。图11显示了条形图，其在x轴上从左到右示出了不同的处理组。这些组从左到右分别为ccr5、hprt1、mt2、irx1和adamts16。y轴显示每孔的活细胞数x104，范围从0到8，增量为1。每个条的顶部是每孔的确切活细胞数x104，从左到右分别为7.33、3.81、3.17、2.7和2.93。顶部示出的该图的标题是h1563特异性cnv测试。图12a显示了条形图，其在x轴上从左到右示出了所测试的不同时间点，分别是24hr、42hr和72hr。在每个时间点内，测试了5组，显示为5个条，从左到右分别是仅脉冲、nt1、hprt1-1、ccr5和mt2。y轴显示了从0.00到15000.00的比例尺，增量为5000.00。顶部示出的该图的标题是a549_celltiterglo。图12b显示了标题为a549_计数的条形图。x轴从左到右显示不同的处理组：仅脉冲、nt1、hprt1、ccr5和mt2。y轴显示细胞数(x104)，范围从0到8，增量为2。图13显示了显微镜图像，其示出了经过不同处理后的细胞，从左到右是仅脉冲、nt1、hprt1、ccr5和mt2。nt1、hprt1和ccr5图像包括指向活细胞的箭头。图14显示了标题为a549_celltiterglo的条形图，其描绘了第一试验，其在x轴上从左到右示出了所测试的不同时间点，分别是24hr、44hr和51hr。在每个时间点内，测试的不同组显示为条，从左到右是仅脉冲、pet21a、mt2、cd68、dach2、herc2p2、shbg和无脉冲。y轴显示了发光，范围从0到7000，增量为1000。图15a显示了来自nattestad,m.等人(complexrearrangementsandoncogeneamplificationsrevealedbylong-readdnaandrnasequencingofabreastcancercellline.genomeres.28,1126–1135(2018))的sk-br-3erbb2区域全基因组序列数据的三幅图。三幅图的左侧示出了比例尺，其底部表示10mbp，顶部表示0.1mbp。最顶部的图显示没有插入缺失的第17号染色体和erbb2，并显示以0.01m为增量的37.84m至37.89m区域。中间的图显示以0.5m的增量从37m放大到38.5m的区域，并且显示没有小scna。底部的图显示以10m的增量从20m放大到80m的区域，并显示了许多基因。箭头指示大scna。所有三幅图的y轴范围均为0到600，增量为100。图15b显示了表格，其从左到右示出了染色体1、位置1、链1、染色体2、位置2和链2。在染色体1之下是17、变体名称和22790。在位置1之下是26654135、变体类型和dup，在链1之下是“-”、拆分和37，在染色体2之下是17、大小和48414052，在位置2之下是75068187、cnv类别和匹配，在链2之下是“+”、类别和solo。图15c显示了从nattestad等人推断的sk-br-3erbb2cnv接合序列。在该序列之下，左侧是chr17:75,058,188-75,068,187，而紧接的右侧则是chr17:26,654,135-26,664,134。跨越这两个区域的是接合区域的60bp。在接合区域内是erbb2ct5、erbb2ct7和erbb2ct6。图16a显示了标题为skbr3_celltiterglo的条形图，其在x轴上从左到右示出了所测试的不同时间点，分别为24hr、42hr和48hr。在每个时间点内，测试的不同组显示为条，从左到右是仅脉冲、nt1、mt2、erbb2、krt16和无脉冲。y轴显示了发光，范围从0到4000，增量为1000。图16b显示了条形图，其为图16a中的图的原始数据。x轴从左到右显示了所测试的不同时间点，分别为24hr、42hr和48hr。在每个时间点内，测试的不同组显示为条，从左到右是仅脉冲、nt1、hprt1、mt2、erbb2、krt16和无脉冲。y轴显示了以500为增量从0到4000范围的值。图17显示了条形图，其在x轴上从左到右示出了所测试的不同组，包括仅脉冲、nt1、hprt1、mt2、erbb2和krt16。y轴显示了细胞数(x10^5)，范围从0到15，增量为5。图18a显示了来自adey等人的hpv和hela细胞整合数据。紫色是hela(显示在hepb图中，并且显示在hepa图的顶部)，绿色是hpv(显示在hepa图的底部)。信号的强度由阴影的颜色示出。左上方的字符显示图例，其中顶行显示紫色阴影，底行显示绿色阴影。图例的顶行从左到右显示4x、34x和13c。图例的底行从左到右显示30x、12c和3x。图18b显示了从meissner等人、landry等人、adey等人和liu等人推断的hela细胞中的hpv序列数据。图中显示的是人类染色体。从左到右示出以下区域：1x、3x和6x。重复数字被标记为x，而只有打开的序列被标记为箭头。图下方的文本显示特定区域的注释，从左到右是人类2a、hpv7、hpv4、人类1、人类3、hpv6、hpv4和人类1。图18c显示了基于以上图18b中提到的参考，hela细胞中hpv序列之间的重复区域的pcr产物的凝胶，其在最右侧泳道中显示了序列梯。箭头指向7kb和2kb。图19a显示了标题为细胞计数的图，其在x轴上从左到右示出了所测试的不同组，包括ccr5、mt2和prdm9。y轴示出了活细胞数，范围从0到20000，增量为2000。图19b显示了标题为细胞计数的图，其在x轴上从左到右示出了所测试的不同组，包括ccr5、mt2、prdm9和hpv_1。y轴示出了活细胞数，范围从0到35000，增量为5000。图20a显示了标题为celltiterglo的图，并且在x轴上从左到右示出了所测试的不同时间点，包括24h、48h和72h。在每个时间点内，测试了不同的组，从左到右是仅脉冲(gfp)、ccr5、mt2、hpv_1和prdm9。y轴示出了发光信号，范围从0到6000，增量为1000。图20b显示了标题为celltiterglo的图。y轴示出了相对发光信号，范围从0到100，增量为20，x轴示出了所测试的不同组，(从左到右)是nt1、nt2、nt3、ccr5、mt2和hpv1。图21显示了图示，其在x轴上示出了所测试的不同组。在x轴上从左到右显示的是nt1、ccr5、hprt1、mt2、trappc、linc00536、trps1和cdk8。y轴示出了细胞数(x10^4个细胞/孔)，范围从0.00到60.00，增量为10.00。图22显示了标题为交叉检查(1563个靶标中的1299个)的图示。x轴示出了所测试的不同组，从左到右是ccr5、smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2。y轴示出了细胞数(x10^4个活细胞/孔)，范围从0到14，增量为2。在每个组显示的条中是每孔的确切活细胞数(x10^4)，从左到右是7.33、10.7、13、12和3.7。图23显示了细胞的显微镜图像。顶行从左到右显示smim11h1563和gnpda2h1563。右下方从左到右显示slc15a5h1563和kcne2h1563。图24显示了图示，其在x轴上从左到右示出了仅脉冲、nt1、ccr5、kcne2、gnpda2、smtm11和slc15a5。y轴示出了发光，范围从0到14000，增量为2000。该图的标题为h1299_annv+。图25在顶部显示了显微镜图像，其从左到右是仅脉冲、px459-egfr_wt、px459-ccr5、px459-egfr_e2、px459-recj-ccr5和px459-recj-egfr_e2。底部的图从左到右示出了仅脉冲、px459-egfr_wt、px459-ccr5、px459-egfr_e2、px459-recj-ccr5和px459-recj-egfr_e2。y轴示出了活细胞信号(发光)，范围从0到40000，增量为5000。图26显示了图示，其在x轴上从左到右示出了仅脉冲、仅cas9-gfp、仅sgrna和egfr_e2rnp。y轴示出了细胞数变化％，范围从-80到20，增量为20。图的标题显示在顶部，是电穿孔后24h的活细胞信号。图27显示了48hr时间点的h1563细胞活力测定的图。x轴从左到右示出了仅脉冲、仅sgrna和mt2rnp。y轴示出了活细胞信号(发光)，范围从0到150，增量为50。在图的顶部显示的标题是h1563细胞活力测定(48hpt)。图28在顶部显示了细胞的亮视野图像，从左到右是模拟(仅cas9gfp)、模拟(仅sgrna)、单靶点(ccr5rnp)、多靶点(gnpda2rnp)和多靶点(smim11rnp)。在左下方的图中，在x轴上从左到右示出了模拟(仅cas9gfp)、模拟(仅sgrna)、单靶点(ccr5rnp)、多靶点(gnpda2rnp)和多靶点(smim11rnp)，并且在y轴上示出了以5000的增量从0到25000的活细胞信号(发光)。在右下方的图中，在x轴上从左到右示出了模拟(仅cas9gfp)、模拟(仅sgrna)、单靶点(ccr5rnp)和多靶点(mt2)。y轴示出了以5000的增量从0到20000的活细胞信号(发光)。图29显示了条形图，其在x轴上(从左到右)示出了仅脉冲、nt1(非靶标)、mt2、cdk8、linc00536、trps1，和trappc9的处理组。y轴显示发光，范围从0到1400，增量为200。图30显示了ascpf1_crrna和cpf1crrna结合位点wt的靶序列。靶结合区的左侧是u6启动子区的末端，序列的底行上是cmv增强子区的起点。图31在顶部显示了不同处理组中的细胞的亮视野图像，所述处理组从左到右为cas12a-egfrwt、cas12a-ccr5和cas12a-egfre2。底部是条形图，其在x轴上从左到右示出了不同的处理组：cas12a-egfrwt、cas12a-ccr5和cas12a-egfre2。y轴以发光显示了活细胞信号，发光的范围是从0到4500，增量为500。编号的实施方案以下实施方案列举了本文公开的特征的组合的排列。在一些情况下，本文公开的特征的组合的排列是非限制性的。在其他情况下，本文公开的特征的组合的排列是限制性的。还考虑到特征组合的其他排列。特别是，这些编号实施方案中的每一个均被设想为依赖于或关联于每个先前或后续编号的实施方案，而与它们所列出的顺序无关。本文列举的一些方法包括至多以及所有以下元素a、b和c。所述方法可以进一步包括另外的元素。1.一种诱导细胞死亡的组合物，该组合物包含：a)嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域；以及b)包含与细胞中的靶核酸互补的序列的指导核酸，其中所述靶核酸与病症相关。2.实施方案1的组合物，其中所述病症是癌症。3.实施方案2的组合物，其中所述癌症是肺癌或胰腺癌。4.实施方案1的组合物，其中所述靶核酸包括rna或dna。5.实施方案1的组合物，其中所述靶核酸包含与病症相关的序列。6.实施方案1的组合物，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。7.实施方案5的组合物，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。8.实施方案1的组合物，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性、易位或与癌症进展相关的序列。9.实施方案1的组合物，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl和her2。10.实施方案1的组合物，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。11.实施方案10的组合物，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。12.实施方案1的组合物，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域、cas12a结构域、cas12b结构域、cas12c结构域、cas12d结构域、cas12e结构域、cas12f结构域、cas12g结构域、cas12h结构域、cas12i结构域、cas13a结构域、cas13b结构域、cas14结构域或cas9结构域。13.实施方案1的组合物，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。14.实施方案1的组合物，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。15.实施方案1的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分与aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagat具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列。16.实施方案1的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第一部分与序列attctaatacgactcactatagg具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列，并且其中所述第三部分与序列gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc具有至少约85％的序列同一性。17.实施方案1的组合物，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。18.实施方案17的组合物，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。19.实施方案1的组合物，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。20.实施方案1的组合物，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。21.实施方案1的组合物，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。22.实施方案1的组合物，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。23.实施方案1的组合物，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。24.实施方案1的组合物，其中所述嵌合多肽和指导核酸作为核糖核蛋白复合物存在于所述组合物中。25.实施方案1的组合物，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。26.实施方案1的组合物，其中该组合物被配制用于口服给药。27.实施方案1的组合物，其中该组合物被配制为丸剂、片剂或胶囊。28.实施方案1的组合物，其中该组合物被配制为具有肠溶衣。29.实施方案1的组合物，其中该组合物被配制用于局部给药。30.实施方案1的组合物，其中该组合物被配制用于肠胃外给药。31.实施方案1的组合物，其中该组合物被配制用于鞘内给药。32.实施方案1的组合物，其中所述组合物进一步包含促进所述组合物进入包含靶核酸的细胞的试剂。33.实施方案1的组合物，其中该组合物进一步包含缓冲液。34.一种诱导细胞死亡的方法，该方法包括使细胞中的靶核酸与嵌合多肽接触，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域，从而诱导所述细胞的死亡。35.实施方案34的方法，其中所述细胞是癌细胞。36.实施方案34的方法，其中所述靶核酸包含与病症相关的序列。37.实施方案36的方法，其中所述病症是癌症。38.实施方案36的方法，其中所述病症是肺癌或胰腺癌。39.实施方案34的方法，其中所述靶核酸包括rna或dna。40.实施方案34的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。41.实施方案34的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。42.实施方案34的方法，其中所述靶核酸包含易位、对癌症为特异性的单核苷酸多态性或与癌症进展相关的序列。43.实施方案34的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。44.实施方案34的方法，其进一步包括使所述靶核酸与指导核酸接触，该指导核酸包含与所述靶核酸互补的序列。45.实施方案44的方法，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。46.实施方案34的方法，其进一步包括通过所述嵌合多肽位点特异性地切割所述靶核酸。47.实施方案46的方法，其进一步包括非特异性地切割所述细胞中的核酸。48.实施方案34的方法，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。49.实施方案58的方法，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。50.实施方案34的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域、cas12a结构域、cas12b结构域、cas12c结构域、cas12d结构域、cas12e结构域、cas12f结构域、cas12g结构域、cas12h结构域、cas12i结构域、cas13a结构域、cas13b结构域、cas14结构域或cas9结构域。51.实施方案34的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。52.实施方案34的方法，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。53.实施方案34的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分与aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagat具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列。54.实施方案34的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第一部分与序列attctaatacgactcactatagg具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列，并且其中所述第三部分与序列gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc具有至少约85％的序列同一性。55.实施方案34的方法，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。56.实施方案55的方法，其中所述第一结构域的诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。57.实施方案34的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t4结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。58.实施方案34的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。59.实施方案34的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。60.实施方案34的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。61.实施方案34的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。62.实施方案34的方法，其中所述嵌合多肽以核糖核蛋白复合物的形式递送至所述细胞，该核糖核蛋白复合物包含所述嵌合多肽和包含与所述靶核酸互补的序列的指导核酸。63.实施方案34的方法，其进一步包括在所述嵌合多肽切割所述靶核酸后终止所述嵌合多肽在受试者中的活性。64.实施方案63的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用以下至少一种来进行：对所述嵌合多肽为特异性的抗体或znso4。65.一种组合物，其包含：a)嵌合多肽，其包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域；以及b)指导核酸，其包含：第一区段，其包含与健康细胞的第一染色体的一部分具有完全互补性的至少5个连续碱基，以及第二区段，其包含与健康细胞的第二染色体的一部分具有完全互补性的至少5个连续碱基。66.实施方案65的组合物，其中所述第一区段包含与bcr基因的一部分的互补性，并且所述第二区段包含与abl基因的一部分的互补性。67.实施方案65的组合物，其中所述第一区段包含与tel基因的一部分的互补性，并且所述第二区段包含与aml基因的一部分的互补性。68.实施方案65的组合物，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。69.实施方案65的组合物，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。70.实施方案65的组合物，其中所述第一结构域包括cas9结构域。71.实施方案65的组合物，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。72.实施方案65的组合物，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。73.实施方案65的组合物，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。74.实施方案73的组合物，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。75.实施方案65的组合物，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex1结构域。76.实施方案65的组合物，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。77.实施方案65的组合物，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。78.实施方案65的组合物，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的结构域。79.实施方案65的组合物，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。80.实施方案65的组合物，其中所述嵌合多肽和指导核酸作为核糖核蛋白复合物存在于所述组合物中。81.实施方案65的组合物，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。82.实施方案65的组合物，其中该组合物被配制用于口服给药。83.实施方案65的组合物，其中该组合物被配制为丸剂、片剂或胶囊。84.实施方案65的组合物，其中该组合物被配制为具有肠溶衣。85.实施方案65的组合物，其中该组合物被配制用于局部给药。86.实施方案65的组合物，其中该组合物被配制用于肠胃外给药。87.实施方案65的组合物，其中该组合物被配制用于鞘内给药。88.实施方案65的组合物，其中所述组合物进一步包含促进所述组合物进入包含靶核酸的细胞的试剂。89.实施方案65的组合物，其中该组合物进一步包含缓冲液。90.一种改善患有癌症的受试者的症状的方法，该方法包括使所述受试者中的靶核酸与实施方案65至89中任一项的组合物接触。91.实施方案90的方法，其中所述靶核酸在涉及第一染色体的所述部分和第二染色体的所述部分的染色体易位区域中。92.实施方案90的方法，其中所述靶核酸与所述指导核酸的第一区段和第二区段杂交。93.实施方案90的方法，其进一步包括向所述受试者施用所述组合物，其中嵌合多肽和所述指导核酸在所述组合物中的核糖核蛋白复合物中。94.实施方案90的方法，其进一步包括在所述嵌合多肽切割所述靶核酸后终止所述嵌合多肽在受试者中的活性。95.实施方案90的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用对所述嵌合多肽为特异性的抗体来进行。96.实施方案90的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用znso4来进行。97.一种用于靶向病原体的组合物，该组合物包含：a)嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域；以及b)包含与病原体的靶核酸互补的序列的指导核酸。98.实施方案97的组合物，其中所述靶核酸包括rna。99.实施方案97的组合物，其中所述靶核酸包括dna。100.实施方案97的组合物，其中所述病原体是病毒。101.实施方案97的组合物，其中所述病原体是细菌。102.实施方案97的组合物，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。103.实施方案102的组合物，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。104.实施方案97的组合物，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。105.实施方案97的组合物，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。106.实施方案97的组合物，其中所述第一结构域包括cas9结构域。107.实施方案97的组合物，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。108.实施方案107的组合物，其中所述第一结构域的诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。109.实施方案97的组合物，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。110.实施方案97的组合物，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。111.实施方案97的组合物，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。112.实施方案97的组合物，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。113.实施方案97的组合物，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。114.实施方案97的组合物，其中所述嵌合多肽和指导核酸作为核糖核蛋白复合物存在于所述组合物中。115.实施方案97的组合物，其中所述指导核酸不与宿主核酸结合。116.实施方案97的组合物，其中该组合物被配制用于口服给药。117.实施方案97的组合物，其中该组合物被配制为丸剂、片剂或胶囊。118.实施方案97的组合物，其中该组合物被配制为具有肠溶衣。119.实施方案97的组合物，其中该组合物被配制用于局部给药。120.实施方案97的组合物，其中该组合物被配制用于肠胃外给药。121.实施方案97的组合物，其中该组合物被配制用于鞘内给药。122.实施方案97的组合物，其中所述组合物进一步包含促进所述组合物进入包含靶核酸的细胞的试剂。123.实施方案97的组合物，其中该组合物进一步包含缓冲液。124.一种靶向受试者中的病原体的方法，该方法包括使受试者中的病原体的靶核酸与实施方案97至123中任一项的组合物接触。125.实施方案124的方法，其中所述嵌合多肽切割所述靶核酸。126.实施方案124的方法，其进一步包括向所述受试者施用所述组合物，其中嵌合多肽和所述指导核酸在所述组合物中的核糖核蛋白复合物中。127.实施方案124的方法，其进一步包括在所述嵌合多肽切割所述靶核酸后终止所述嵌合多肽在受试者中的活性。128.实施方案124的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用对所述嵌合多肽为特异性的抗体来进行。129.实施方案124的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用znso4来进行。130.一种改善患有病症的受试者的症状的方法，该方法包括向所述受试者施用核糖核蛋白复合物，该核糖核蛋白复合物包含：(i)具有序列特异性内切核酸酶活性的多肽；和(ii)包含与所述受试者中的靶核酸互补的序列的指导核酸。131.实施方案130的方法，其中所述病症是癌症。132.实施方案130的方法，其中所述病症是肺癌或胰腺癌。133.实施方案130的方法，其中所述靶核酸包含与所述病症相关的序列。134.实施方案130的方法，其中所述靶核酸包括rna。135.实施方案130的方法，其中所述靶核酸包括dna。136.实施方案130的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。137.实施方案130的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。138.实施方案130的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。139.实施方案138的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。140.实施方案139的方法，其中所述靶核酸包含易位。141.实施方案130的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性。142.实施方案130的方法，其中所述靶核酸包含与癌症进展相关的序列。143.实施方案130的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。144.实施方案130的方法，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。145.实施方案130的方法，其进一步包括通过所述多肽位点特异性地切割所述靶核酸。146.实施方案130的方法，其进一步包括通过所述多肽非特异性地切割包含所述靶核酸的细胞中的其他核酸。147.实施方案130的方法，其中所述多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。148.实施方案147的方法，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。149.实施方案130的方法，其中所述多肽包含cas12a(或cpf1)结构域。150.实施方案130的方法，其中所述多肽包含cas13a或cas13b结构域。151.实施方案130的方法，其中所述多肽包含cas9结构域。152.实施方案130的方法，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。153.实施方案130的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分与aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagat具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列。154.实施方案130的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第一部分与序列attctaatacgactcactatagg具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列，并且其中所述第三部分与序列gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc具有至少约85％的序列同一性。155.实施方案130的方法，其中所述多肽是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。156.实施方案155的方法，其中所述多肽是嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域。157.实施方案156的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。158.实施方案156的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。159.实施方案156的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。160.实施方案156的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。161.实施方案156的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。162.实施方案130的方法，其进一步包括在所述多肽切割所述靶核酸后终止所述多肽在受试者中的活性。163.实施方案130的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用对所述多肽为特异性的抗体来进行。164.实施方案130的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用znso4来进行。165.一种改善患有癌症的受试者的症状的方法，该方法包括：a)向所述受试者施用选自下组的疗法：化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法及其任意组合；以及b)使所述受试者中的靶核酸与嵌合多肽接触，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域。166.实施方案165的方法，其中所述疗法是免疫疗法。167.实施方案166的方法，其中所述免疫疗法包括cart细胞疗法。168.实施方案166的方法，其中所述免疫疗法包括施用曲妥珠单抗。169.实施方案165的方法，其中所述疗法是化学疗法。170.实施方案169的方法，其中所述化学疗法包括施用甲磺酸伊马替尼。171.实施方案165的方法，其中与单独的a)或b)的治疗效果相比，a)和b)的组合提供增强的治疗效果。172.实施方案165的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。173.实施方案165的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。174.实施方案165的方法，其中所述靶核酸包含与所述癌症相关的序列。175.实施方案165的方法，其中所述靶核酸包括rna。176.实施方案165的方法，其中所述靶核酸包括dna。177.实施方案165的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。178.实施方案177的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。179.实施方案177的方法，其中所述靶核酸包含易位。180.实施方案165的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性。181.实施方案165的方法，其中所述靶核酸包含与癌症进展相关的序列。182.实施方案165的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。183.实施方案165的方法，其进一步包括使所述靶核酸与指导核酸接触，该指导核酸包含与所述靶核酸互补的序列。184.实施方案183的方法，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。185.实施方案183的方法，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。186.实施方案183的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分与aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagat具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列。187.实施方案183的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第一部分与序列attctaatacgactcactatagg具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列，并且其中所述第三部分与序列gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc具有至少约85％的序列同一性。188.实施方案165的方法，其进一步包括通过所述嵌合多肽位点特异性地切割所述靶核酸。189.实施方案165的方法，其进一步包括通过所述嵌合多肽非特异性地切割包含所述靶核酸的细胞中的其他核酸。190.实施方案165的方法，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。191.实施方案165的方法，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。192.实施方案165的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。193.实施方案165的方法，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。194.实施方案165的方法，其中所述第一结构域包括cas9结构域。195.实施方案165的方法，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。196.实施方案195的方法，其中所述第一结构域的诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。197.实施方案165的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。198.实施方案165的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。199.实施方案165的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。200.实施方案165的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。201.实施方案165的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。202.实施方案165的方法，其中所述嵌合多肽以核糖核蛋白复合物的形式递送至所述细胞，该核糖核蛋白复合物包含所述嵌合多肽和包含与所述靶核酸互补的序列的指导核酸。203.实施方案165的方法，其进一步包括在所述嵌合多肽切割所述靶核酸后终止所述嵌合多肽在受试者中的活性。204.实施方案203的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用对所述嵌合多肽为特异性的抗体来进行。205.实施方案203的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用znso4来进行。206.一种改善患有癌症的受试者的症状的方法，该方法包括：a)在第一时间点量化所述受试者的第一健康状况；b)向所述受试者施用选自下组的疗法：化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法及其任意组合；c)在所述疗法后的第二时间点量化所述受试者的第二健康状况；d)使所述受试者中的靶核酸与嵌合多肽接触，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域；以及e)在所述接触后的第三时间点量化所述受试者的第三健康状况。207.实施方案206的方法，其中所述量化第一健康状况、第二健康状况或第三健康状况包括使用以下一项或多项：活检、成像检查、遗传学检查、肿瘤分子概况分析、实验室检验或核酸测序。208.实施方案206的方法，其中所述疗法是免疫疗法。209.实施方案208的方法，其中所述免疫疗法包括cart细胞疗法。210.实施方案208的方法，其中所述免疫疗法包括施用曲妥珠单抗。211.实施方案206的方法，其中所述疗法是化学疗法。212.实施方案211的方法，其中所述化学疗法包括施用甲磺酸伊马替尼。213.实施方案206的方法，其中所述受试者的第三健康状况好于所述第一健康状况和所述第二健康状况。214.实施方案206的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。215.实施方案206的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。216.实施方案206的方法，其中所述靶核酸包含与所述癌症相关的序列。217.实施方案206的方法，其中所述靶核酸包括rna。218.实施方案206的方法，其中所述靶核酸包括dna。219.实施方案206的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。220.实施方案219的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。221.实施方案219的方法，其中所述靶核酸包含易位。222.实施方案206的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性。223.实施方案206的方法，其中所述靶核酸包含与癌症进展相关的序列。224.实施方案206的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。225.实施方案206的方法，其进一步包括使所述靶核酸与指导核酸接触，该指导核酸包含与所述靶核酸互补的序列。226.实施方案225的方法，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。227.实施方案225的方法，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。228.实施方案225的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分与aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagat具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列。229.实施方案225的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第一部分与序列attctaatacgactcactatagg具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列，并且其中所述第三部分与序列gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc具有至少约85％的序列同一性。230.实施方案206的方法，其进一步包括通过所述嵌合多肽位点特异性地切割所述靶核酸。231.实施方案206的方法，其进一步包括通过所述嵌合多肽非特异性地切割包含所述靶核酸的细胞中的其他核酸。232.实施方案206的方法，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。233.实施方案232的方法，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。234.实施方案206的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。235.实施方案206的方法，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。236.实施方案206的方法，其中所述第一结构域包括cas9结构域。237.实施方案206的方法，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。238.实施方案237的方法，其中所述第一结构域的诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。239.实施方案206的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。240.实施方案206的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。241.实施方案206的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。242.实施方案206的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。243.实施方案206的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。244.实施方案206的方法，其中所述嵌合多肽以核糖核蛋白复合物的形式递送至所述细胞，该核糖核蛋白复合物包含所述嵌合多肽和包含与所述靶核酸互补的序列的指导核酸。245.实施方案206的方法，其进一步包括在所述嵌合多肽切割所述靶核酸后终止所述嵌合多肽在受试者中的活性。246.实施方案245的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用对所述嵌合多肽为特异性的抗体来进行。247.实施方案245的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用znso4来进行。248.一种终止受试者中的多肽活性的方法，该方法包括：a)用具有序列特异性内切核酸酶活性的多肽切割受试者中的靶核酸；以及b)终止所述受试者中所述多肽的活性。249.实施方案248的方法，其中所述终止包括向所述受试者施用对所述多肽为特异性的抗体。250.实施方案248的方法，其中所述终止包括向所述受试者施用znso4。251.实施方案248的方法，其中所述受试者患有病症。252.实施方案251的方法，其中所述病症是癌症。253.实施方案251的方法，其中所述病症是肺癌或胰腺癌。254.实施方案251的方法，其中所述靶核酸包含与所述病症相关的序列。255.实施方案248的方法，其中所述靶核酸包括rna。256.实施方案248的方法，其中所述靶核酸包括dna。257.实施方案248的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。258.实施方案248的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。259.实施方案248的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。260.实施方案248的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。261.实施方案260的方法，其中所述靶核酸包含易位。262.实施方案248的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性。263.实施方案248的方法，其中所述靶核酸包含与癌症进展相关的序列。264.实施方案248的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。265.实施方案248的方法，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。266.实施方案248的方法，其进一步包括通过所述多肽位点特异性地切割所述靶核酸。267.实施方案248的方法，其进一步包括通过所述多肽非特异性地切割包含所述靶核酸的细胞中的其他核酸。268.实施方案248的方法，其中所述多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。269.实施方案248的方法，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。270.实施方案248的方法，其中所述多肽包含cas12a(或cpf1)结构域。271.实施方案248的方法，其中所述多肽包含cas13a或cas13b结构域。272.实施方案248的方法，其中所述多肽包含cas9结构域。273.实施方案248的方法，其中所述多肽是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。274.实施方案248的方法，其中所述多肽是嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域。275.实施方案248的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。276.实施方案248的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。277.实施方案248的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。278.实施方案248的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。279.实施方案248的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。280.一种用于靶向两种或更多种核酸的组合物，该组合物包含：a)嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域；以及b)两种或更多种指导核酸，其中每种指导核酸包含与细胞中的不同靶核酸互补的序列。281.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸包括rna。282.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸包括dna。283.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸包含与病症相关的序列。284.实施方案283的组合物，其中所述病症是癌症。285.实施方案283的组合物，其中所述病症是肺癌或胰腺癌。286.实施方案283的组合物，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中的序列的序列。287.实施方案283的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分与aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagat具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列。288.实施方案283的组合物，其中所述指导核酸包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第一部分与序列attctaatacgactcactatagg具有至少约85％的序列同一性，其中所述第二部分包含与癌症相关基因的区域互补的序列，并且其中所述第三部分与序列gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc具有至少约85％的序列同一性。289.实施方案280的组合物，其中所述细胞是癌细胞。290.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。291.实施方案290的组合物，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。292.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性。293.实施方案291的组合物，其中所述靶核酸包含易位。294.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸包含与癌症进展相关的序列。295.实施方案280的组合物，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。296.实施方案280的组合物，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。297.实施方案296的组合物，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。298.实施方案280的组合物，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。299.实施方案280的组合物，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。300.实施方案280的组合物，其中所述第一结构域包括cas9结构域。301.实施方案280的组合物，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。302.实施方案301的组合物，其中所述第一结构域的诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。303.实施方案280的组合物，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。304.实施方案280的组合物，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。305.实施方案280的组合物，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。306.实施方案280的组合物，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。307.实施方案280的组合物，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。308.实施方案280的组合物，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。309.实施方案280的组合物，其中该组合物包含一种或多种核糖核蛋白复合物，其中每种核糖核蛋白复合物包含嵌合多肽和来自两种或更多种指导核酸的指导核酸。310.实施方案280的组合物，其中该组合物被配制用于口服给药。311.实施方案280的组合物，其中该组合物被配制为丸剂、片剂或胶囊。312.实施方案280的组合物，其中该组合物被配制为具有肠溶衣。313.实施方案280的组合物，其中该组合物被配制用于局部给药。314.实施方案280的组合物，其中该组合物被配制用于肠胃外给药。315.实施方案280的组合物，其中该组合物被配制用于鞘内给药。316.实施方案280的组合物，其中所述组合物进一步包含促进所述组合物进入包含靶核酸的细胞的试剂。317.实施方案280的组合物，其中该组合物进一步包含缓冲液。318.一种改善患有病症的受试者的症状的方法，该方法包括使所述受试者中的靶核酸与实施方案280至317中任一项的组合物接触。319.实施方案318的方法，其中所述病症是癌症。320.实施方案318的方法，其中所述病症是肺癌或胰腺癌。321.实施方案318的方法，其进一步包括通过所述嵌合多肽切割所述靶核酸。322.实施方案318的方法，其进一步包括诱导所述细胞的死亡。323.实施方案318的方法，其进一步包括在所述嵌合多肽切割所述靶核酸后终止所述嵌合多肽在受试者中的活性。324.实施方案323的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用对所述嵌合多肽为特异性的抗体来进行。325.实施方案323的方法，其中所述终止通过向所述受试者施用znso4来进行。326.一种改善患有癌症的受试者的症状的方法，该方法包括：a)获得所述受试者的生物样品；b)确定所述生物样品中核酸的序列信息；c)从所述序列信息鉴定靶核酸，其中所述靶核酸与所述癌症相关；d)施用包含核糖核蛋白复合物的组合物，该核糖核蛋白复合物包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域；以及包含与所述靶核酸的一部分互补的序列的指导核酸；e)通过所述嵌合多肽在所述受试者的癌细胞中位点特异性地切割所述靶核酸；f)通过所述嵌合多肽非特异性地切割所述癌细胞中的其他核酸，从而诱导所述癌细胞的细胞死亡；以及g)向所述受试者施用终止剂，从而终止所述嵌合多肽的活性。327.实施方案326的方法，其中所述生物样品选自：血液、血浆、唾液、体液、肿瘤样品、活检样品、包含无细胞核酸的样品或其任意组合。328.实施方案326的方法，其中所述确定包括测序。329.实施方案326的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。330.实施方案326的方法，其中所述终止剂是对所述嵌合多肽为特异性的抗体。331.实施方案326的方法，其中所述终止剂是znso4。332.实施方案326的方法，其中所述靶核酸包括rna。333.实施方案326的方法，其中所述靶核酸包括dna。334.实施方案326的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。335.实施方案334的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环和等臂染色体。336.实施方案334的方法，其中所述靶核酸包含易位。337.实施方案326的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性。338.实施方案326的方法，其中所述靶核酸包含与癌症进展相关的序列。339.实施方案326的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl或her2。340.实施方案326的方法，其中所述指导核酸不与健康细胞中的核酸结合。341.实施方案326的方法，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。342.实施方案341的方法，其中所述非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。343.实施方案326的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。344.实施方案326的方法，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。345.实施方案326的方法，其中所述第一结构域包括cas9结构域。346.实施方案326的方法，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中的序列的序列。347.实施方案326的方法，其中所述第一结构域是包含诱导型非特异性核酸酶活性的crispr相关(cas)蛋白结构域。348.实施方案347的方法，其中所述第一结构域的诱导型非特异性核酸酶活性通过所述第一结构域对靶核酸的位点特异性切割而被激活。349.实施方案326的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoiii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。350.实施方案326的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。351.实施方案326的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。352.实施方案326的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。353.实施方案326的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。354.一种选择性诱导细胞中的细胞死亡的方法，该方法包括：a)施用嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域、包含与所述细胞中的靶核酸互补的序列的指导核酸；以及b)切割靶核酸，从而诱导细胞死亡。355.实施方案354的方法，其中所述靶核酸与病症相关。356.实施方案354的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。357.实施方案354的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。358.实施方案354的方法，其中所述靶核酸包含与所述癌症相关的序列。359.实施方案354的方法，其中所述靶核酸包括rna。360.实施方案354的方法，其中所述靶核酸包括dna。361.实施方案354的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。362.实施方案361的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环、拷贝数变异、插入缺失和等臂染色体。363.实施方案354的方法，其中所述细胞在多个细胞中。364.实施方案364的方法，其中所述多个细胞包含健康细胞。365.实施方案364的方法，其中在施用后，所述健康细胞存活。366.实施方案364的方法，其中在施用后，所述健康细胞增殖。367.实施方案354的方法，其中所述切割包括在所述细胞中的一个或超过一个切割位点处切割。368.实施方案355的方法，其中所述病症是癌症。369.实施方案368的方法，其中所述癌症包括肺癌或胰腺癌。370.实施方案354的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性、易位或与癌症进展相关的序列。371.实施方案354的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：brca-1、braf、bcr-abl、her2、kif5a、irx1、adamts16、gnpda2、kcne2、slc15a5、smim11、dach2、herc2p2、cd68shbg、erbb2、krt16、linc00536、trps1、cdk8、trappc9、herc2p2、sirpb1、mrc1、atp11a、poteb、herc2p2、prdm9、cdkn2b、hpv、line2(mt2)、ccr5或hprt1。372.实施方案354的方法，其中所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。373.实施方案372的方法，其中所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。374.实施方案354的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域、cas12a结构域、cas12b结构域、cas12c结构域、cas12d结构域、cas12e结构域、cas12f结构域、cas12g结构域、cas12h结构域、cas12i结构域、cas13a结构域、cas13b结构域、cas14结构域或cas9结构域。375.实施方案354的方法，其中所述第一结构域包括cas12a(或cpf1)结构域。376.实施方案354的方法，其中所述第一结构域包括cas13a或cas13b结构域。377.实施方案354的方法，其中所述第一结构域包括cas9结构域。378.实施方案354的方法，其中所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。379.实施方案354的方法，其中所述第二结构域包括rece结构域、recj结构域、t5结构域、λ外切核酸酶结构域、recbcd结构域、dnapoli小片段结构域、exoi结构域、exoii结构域、exovii结构域、exot结构域、trex1结构域或trex2结构域。380.实施方案354的方法，其中所述嵌合多肽产生3’oh突出端。381.实施方案354的方法，其中所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’oh。382.实施方案354的方法，其中所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。383.实施方案354的方法，其中所述第二结构域包含绿豆核酸酶。384.实施方案364的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。实施例实施例1.癌症背景中的示例性实现方式测试个体的肿瘤组织，以确定是否存在适当的靶标。使用来自患者的癌症标本的全基因组序列分析，鉴定了snp或与正常细胞相比显示出足够特异性的其他突变。合成具有与癌症特异性snp互补的序列的多个grna分子。这些合成的grna在体内特异性识别癌细胞中的snp，并诱导crisprplustm的基因组编辑和非特异性核酸酶活性的激活。crisprplustm的基因组编辑和非特异性核酸酶功能的癌细胞特异性激活在离体系统中使用靶dna切割和核酸酶活性测定得到了初步验证。向患者施用选定的一组预装配的grna和crisprplustm(包括crispr)蛋白复合物。通过施用选定的一组预装配的grna和crisprplustm，crisprplustm-grna复合物进入细胞，并筛选基因组dna以检测细胞中的互补snp序列。在不含snp或其他突变序列的正常细胞中，crisprplustm-grna复合物没有被激活，因此，几乎没有发生或根本没有发生靶向或未靶向的细胞核酸降解。然而，在含有与grna互补的snp或其他突变序列的癌细胞中，基因组编辑功能被激活，随后crisprplustm-grna复合物的非特异性核酸酶活性被激活。激活的基因组编辑功能去除携带癌症特异性snp或其他突变或突变序列的核酸。然后，激活的非特异性核酸酶功能降解细胞双链和单链dna/rna分子，进而以癌症特异性方式诱导细胞死亡(参见图2)。施用方案后可以施用核糖核蛋白复合物，如crispr或crisprplustm终止剂，以去除受试者体内残留的crisprplustm-grna复合物的活性。随后施用抗-cas抗体以中和crispr或crisprplustm蛋白的作用。治疗结束后crispr或crisprplustm-grna复合物的这一终止过程使crispr或crisprplustm的脱靶活性引起的任何潜在副作用降至最低。实施例2.代表性的cas9核酸和蛋白质。大量crispr/cas复合物与本文的公开内容一致。下面以核苷酸和氨基酸形式提供示例性cas序列——spycas9的序列。>nc_002737.2:854751-858857酿脓链球菌m1gasatggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcaca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glnaldietlnndehawdvvveefdgyrqiwrkrgvmpmlralmsarniaenllataggerrltdilhisellqeagtqlesehalvrwlsqhilepdsnassqqmrlesdkhlvqivtihkskgleyplvwlpfitnfrvqeqafyhdrhsfeavldlnaapesvdlaeaerlaedlrllyvaltrsvwhcslgvaplvrrrgdkkgdtdvhqsalgrllqkgepqdaaglrtciealcdddiawqtaqtgdnqpwqvndvstaelnaktlqrlpgdnwrvtsysglqqrghgiaqdlmprldvdaagvasvveeptltphqfprgaspgtflhslfedldftqpvdpnwvreklelggfesqwepvltewitavlqaplnetgvslsqlsarnkqvemefylpisepliasqldtlirqfdplsagcpplefmqvrgmlkgfidlvfrhegryylldyksnwlgedssaytqqamaaamqahrydlqyqlytlalhrylrhriadydyehhfggviylflrgvdkehpqqgiyttrpnaglialmdemfagmtleea>recbcd_reccmlrvyhsnrldvlealmefivererlddpfepemilvqstgmaqwlqmtlsqkfgiaanidfplpasfiwdmfvrvlpeipkesafnkqsmswklmtllpqlleredftllrhyltddsdkrklfqlsskaadlfdqylvyrpdwlaqwetghlveglgeaqawqaplwkalveythqlgqprwhranlyqrfietlesattcppglpsrvficgisalppvylqalqalgkhieihllftnpcryywgdikdpaylaklltrqrrhsfedrelplfrdsenagqlfnsdgeqdvgnpllaswgklgrdyiyllsdlessqeldafvdvtpdnllhniqsdilelenravagvnieefsrsdnkrpldpldssitfhvchspqrevevlhdrllamleedptltprdiivmvadidsyspfiqavfgsapadrylpyaisdrrarqshpvleafisllslpdsrfvsedvlalldvpvlaarfditeeglrylrqwvnesgirwgidddnvrelelpatgqhtwrfgltrmllgyamesaqgewqsvlpydessgliaelvghlasllmqlniwrrglaqerpleewlpvcrdmlnafflpdaeteaamtlieqqwqaiiaeglgaqygdavplsllrdelaqrldqerisqrflagpvnictlmpmrsipfkvvcllgmndgvyprqlaplgfdlmsqkpkrgdrsrrdddrylflealisaqqklyisyigrsiqdnserfpsvlvqelidyigqshylpgdealncdesearvkahltclhtrmpfdpqnyqpgerqsyarewlpaasqagkahsefvqplpftlpetvpletlqrfwahpvraffqmrlqvnfrtedseipdtepfileglsryqinqqllnalveqddaerlfrrfraagdlpygafgeifwetqcqemqqladrviacrqpgqsmeidlacngvqitgwlpqvqpdgllrwrpsllsvaqgmqlwlehlvycasggngesrlflrkdgewrfpplaaeqalhylsqliegyregmsapllvlpesggawlktcydaqndamldddstlqkartkflqayegnmmvrgegddiwyqrlwrqltpetmeaiveqsqrfllplfrfnqs>recbcd_recdmklqkqlleavehkqlrpldvqfaltvagdehpavtlaaallshdageghvclplsrlenneashpllatcvseigelqnweecllasqavsrgdeptpmilcgdrlylnrmwcnertvarffnevnhaievdeallaqtldklfpvsdeinwqkvaaavaltrrisvisggpgtgktttvakllaaliqmadgercrirlaaptgkaaarlteslgkalrqlpltdeqkkripedastlhrllgaqpgsqrlrhhagnplhldvlvvdeasmidlpmmsrlidalpdharviflgdrdqlasveagavlgdicayanagftaerarqlsrltgthvpagtgteaaslrdslcllqksyrfgsdsgigqlaaainrgdktavktvfqqdftdiekrllqsgedyiamleealagygryldllqaraepdliiqafneyqllcalregpfgvaglnerieqfmqqkrkihrhphsrwyegrpvmiarndsalglfngdigialdrgqgtrvwfampdgniksvqpsrlpehettwamtvhksqgsefdhaalilpsqrtpvvtrelvytavtrarrrlslyaderilsaaiatrterrsglaalfssre>外切脱氧核糖核酸酶immndgkqqstflfhdyetfgthpaldrpaqfaairtdsefnvigepevfyckpaddylpqpgavlitgitpqearakgeneaafaarihslftvpktcilgynnvrfddevtrnifyrnfydpyawswqhdnsrwdlldvmracyalrpeginwpenddglpsfrlehltkangiehsnahdamadvyatiamaklvktrqprlfdylfthrnkhklmalidvpqmkplvhvsgmfgawrgntswvaplawhpenrnavimvdlagdisplleldsdtlrerlytaktdlgdnaavpvklvhinkcpvlaqantlrpedadrlginrqhcldnlkilrenpqvrekvvaifaeaepftpsdnvdaqlyngffsdadraamkivleteprnlpalditfvdkriekllfnyrarnfpgtldyaeqqrwlehrrqvftpeflqgyadelqmlvqqyaddkekvallkalwqyaeeiv>外切脱氧核糖核酸酶iiimkfvsfninglrarphqleaivekhqpdviglqetkvhddmfpleevaklgynvfyhgqkghygvalltketpiavrrgfpgddeeaqrriimaeipsllgnvtvingyfpqgesrdhpikfpakaqfyqnlqnyletelkrdnpvlimgdmnisptdldigigeenrkrwlrtgkcsflpeerewmdrlmswglvdtfrhanpqtadrfswfdyrskgfddnrglridlllasqplaeccvetgidyeirsmekpsdhapvwatfrr>绿豆外切核酸酶mqtlqmslltqpyvqprfpckryptfsascrtqktaitktekvffsesfdqtrctqplsekkkrvffldvnplcyegskpslrsfgrwlslflhqvsltdpviavidgeggsehrrkllpsykahrkkfmrhmssghvgrshqvindvlgkcnvpvikvagheaddvvatlagqvvnkgfrvvigspdkdfkqlisedvqivmplpelqrwsfytlrhyrdqyncdpesdlsfrcivgdevdgvpgiqhlvpsfgrktamklikkhgsletllnaaairtvgrpyaqdalknhadylrrnyevlalkrdvniqlydewlvkrdnhndktalssffkylgeskelsyngrpisyng>recjvkqqiqlrrrevdetadlpaelppllrrlyasrgvrsaqelersvkgmlpwqqlsgvekaveilynafregtriivvgdfdadgatstalsvlamrslgcsnidylvpnrfedgyglspevvdqahargaqlivtvdngisshagveharslgipvivtdhhlpgdtlpaaeaiinpnlrdcnfpskslagvgvafylmlalrtflrdqgwfderniaipnlaelldlvalgtvadvvpldannriltwqgmsriragkcrpgikallevanrdaqklaasdlgfalgprlnaagrlddmsvgvalllcdnigearvlaneldalnqtrkeieqgmqiealtlceklersrdtlpgglamyhpewhqgvvgilasrikerfhrpviafapagdgtlkgsgrsiqglhmrdalerldtlypgmmlkfgghamaaglsleedkfklfqqrfgelvtewldpsllqgevvsdgplspaemtmevaqllrdagpwgqmfpeplfdghfrllqqrlvgerhlkvmvepvgggplldgiafnvdtalwpdngvrevqlaykldinefrgnrslqiiidniwpi>recemstkplfllrkakkssgepdvvlwasndfestcatldylivksgkklssyfkavatnfpvvndlpaegeidftwseryqlskdsmtwelkpgaapdnahyqgntnvngedmteieenmllpisgqelpirwlaqhgsekpvthvsrdglqalhiaraeelpavtalavshktslldpleirelhklvrdtdkvfpnpgnsnlglitaffeaylnadytdrglltkewmkgnrvshitrtasganagggnltdrgegfvhdltslardvatgvlarsmdldiynlhpahakrieeiiaenkppfsvfrdkfitmpggldysraivvasvkeapigievipahvteylnkvltetdhanpdpeivdiacgrssapmpqrvteegkqddeekpqpsgttaveqgeaetmepdatehhqdtqpldaqsqvnsvdakyqelraelhearknipsknpvdddkllaasrgefvdgisdpndpkwvkgiqtrdcvyqnqpetektspdmnqpepvvqqepeiacnacgqtggdncpdcgavmgdatyqetfdeesqveakendpeemegaehphnenagsdphrdcsdetgevadpvivediepgiyygisnenyhagpgisksqlddiadtpalylwrknapvdttktktldlgtafhcrvlepeefsnrfivapefnrrtnagkeeekaflmecastgktvitaeegrkielmyqsvmalplgqwlvesaghaessiywedpetgilcrcrpdkiipefhwimdvkttadiqrfktayydyryhvqdafysdgyeaqfgvqptfvflvasttiecgrypveifmmgeeaklagqqeyhrnlrtlsdclntdewpaiktlslprwakeyand>t5masrrnlmivdgtnlgfrfkhnnskkpfassyvstiqslaksysarttivlgdkgksvfrlehlpeykgnrdekyaqrteeekaldeqffeylkdafelckttfptftirgveaddmaayivklighlydhvwlistdgdwdtlltdkvsrfsfttrreyhlrdmyehhnvddveqfislkaimgdlgdnirgvegigakrgyniirefgnvldiidqlplpgkqkyiqnlnaseellfrnlilvdlptycvdaiaavgqdvldkftkdileiaeq>λ外切核酸酶mtpdiilqrtgidvraveqgddawhklrlgvitasevhnviakprsgkkwpdmkmsyfhtllaevctgvapevnakalawgkqyendartlfeftsgvnvtespiiyrdesmrtacspdglcsdgnglelkcpftsrdfmkfrlggfeaiksaymaqvqysmwvtrknawyfanydprmkreglhyvvierdekymasfdeivpefiekmdealaeigfvfgeqwr>外切核酸酶vii小单位mpkkneapasfekalseleqivtrlesgdlpleealnefergvqlarqgqaklqqaeqrvqillsdnedasltpftpdne>外切核酸酶vii大单位mlpsqspaiftvsrlnqtvrlllehemgqvwisgeisnftqpasghwyftlkddtaqvrcamfrnsnrrvtfrpqhgqqvlvranitlyeprgdyqiivesmqpagegllqqkyeqlkaklqaeglfdqqykkplpspahcvgvitsktgaalhdilhvlkrrdpslpviiypaavqgddapgqivraielanqrnecdvlivgrgggsledlwsfndervaraiftsripvvsavghetdvtiadfvadlraptpsaaaevvsrnqqellrqvqstrqrlemamdyylanrtrrftqihhrlqqqhpqlrlarqqtmlerlqkrmsfalenqlkrtgqqqqrltqrlnqqnpqpkihraqtriqqleyrlaetlraqlsatrerfgnavthleavsplstlargysvttatdgnvlkkvkqvkagemlttrledgwiesevkniqpvkksrkkvh实施例5.体外核糖核蛋白特异性测定。crispr/cas12a核酸酶复合物在dhcr7核酸向导周围装配。针对包含靶序列的dna#1和非靶对照dna#2测定活性。通过凝胶电泳测量输出，以测定核酸内切活性(通过“切割的dna#1”条带的存在来证明)和外切核酸酶活性(通过不存在条带来证明)。在图3的1.5小时(顶部)和24小时(底部)测定活性。从左侧查看结果，可以看到dna序列梯，随后是仅含dna#1和dna#2的核酸对照。在泳道3处，可以看到具有底物指示活性的装配好的核糖核蛋白复合物。在1.5小时，通过dna#1切割条带的存在明显看出核酸内切活性，而在24小时，核酸内切和核酸外切活性的组合消除了切割的和未切割的dna#1条带。泳道4表明在不存在具有已被活性靶序列分子(在这种情况下为dna#1)激活的指导rna的装配复合物的情况下，没有脱靶内切核酸酶或外切核酸酶活性发生。泳道5表明在未装配的复合物的存在下，没有脱靶内切核酸酶或外切核酸酶活性发生。在泳道6处，可以看到激活的复合物在24小时时表现出非特异性核酸酶活性，而在1.5小时时则没有。泳道7表明缺乏指导rna的复合物不显示外切核酸酶活性。这些结果表明在crispr/cas核糖核蛋白复合物中同时具有序列特异性和时间特异性的益处，以实现靶核酸的特异性降解，例如在癌细胞或病原体细胞中。实施例6.体内核糖核蛋白特异性测定。为了研究crispr/cas核酸酶是否以其特异性核酸酶活性依赖性方式对细胞具有细胞毒性作用，以时间依赖性方式评估了用crispr/cas12a(cpf1)核酸酶转染的人类无限增殖化细胞的活力。为了诱导核酸酶的特异性靶向活性，使用了两种crrna——特异性靶向人dhcr7基因的高特异性crrna(dhcr7)，和对水稻dwarf5基因具有特异性并且与人类基因组中的序列部分结合的第二指导crrna(osdwarf5_1)。用crispr/cas12a、两种crrna(dhcr7和osdwarf5_1)或其rnp复合体转染hela和hek293细胞。转染后24、48和72小时，使用wst-1试剂通过细胞活力测定评估细胞活力。结果显示在图4中。结果表明，用单独的crispr/cas12a或crrna转染的细胞的活力在转染后24、48和72小时没有变化，这表明单独的核酸酶或crrna对细胞没有毒性作用。相比之下，用具有rrna指导的dna靶向活性的rnp复合物转染的细胞的活力在转染后72小时急剧下降，这表明crispr/cas12a对细胞具有细胞毒性，这取决于其特异性dna靶向核酸酶活性。特异性的和特异性较低的crrna具有类似的对细胞的毒性作用。转染后24和48小时，类似转染的细胞的活力没有改变(hek293)或略有下降(hela)，这表明毒性需要一定的时间才能影响细胞。考虑到crispr/cas核酸酶在细胞中对靶序列的双链dna断裂从转染后24小时到48小时增加，随后诱导细胞毒性非特异性核酸酶活性，转染后72小时显示的毒性表明这是由其与crispr/cas12a的特异性核酸酶活性相关的功能引起的，而不是由不依赖于核酸酶的间接作用引起的。总之，结果表明crispr/cas12a核酸酶对细胞具有细胞毒性作用，这取决于crrna介导的特异性序列靶向活性。该结果还再次强调了对crispr/cas复合物的时间约束会通过降低在72小时观察到的脱靶毒性来提高特异性。用于测定的实验条件如下。将人类细胞转染hela和hek293细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)的dulbeco改良eagle培养基(dmem)中于37℃、5％co2培养箱中培养。将2.5x104个细胞接种在96孔板的每个孔中。使用1.2nm(100ng)或2.4nm(200ng)crispr/cas核酸酶和1.2nm(25ng)或2.4nm(50ng)crrna形成rnp复合物。使用lipofectaminecrisprmax试剂(thermofisherscientificinc.)，按照制造商的说明，将核酸酶、crrna和rnp复合物的每种组合转染到细胞中。简而言之，在一个管中，将核酸酶、crrna和rnp复合物的每种组合与1.7μllipofectaminecasplus试剂在5μlopti-mem中于室温(rt)下孵育5分钟。在另一个管中，将0.3μllipofectaminecrisprmax试剂与5μlopti-mem混合，并在室温下孵育5分钟。混合两种溶液，并在室温下再孵育10分钟。然后将混合溶液直接加至96孔板的一孔的细胞中。转染后24、48和72小时，使用wst-1试剂评估细胞活力。细胞活力测定。将10μlwst-1试剂(roche#0501594401)加入96孔板的每个孔中。将板在37℃、5％co2培养箱中孵育，直到培养基的浅红色变为深红色。每个孔的培养基体积为100μl。使用fluostaromegaelisa酶标仪(bmglabtech)在420～480nm的波长下测量样品相对于作为空白的背景对照的吸光度。实施例7.体内细胞靶向。一个体被确定为患有癌症。该癌症可以局限于肿瘤。对该肿瘤进行测序，并将大量突变确定为与至少一些肿瘤细胞相对应。进而，鉴定出存在于大多数肿瘤细胞中的突变，并用其指定靶序列。然后合成指导rna以鉴定靶序列，并装配成核糖核蛋白复合物。然后将该复合物施用于患者，并观察症状改善和肿瘤大小的缩小。实施例8.后续治疗。实施例7的个体可继续表现出一些症状，包括持续的肿瘤生长。在这样的情况下，可以对治疗后的缩小的肿瘤进行重新测序。观察到靶序列不再存在，但是可以鉴定出另外的突变。这样，鉴定出存在于大多数肿瘤细胞中的突变，并用其指定靶序列。然后合成指导rna以鉴定靶序列，并装配成核糖核蛋白复合物。然后将该复合物施用于患者，并观察症状改善和肿瘤大小的缩小。实施例9.后续治疗。作为另一个实例，患者患有白血病。向该患者施用甲磺酸伊马替尼(gleevec)治疗。观察到一定的症状改善，但是疾病仍然继续进展，且患者遭受该治疗的某些副作用。在这样的情况下，对癌细胞进行测序。可以观察到发生了基因组重排，导致bcr-abl融合蛋白的编码能力。然后将指导rna设计为靶向bcr-abl接合。即，合成指导rna以鉴定靶序列，并装配成核糖核蛋白复合物。然后将装配好的复合物施用于患者，并观察到症状改善和白血病缓解。实施例10.指导核酸设计。该实施例描述了用于设计指导核酸以供靶向与诸如癌症等病症相关的核酸的说明性方法。用于该实施例的数据来源包括：1.人类参考基因组序列(例如，hg19，grch37)2.来自癌细胞系百科全书(cancercelllineencyclopedia，ccle)的癌细胞系突变信息3.msk-impacttm(memorialsloanketteringcancercenter-可操作的癌症靶标的综合突变概况分析)中列出的410个癌症突变输入值包括ccle突变信息、靶基因id、靶基因序列、grna柄序列、crrna长度(n)、pam(前间隔区相邻基序)序列和pam位置(上游或下游)。指导核酸设计-在人类参考基因组序列中搜索ccle(癌细胞系百科全书)模型细胞系中的突变位置。确定了突变位置上游和下游约30个碱基对的核酸区域的序列信息。在靶向区域中搜索pam序列。确定了pam序列和crrna序列的位置。crrna序列包括该突变位置。计算crrna的pam序列与突变位置之间的距离。通过组合crrna序列和指导rna柄序列设计指导rna序列。由这种方法获得的与设计的指导rna相关的输出信息包括以下：1.基因id：ncbigenbank标识符2.基因符号：hugo欧洲生物信息学研究所(embl-ebi)的基因命名法3.人类基因组装配版本(grch)：来自genomereferenceconsortiumhumanbuild的人类基因组装配版本4.染色体编号：靶基因所在的染色体对的编号5.突变起始位置：人类参考基因组中突变的起始位置6.突变终止位置：人类参考基因组中突变的终止位置7.变异类别：变异的类别8.突变类型：突变的类型，例如，插入或缺失或单核苷酸多态性(snp)或二核苷酸多态性(dnp)9.参考序列：靶基因座10中人类参考基因组的序列10.突变序列：靶基因座中癌细胞系基因组的序列11.氨基酸改变：由于核苷酸突变导致的氨基酸变化12.癌细胞系名称：具有突变的癌细胞系的名称13.肿瘤的起源组织：癌细胞系起源或首先从中分离出的组织14.ensembl转录物id(enstid)：来自ensembl基因组数据库的靶基因转录物标识符15.ccrrna序列：从癌细胞系的靶突变基因座提取的crrna序列。输入的crrna中包括pam序列，并且序列的长度根据输入的crrna长度而不同16.突变与pam之间的距离：crrna中从突变到pam的距离。如果pam在crrna的上游，则pam的最后一个位置将为位置0，pam的突变将为负数位置，而目标切割位点的突变将为正数位置。对于cas9，pam位于crrna的下游。因此，pam的第一个位置为位置0，pam的突变为负数位置，而目标切割位点的突变为正数位置。17.突变的长度：参考序列与突变序列之间的长度差18.参考靶序列：相对于靶基因座的参考序列±10个核苷酸的序列19.突变靶序列：相对于靶基因座的癌细胞系突变序列±10个核苷酸的序列20.指导rna序列(表5a和6)：具有柄和t7rna聚合酶启动子序列的grna序列指导rna序列(表5b和7)：具有柄、tracrrna和t7rna聚合酶启动子序列的grna序列以下表5a显示了使用该实施例获得的用于与cas12a核酸酶一起使用的说明性输出信息。带下划线的文本显示了相对于参考序列(例如，野生型、健康或非癌性)的变异。表5a以下表5b显示了使用该实施例获得的用于与cas9核酸酶一起使用的说明性输出信息。带下划线的文本显示了相对于参考序列(例如，野生型、健康或非癌性)的变异。表5b–输出实例(spcas9)实施例11.用于靶向癌症的指导核酸。大量指导rna序列与本文的公开内容一致。表6和第[00303]段列出了使用实施例10中描述的方法确定的示例性指导rna序列，其可用于将包含cas12a核酸酶结构域的多肽(例如，包含cas12a核酸酶的嵌合多肽)引导至与癌症如肺癌或胰腺癌相关的靶核酸。带下划线的文本显示了相对于参考序列(例如，野生型、健康或非癌性)的变异。表6.用于包含cas12的多肽的示例性指导rna序列crisprgrnaid:gf-ccelg12-1:[crrna序列]:crrna序列:tttcctcactggcttcagcgattccaca:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatctcactggcttcagcgattccaca:[靶基因信息]:基因id:29123:符号:ankrd11:ensembl转录物id:enst00000301030.4:grch:37:染色体:16:[目标癌症突变信息]:突变起点:89351168:突变终点:89351168:突变类别:沉默:突变类型:snp:参考序列:c:突变序列:t:突变氨基酸:p.k594k:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):gctcctgcctcttcctcactg:突变靶标(-10+10):gctcctgccttttcctcactg:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1573:癌症类型:肺:pam距离:-3:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-2:[crrna序列]:crrna序列:ttttcctcactggcttcagcgattccac:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatcctcactggcttcagcgattccac:[靶基因信息]:基因id:29123:符号:ankrd11:ensembl转录物id:enst00000301030.4:grch:37:染色体:16:[目标癌症突变信息]:突变起点:89351168:突变终点:89351168:突变类别:沉默:突变类型:snp:参考序列:c:突变序列:t:突变氨基酸:p.k594k:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):gctcctgcctcttcctcactg:突变靶标(-10+10):gctcctgccttttcctcactg:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1573:癌症类型:肺:pam距离:-2:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-3:[crrna序列]:crrna序列:tttcttcaggaacgaaatctccctccaa:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatttcaggaacgaaatctccctccaa:[靶基因信息]:基因id:324:符号:apc:ensembl转录物id:enst00000457016.1:grch:37:染色体:5:[目标癌症突变信息]:突变起点:112175363:突变终点:112175363:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:g:突变序列:a:突变氨基酸:p.a1358t:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):ttcttcaggagcgaaatctcc:突变靶标(-10+10):ttcttcaggaacgaaatctcc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1650:癌症类型:肺:pam距离:8:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-4:[crrna序列]:crrna序列:ttttcttcaggaacgaaatctccctcca:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatcttcaggaacgaaatctccctcca:[靶基因信息]:基因id:324:符号:apc:ensembl转录物id:enst00000457016.1:grch:37:染色体:5:[目标癌症突变信息]:突变起点:112175363:突变终点:112175363:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:g:突变序列:a:突变氨基酸:p.a1358t:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):ttcttcaggagcgaaatctcc:突变靶标(-10+10):ttcttcaggaacgaaatctcc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1650:癌症类型:肺:pam距离:9:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-5:[crrna序列]:crrna序列:tttcgttcctgaagaaaattcaacagct:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatgttcctgaagaaaattcaacagct:[靶基因信息]:基因id:324:符号:apc:ensembl转录物id:enst00000457016.1:grch:37:染色体:5:[目标癌症突变信息]:突变起点:112175363:突变终点:112175363:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:g:突变序列:a:突变氨基酸:p.a1358t:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):ttcttcaggagcgaaatctcc:突变靶标(-10+10):ttcttcaggaacgaaatctcc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1650:癌症类型:肺:pam距离:2:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-6:[crrna序列]:crrna序列:tttggagggagatttcgttcctgaagaa:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatgagggagatttcgttcctgaagaa:[靶基因信息]:基因id:324:符号:apc:ensembl转录物id:enst00000457016.1:grch:37:染色体:5:[目标癌症突变信息]:突变起点:112175363:突变终点:112175363:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:g:突变序列:a:突变氨基酸:p.a1358t:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):ttcttcaggagcgaaatctcc:突变靶标(-10+10):ttcttcaggaacgaaatctcc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1650:癌症类型:肺:pam距离:14:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-7:[crrna序列]:crrna序列:ttttggagggagatttcgttcctgaaga:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatggagggagatttcgttcctgaaga:[靶基因信息]:基因id:324:符号:apc:ensembl转录物id:enst00000457016.1:grch:37:染色体:5:[目标癌症突变信息]:突变起点:112175363:突变终点:112175363:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:g:突变序列:a:突变氨基酸:p.a1358t:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):ttcttcaggagcgaaatctcc:突变靶标(-10+10):ttcttcaggaacgaaatctcc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1650:癌症类型:肺:pam距离:15:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-8:[crrna序列]:crrna序列:tttcagggaaaggatgcaatctgaatca:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatagggaaaggatgcaatctgaatca:[靶基因信息]:基因id:324:符号:apc:ensembl转录物id:enst00000457016.1:grch:37:染色体:5:[目标癌症突变信息]:突变起点:112177692:突变终点:112177692:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:c:突变序列:g:突变氨基酸:p.s2134c:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):gattcagattccatcctttcc:突变靶标(-10+10):gattcagattgcatcctttcc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1975:癌症类型:肺:pam距离:13:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-9:[crrna序列]:crrna序列:tttgagacacctgggtccattattgtca:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatagacacctgggtccattattgtca:[靶基因信息]:基因id:171023:符号:asxl1:ensembl转录物id:enst00000375687.4:grch:37:染色体:20:[目标癌症突变信息]:突变起点:31019180:突变终点:31019180:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:c:突变序列:a:突变氨基酸:p.l259i:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):tgggtccattcttgtcaacac:突变靶标(-10+10):tgggtccattattgtcaacac:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1573:癌症类型:肺:pam距离:18:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-10:[crrna序列]:crrna序列:ttttgagacacctgggtccattattgtc:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatgagacacctgggtccattattgtc:[靶基因信息]:基因id:171023:符号:asxl1:ensembl转录物id:enst00000375687.4:grch:37:染色体:20:[目标癌症突变信息]:突变起点:31019180:突变终点:31019180:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:c:突变序列:a:突变氨基酸:p.l259i:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):tgggtccattcttgtcaacac:突变靶标(-10+10):tgggtccattattgtcaacac:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1573:癌症类型:肺:pam距离:19:插入缺失长度:0:crisprgrnaid:gf-ccelg12-11:[crrna序列]:crrna序列:tttgggtaggagactgtttgattcctgg:lbgrna:aattctaatacgactcactataggtaatttctactaagtgtagatggtaggagactgtttgattcctgg:[靶基因信息]:基因id:171023:符号:asxl1:ensembl转录物id:enst00000375687.4:grch:37:染色体:20:[目标癌症突变信息]:突变起点:31021717:突变终点:31021718:突变类别:错义突变: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t00000268489.5:grch:37:染色体:16:[目标癌症突变信息]:突变起点:72822106:突变终点:72822106:突变类别:错义突变:突变类型:snp:参考序列:g:突变序列:c:突变氨基酸:p.p3357a:突变信息来源:ccle:参考靶标(-10+10):agggagcctggggacagcccc:突变靶标(-10+10):agggagcctgcggacagcccc:[模型细胞系信息]:细胞:ncih1650:癌症类型:肺:pam距离:2:插入缺失长度:0::实施例12.针对肺癌的体内细胞靶向。一个体被确定为患有肺癌。确定与个体的肺癌细胞相关的序列信息，并鉴定与该肺癌相对应的突变。然后合成包含来自表6和第[00303]段的序列的指导rna，并与包含cas12a核酸酶结构域的多肽装配成核糖核蛋白复合物。备选地或组合地，合成包含来自表7和第[00305]段的序列的指导rna，并与包含cas9核酸酶结构域的多肽装配成核糖核蛋白复合物。然后将包含cas12a、cas9或两者的复合物施用于该个体，并观察症状改善和肿瘤大小的缩小。实施例12.针对胰腺癌的体内细胞靶向。一个体被确定为患有胰腺癌。确定与个体的癌细胞相关的序列信息，并鉴定与该癌症相对应的突变。然后合成包含来自表6和第[00303]段的序列的指导rna，并与包含cas12a核酸酶结构域的多肽装配成核糖核蛋白复合物。备选地或组合地，合成包含来自表7和第[00305]段的序列的指导rna，并与包含cas9核酸酶结构域的多肽装配成核糖核蛋白复合物。然后将包含cas12a、cas9或两者的复合物施用于该个体，并观察症状改善和肿瘤大小的缩小。实施例13.小分子联合疗法。另外，向本文任意实施例的个体施用dna双链断裂修复的小分子抑制剂，以增强基因组编辑效率。该抑制剂可以靶向参与双链断裂修复的基因，例如与brca途径或brca基因相关的基因。在施用后，在个体中观察症状改善和疾病缓解。实施例14.大分子联合疗法。另外，向本文任意实施例的个体施用dna双链断裂修复的大分子抑制剂，以增强基因组编辑效率。将指导rna设计为靶向参与双链断裂修复的基因，例如与brca途径或brca基因相关的基因。向该个体施用指导rna以及cas核酸酶如cas9或cas12a。施用联合疗法后，在个体中观察症状改善和肺癌缓解。实施例15.用px459质粒dna治疗腺癌。使用具有突变体特异性指导rna的cas9表达载体(px459，addgene质粒#62988)在egfr突变肺癌基因组中诱导多重切割。对肺腺癌细胞系hcc827进行电穿孔，以递送cas9/sgrna表达载体。hcc827在其egfr基因中具有e2突变，并且在特定基因组中有超过18个拷贝的突变序列。设计指导rna，使其靶向hcc827细胞系中的超过18个基因座。细胞使用rpmi-1640(10％胎牛血清)在75t培养瓶中生长，直至充满约50％的区域，用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤，然后重悬于neonelectroporationbufferr中。将具有500ngcas9/sgrna表达的150,000个细胞加载到10μlneonpipette吸头中，并在优化条件下(1300v，20ms，2个脉冲)进行电穿孔。在生长培养基中回收细胞六天并计数。图6显示了在靶向cnv的px459质粒dna的氖电穿孔后六天，在egfr突变肺癌细胞系hcc827中，cas9指导rna导致多重切割诱导和细胞死亡。与不使用任何载体或使用靶向野生型egfr序列的载体进行电穿孔的对照组相比，用靶向hcc827特异性突变的载体进行电穿孔的实验组的细胞数显著更低。结果还表明，实验组(egfr_e2)显示出83％的细胞死亡。结果表明，cas9和靶标特异性指导rna在腺癌中的多重切割诱导降低了细胞增殖。实施例16.没有药物处理的h1299转染。将h1299细胞以每孔1.5x105个细胞接种在24孔板中，并且如以下表8所述，将500ng质粒引入每个孔中。表8nt1ccr5hprt1mt2smim11gnpda2slc15a5kcne2切割数022>100>40>12>12>40本质n/a非必需管家非必需非必需癌基因癌基因非必需细胞接种后24小时，使用lipofectamine3000试剂，按照制造商提供的方案进行转染。转染后72小时，通过抽吸弃去所有上清液，并用500μl1xpbs轻轻洗涤细胞。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用台盼蓝染料和细胞计数仪对活细胞数进行计数。ccr5、hprt1(仅在整个基因组中进行两次切割的靶标)和nt1(在人类基因组中没有匹配的序列)显示出相似的细胞活力。相比之下，已知在超过100个基因座进行多次切割的mt2相对于nt1显示出约50％的细胞活力。h1299细胞系特异性扩增的基因座smim11、gnpda2、slc15a5和kcne2显示出与mt2相似的细胞活力，而smim11和kcne2显示出更高的细胞死亡诱导，相对于nt1具有约25％的细胞活力。实施例17.没有药物处理的h1299转染-2。将h1299细胞以每孔1.5x105个细胞接种在24孔板中，并且如以下表9所述，将500ng质粒引入每个孔中。表9细胞接种后24小时，使用lipofectamine3000试剂，按照制造商提供的方案进行转染。转染后48小时，通过抽吸弃去所有上清液，并用500μl1xpbs轻轻洗涤细胞。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用台盼蓝染料和细胞计数仪对活细胞数进行计数。ccr5(在整个基因组中进行两次切割的靶标)相对于仅脂质转染对照显示出80％的细胞活力。hprt1(在管家基因中进行两次切割)显示出更高的毒性，有约50％细胞存在。nt1(在人类基因组中没有匹配的序列)与仅脂质转染相比显示出57％的细胞活力。然而，在超过100个基因座具有多个切割位点的mt2相对于仅脂质转染对照显示出约14％的细胞活力。h1299细胞系特异性扩增的基因座靶标gnpda2、slc15a5、kcne2显示出没有可靠地计数的总细胞死亡，而与仅脂质转染相比显示出57％的细胞活力。还通过使用nucblue活细胞染色试剂(蓝色，对活细胞和死细胞染色)和碘化丙啶死细胞染色试剂(红色，仅对死细胞染色)对两个样品(nt1，gnpda2)进行了成像，其在图10中显示出一致的结果。实施例18–h1563转染。将h1563细胞以每孔1.5x105个细胞接种在24孔板中，并且如以下表10所述，将500ng质粒引入每个孔中。表10ccr5hprt1mt2irx1adamts16切割数22>100>8>7本质非必需管家非必需非必需非必需细胞接种后24小时，使用lipofectamine3000试剂，按照制造商提供的方案进行转染。转染后24小时，通过抽吸弃去所有上清液，并用500μl1xpbs轻轻洗涤细胞。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用台盼蓝染料和细胞计数仪对活细胞数进行计数。ccr5(在整个基因组中进行两次切割的靶标)显示出最高的细胞活力，而hprt1显示为其50％。进行多次切割的靶标(mt2、irx1和adamts16)显示出彼此相似的细胞活力。相对于ccr5，mt2显示出43％的细胞活力，而h1563系特异性扩增的靶标显示出高得多的毒性。与ccr5相比，adamts16导致40％的细胞活力，而irx1导致37％的细胞存活。实施例19：多靶点2引起的a549细胞的细胞死亡。图12-图13显示了多靶点2引起的a549细胞的细胞死亡。通过电穿孔将500ngcas9蛋白和表达grna的dna引入a549(胰腺)细胞中。培养的a549细胞用1xpbs洗涤，并用胰蛋白酶-edta从板底上取下。取出所需数目的细胞，并用1xpbs洗涤一次。对于每种条件，将细胞用lonzasf缓冲液以每种条件各20μl重悬，并与每种dna混合。将细胞和dna混合物转移到lonza电穿孔仪中并进行电休克。作为对照，添加了在人类基因组中未对齐的nt1(非靶标)、作为管家基因的hprt1和具有1个拷贝的ccr5，以及仅电休克条件。通过电休克导入dna后，将细胞一式两份接种到24孔中，一式三份接种到96孔中。dna导入24、42和72小时后，将50μlcelltiterglo试剂(promega，g9241)添加到96孔板中。将板放置在fluostaromega读取器上并摇动2分钟，并使其在室温下反应10分钟。之后，测量发光度。该方法基于细胞中atp的量，并且正在经历代谢的活细胞的量由吸光度确定。与三种对照条件相比，针对人类基因组中超过100个位点的mt2(多靶点2)条件，随时间诱导了20％至50％的细胞死亡。另外，cd68、dach2和herc2p2的三个cnv靶标诱导的细胞死亡与mt2相似，与对照条件相比，shbg2cnv靶标诱导70％至80％的细胞死亡。dna导入24小时后，向24孔中加入1μg/ml的嘌呤霉素，并在几乎细胞死亡时通过更换细胞培养基来回收细胞。回收5-7天后，从每个孔中取出细胞，并用台盼蓝染色以确定活细胞数。引入dna后，用嘌呤霉素选择细胞，然后在测量细胞数之前在显微镜下观察。与细胞计数的结果相似，在hprt1、ccr5靶向治疗中，回收了超过50％的细胞，而在mt2靶向治疗中观察到90％的细胞死亡，仅回收了10％的细胞。因此，证实了当在a549细胞中使用cas9蛋白诱导cnv靶dna断裂时诱导了细胞死亡。实施例20：电穿孔_lonza：a549(celltiterglo)，cnv靶标引起的a549细胞的细胞死亡。通过电穿孔用500ngcas9蛋白和编码每个cnv靶grna的dna转染a549(胰腺)细胞。培养的a549细胞用1xpbs洗涤，并用胰蛋白酶-edta从板底上取下。取出所需数目的细胞，用1xpbs洗涤一次。以每种条件20μl，将细胞用lonzasf缓冲液重悬，并与每种dna混合。将细胞和dna混合物转移到lonza电穿孔仪中并进行电休克。作为对照，添加了能够在大肠杆菌中表达蛋白质的pet21a载体的条件，仅电休克条件以及无处理。通过电休克导入dna后，将细胞每种条件一式三份添加到96孔中。dna导入24、44和51小时后，将50μlcelltiterglo试剂添加到每个孔中。将板放置在fluostaromega读取器上并摇动2分钟。在室温下反应10分钟后，测量发光。该方法涉及基于细胞中的atp量的代谢，是通过吸光度确定活细胞程度的方法。结果，与三种对照条件相比，在靶向人类基因组中超过100个位点的mt2(多靶点2)条件下，随时间诱导20％至50％的细胞死亡。另外，cd68、dach2和herc2p2的三个cnv靶标观察到的细胞死亡程度与mt2条件相似，与对照条件相比，shbgcnv靶标诱导70-80％的细胞死亡。因此，证实了当在a549细胞中使用cas9蛋白诱导cnv靶dna断裂时诱导了细胞死亡。实施例21：cnv靶标引起的skbr3细胞的细胞死亡。通过电穿孔用500ngcas9蛋白和表达每种cnv靶grna的dna处理乳腺癌细胞系skbr3。培养的skbr3细胞用1xpbs洗涤，然后用胰蛋白酶-edta处理，并从板底取下。取出所需数目的细胞，用1xpbs洗涤一次。以每种条件20μl，将细胞用lonzasf缓冲液重悬，并与每种dna混合。将细胞和dna混合物置于lonza电穿孔仪中并进行电休克。添加了在人类基因组中未对齐的nt1(非靶标)、仅电休克条件以及无处理条件作为对照条件。通过电休克导入dna后，将细胞每种条件一式三份加入96孔中。dna导入24、42和48小时后，将50μlcelltiterglo试剂添加到96孔中。将板放置在fluostaromega读取器上并摇动2分钟。在室温下反应10分钟后，测量发光。该方法基于细胞中的atp量，并通过吸光度确定经历代谢的活细胞的量。结果，与三种对照条件相比，在靶向人类基因组中超过100个位点的mt2条件下诱导了30％的细胞死亡。另外，与对照条件相比，两个cnv靶标erbb2和krt1,6诱导了40-50％的细胞死亡。通过电休克导入dna后，将细胞一式两份放入24孔中。引入dna后48小时，从24个孔的每个孔中移出细胞，并用台盼蓝染色以测量活细胞数。结果，与对照条件相比，在mt2条件下诱导了40％的细胞死亡，并且与对照条件相比，两种类型的erbb2和krt16cnv靶标诱导了40-50％的细胞死亡。因此，证实了通过使用cas9蛋白在skbr3细胞的两个cnv中诱导靶dna断裂而诱导了细胞死亡。实施例22：靶向helacnv或hpv基因以用于治疗宫颈癌。图18a中显示了来自adey,a.等人(thehaplotype-resolvedgenomeandepigenomeoftheaneuploidhelacancercellline.nature500,207–211(2013))的hela基因组中的hpv复制基因座图谱。紫色表示hela，绿色表示hpv。18b中显示了hela细胞中的hpv序列区域，由meissner等人(nucleotidesequencesandfurthercharacterizationofhumanpapillomavirusdnapresentinthecaski,sihaandhelacervicalcarcinomacelllines.j.gen.virol.80,1725–1733(1999))、landry等人(thegenomicandtranscriptomiclandscapeofahelacellline.g3:genes|genomes|genetics3,1213–24(2013))、adey和liu等人(comprehensivemappingofthehumanpapillomavirus(hpv)dnaintegrationsitesincervicalcarcinomasbyhpvcapturetechnology.oncotarget7,5852–5864(2016))推断而来。重复数字被标记为x，只有打开的序列被标记为箭头。图18c显示了pcr产物的电泳凝胶，其基于meissner、landry、adey和liu指示hela细胞中hpv序列之间的重复区域。在宫颈癌模型细胞(hela细胞)的2x105个细胞中用600ng表达cas9和grna的dna载体进行电穿孔。为了制备hela细胞，从培养瓶中移出培养基，用1xpbs洗涤细胞，并用胰蛋白酶-edta处理细胞，使hela细胞从培养瓶脱壁。进行细胞计数，将适当数目的细胞转移至新管中，用1xpbs洗涤细胞，并用lonzase缓冲液重悬细胞，并与dna载体混合。将该混合物转移至电穿孔仪器中，并进行电穿孔。使用拷贝数为1的靶向非必需基因ccr5的质粒作为阴性对照，使用靶向100个非必需基因(mt2)的质粒的混合物作为阳性对照。在实验组中，靶向非必需基因prdm9的质粒在hela细胞中重复8次，而人乳头瘤病毒(hpv)基因则在hela细胞中重复30次。通过电穿孔引入dna后24小时，除去培养基，并用0.5ug/ml嘌呤霉素代替以选择转染的hela细胞。嘌呤霉素选择后3天，将培养基替换为标准培养基，将细胞培养3-4天，并进行细胞计数。图19显示了每个组的细胞活力的图。数据表明，与阴性对照ccr5相比，靶向mt2诱导的细胞死亡可达50％。另外，靶向prdm9和hpv_1序列诱导的细胞死亡与靶向mt2相似或更多。因此，cas9切割了hela细胞特异性cnv和hpv基因，并诱导了细胞死亡。使用上述相同的方法生成图20。电穿孔后24、48和72小时，使用测量了经历代谢的活细胞数，celltiterglo2.0通过测量发光吸光度来量化atp。使用gfp表达载体(gfp)，并使用拷贝数为1的非必需基因ccr5作为阴性对照。使用靶向100个非必需基因(mt2)的质粒的混合物作为阳性对照。在实验组中，质粒靶向非必需基因prdm9(重复8次)，和人乳头瘤病毒(hpv)基因，在hela细胞中重复30次。图20a显示了在每个时间点每个处理组的发光信号或atp水平的图。数据表明，在hela细胞中，仅脉冲(gfp)和ccr5之间存在相似的发光信号。与阴性对照ccr5相比，靶向mt2诱导的细胞死亡可达50％。另外，靶向prdm9和hpv_1序列诱导的细胞死亡与mt2条件相似或更多。靶向hpv基因后的hela细胞死亡通过细胞滴度glo测定来评估，如下所述。使用与上述相同的方法生成图20b。使用质粒靶向非必需基因ccr5，其拷贝数为1，作为阴性对照，并且使用靶向100个非必需基因(mt2)的质粒的混合物作为阳性对照。添加了非靶标阴性对照(nt1)，其靶向非人类序列。nt1对照具有20mer间隔区，而nt2/nt3具有10mer，各5mer间隔区。作为实验组，使用靶向人乳头瘤病毒(hpv)基因的质粒，该质粒在hela细胞中重复30次。通过电穿孔引入dna后24小时，除去培养基，并用0.5ug/ml嘌呤霉素代替以选择转染的hela细胞。嘌呤霉素选择后3天，将培养基替换为标准培养基，培养10天。通过细胞滴度glo计算经历代谢的活细胞的相对量。实验结果表明，在hela细胞中，ccr5显示的发光信号比间隔区序列为5mer的nt3高75％。同样，靶向mt2诱导的细胞死亡比nt3高可达99.5％。另外，靶向hpv_1序列诱导的细胞死亡比ccr5条件高可达约90％。因此，当用cas9切割hela细胞特异性hpv基因时，如通过细胞滴度glo所检测到的，诱导了细胞死亡。实施例23：靶向结肠癌相关基因的ht29转染。将ht29细胞以1.5x105个细胞/孔接种在24孔板中，并如表11所述，将500ng质粒导入每个孔中。表11使用lipofectamine3000试剂，按照制造商的方案，在细胞接种后24小时进行转染。转染后24小时，用1μg/ml嘌呤霉素处理细胞，并在90小时选择细胞。由于转染效率低，几乎观察到总细胞死亡，并且在12天时通过正常的完全mccoy培养基回收了一些存活的细胞。通过抽吸弃去所有上清液，并用500μl1xpbs轻轻洗涤细胞。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用台盼蓝染料和细胞计数仪对活细胞数进行计数。图21显示了每个处理组的活细胞计数。在全基因组中仅进行两次切割的靶标ccr5，和在人类基因组中没有匹配的序列的nt1，显示出相似的高水平的细胞活力。相比之下，与nt1相比，在管家基因上进行两次切割的hprt1显示出约50％的细胞活力。多重切割靶标显示出大量细胞死亡，尤其是mt2、trappc9和cdk8，它们显示出很少或没有回收的细胞。与nt1相比，link00536和trps1分别显示出18％和20％的细胞活力。实施例24：靶标交叉检查(1563个靶标中的1299个)。与图13中所示的h1563转染一起进行图22。将h1563细胞以每孔1.5x105个细胞接种在24孔板中，并且如以下表12所述，将500ng质粒引入每个孔中。表12ccr5smim11gnpda2slc15a5kcne2切割数22222本质非必需非必需癌基因癌基因非必需使用lipofectamine3000试剂，按照制造商的方案在细胞接种后24小时进行转染。转染后24小时，将细胞用1μg/ml嘌呤霉素处理并在72小时选择。通过抽吸弃去所有上清液，并用500μl1xpbs轻轻洗涤细胞。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并用台盼蓝染料和细胞计数仪对活细胞数进行计数。图22显示了每个处理组的活细胞的图。h1299系特异性cnv靶标smim11、gnpda2、slc15a5、kcne2在h1563中进行了测试，它们仅在全基因组进行两次切割。正如预期，与ccr5相比，smim11、gnpda2、slc15a5没有显示有害作用。kcne2显示出细胞死亡作用。在显微镜图像中也确认了该现象(图23)。实施例25：在h1299细胞中的脂质转染。通过膜联蛋白v阳性测定进行的死细胞确定。转染前一天，将肺癌细胞系h1299细胞以1.3×104接种在白色96孔板中。第二天，使用脂质体引入500ngcas9蛋白和编码每种cnv靶grna的dna。将0.3μl脂质体试剂i与5μlopti-mem混合以制成管1。对于每种实验条件，将0.2μl脂质体试剂ii与5μlopti-mem和500ngdna混合以制成管2。将管2与管1混合，并在室温下孵育15分钟。将11μl脂质体和dna混合物添加到96孔中。3小时后，添加annv试剂，并且在脂质转染后24小时测量发光。当在发生凋亡时，将annv添加到暴露于细胞外膜的ps(磷脂酰丝氨酸)位点时，该方法根据发光程度测量凋亡程度。结果，当通过使用cas9蛋白在h1299细胞的四个cnv中诱导靶dna断裂时，观察到30％至40％的细胞死亡率。细胞膜暴露于ps以诱导凋亡。图24显示了每个处理组的发光图，表明细胞死亡。实施例26：cas9指导rna在egfr突变肺癌细胞系hcc827中导致多重切割诱导和细胞死亡，并且增强密码子优化的人recj蛋白的细胞杀伤作用。使用具有突变体特异性指导rna的cas9表达载体(px459，addgene质粒#62988)在egfr突变肺癌基因组中诱导多重切割。克隆了表达cas9-recj蛋白的载体，其中cas9序列的侧翼为在3’端的密码子优化的人recj序列。肺腺癌细胞系hcc827进行电穿孔，以递送cas9/sgrna表达载体。hcc827细胞在其egfr基因中具有e2突变，并且在特定基因组中存在超过18个拷贝的突变序列。设计指导rna，使其靶向hcc827细胞系中的超过18个基因座。细胞使用rpmi-1640(10％胎牛血清)在75t培养瓶中生长，直至充满约50％的区域，用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤，最后重悬于氖电穿孔缓冲液r中。将具有500ngcas9/sgrna表达的150,000个细胞加载到10μlneonpipette吸头中，并以优化的条件(1300v，20ms，2个脉冲)进行电穿孔。在生长培养基中回收细胞4天并计数。图25在底部显示了每个处理组中活细胞的图。与不使用任何载体进行电穿孔、使用靶向野生型egfr序列的载体或使用靶向单个基因座(ccr5)的载体进行电穿孔的对照组相比，使用靶向hcc827特异性突变的载体进行电穿孔的对照组具有显著较少的细胞数。在egfr_e2实验组中观察到33％的细胞死亡。此外，证实了cas9recj蛋白不仅增强了多重切割作用，而且还赋予了对靶向单个基因座的指导rna的细胞杀伤能力。结果表明，cas9和靶标特异性指导rna在腺癌中的多重切割诱导降低了细胞增殖，并且密码子优化的人recj蛋白增强了这种作用。在ccr5组中观察到50％的细胞死亡，而在egfr_e2组中观察到80％的细胞死亡。与对照相比，使用cas9-recj构建体使细胞死亡效率提高了5倍。实施例26：各种递送方法。该实施例说明了用于施用crispr-cas9构建体的各种递送方法。hcc827细胞中的rnp氖电穿孔。图26显示了在egfr突变肺癌细胞系hcc827中cas9指导rna导致多重切割诱导和细胞死亡。使用具有突变体特异性指导rna的cas9/sgrna核糖核蛋白(cas9rnp)在egfr突变肺癌基因组中诱导多重切割。肺腺癌细胞系hcc827进行电穿孔，以递送cas9rnp。hcc827在其egfr基因中具有e2突变，并且在特定基因组中存在超过18个拷贝的突变序列。指导rna被设计为靶向hcc827细胞系中超过18个基因座。细胞使用rpmi-1640(10％胎牛血清)在75t培养瓶中生长，直至充满约50％的区域，用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤，最后重悬于氖电穿孔缓冲液r中。将具有1.2μmrnp的150,000个细胞加载到10μlneonpipette吸头中，并以优化的条件(1300v，20ms，2个脉冲)进行电穿孔。在生长培养基中回收细胞24小时并计数。与不使用任何完整rnp进行电穿孔的对照组相比，用靶向hcc827特异性突变的rnp电穿孔的实验组具有显著更低的细胞数，比非靶向rnp低3倍。结果表明，cas9和靶标特异性指导rna在腺癌中的多重切割诱导降低了细胞增殖。cas9构建体在h1563细胞中的脂质转染。图27显示了在腺癌细胞系h1563中cas9指导rna导致多重切割诱导和细胞死亡。使用具有指导rna的cas9/sgrna核糖核蛋白(cas9rnp)靶向人类基因组中超过100个基因座。肺腺癌细胞系hcc827进行电穿孔，以递送cas9rnp。细胞使用rpmi-1640(10％胎牛血清)在75t培养瓶中生长，直至充满约50％的区域，用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤，最后重悬于氖电穿孔缓冲液r中。将具有1.2μmrnp的150,000个细胞加载到10μlneonpipette吸头中，并以优化的条件(1200v，20ms，2个脉冲)进行电穿孔。然后在生长培养基中回收细胞48小时并计数。与用非靶向rnp进行电穿孔的对照组相比，用靶向多个基因座的rnp进行电穿孔的实验组的细胞数显著降低了30％。结果表明，cas9和靶标特异性指导rna在腺癌中的多重切割诱导降低了细胞增殖。氖电穿孔后2天的h1299rnp(cas9-gfp)。图28显示了在腺癌细胞系h1299中cas9指导rna导致多重切割诱导和细胞死亡。使用具有突变体特异性指导rna的cas9/sgrna核糖核蛋白(cas9rnp)在h1299肺癌基因组中诱导多重切割。搜索在h1299基因组中具有高拷贝数变异(cnv)的基因，并选择gnpda2(>12个拷贝，癌基因)和smim11(>40个拷贝，非必需基因)作为cas9靶标。设计了指导rna(mt2)，其靶向人类基因组中的超过100个基因座，并将其用于实验。肺腺癌细胞系h1299进行电穿孔，以递送cas9rnp。使用gfp标记的cas9蛋白验证转染。细胞使用rpmi-1640(10％胎牛血清)在75t培养瓶中生长，直至充满约50％的区域，用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤，最后重悬于氖电穿孔缓冲液r中。将具有1.2μmrnp的150,000个细胞加载到10μlneonpipette吸头中，并以优化的条件(1300v，20ms，2个脉冲)进行电穿孔。然后在生长培养基中回收细胞48小时并计数。与未用任何完整rnp进行电穿孔的对照组相比，用靶向h1299基因组中多个基因座的rnp进行电穿孔的实验组具有显著更低的细胞数。在gnpda2实验组中观察到71％的细胞死亡，在smim11实验组中观察到40％的细胞死亡，而在mt2实验组中观察到33％的细胞死亡。结果表明，cas9和靶标特异性指导rna在腺癌中的多重切割诱导降低了细胞增殖。实施例27：通过靶向cnv引起的ht-29细胞的细胞死亡。测定通过靶向cnv和mt2在ht-29(结肠癌细胞系)中的特异性杀伤。通过电穿孔向ht-29细胞中引入500ngcas9蛋白和表达每种cnv靶grna的dna。培养的ht-29细胞用1xpbs洗涤，然后用胰蛋白酶-edta处理，并从板底取下。取出所需数目的细胞，并用1xpbs洗涤一次。以每种条件20μl，将细胞用lonzasf缓冲液重悬，并与每种dna混合。将细胞和dna混合物置于lonza电穿孔仪中并进行电休克。添加了在人类基因组中未对齐的nt1(非靶标)和仅电休克条件作为对照条件。通过电休克导入dna后，将细胞每种条件一式四份加入96孔中。dna导入24小时后，将50μlcelltiterglo试剂添加到96孔中。将板放置在fluostaromega读取器上并摇动2分钟。在室温下反应10分钟后，测量发光。该方法基于细胞中的atp量，并通过吸光度确定经历代谢的活细胞的量。结果，与nt1条件相比，在靶向人类基因组中超过100个位点的trappc9和mt2条件下诱导了90％的细胞死亡。另外，如图29所示，三种cnv靶标cdk8、linc00536和trps1诱导了20-45％的细胞死亡。实施例28：cas12a和单靶点或多靶点crrna引起的序列特异性癌细胞杀伤作用。cas12a表达载体与靶向高cnv突变序列(egfre2)或非cnvwt序列(ccr5)的crrna一起使用。crrna被设计为分别在hcc827基因组中诱导超过18个切割或双切割。肺腺癌细胞系hcc827进行电穿孔，以递送cas12a/crrna表达载体。hcc827在其egfr基因中具有e2突变，并且在特定基因组中存在超过18个拷贝的突变序列。使用的cas12adna序列为atgggcaaaaaccaaaatttccaagaatttatcggagtgagccccctgcagaaaaccctccggaacgagcttattccgactgagaccacaaagaaaaatataacccagctggacttgctgactgaagatgagatccgcgcccagaaccgggaaaagctcaaagagatgatggacgattattaccgcaatgttattgacagtacccttcacgtcgggatcgctgtggattggtcttatctgttcagctgcatgcggaaccatttgcgcgaaaattccaaggagtcaaaacgggaactggagcgcacacaggacagcattcggagtcagatacacaacaagtttgccgaacgcgcagatttcaaagacatgtttggcgcctctatcattaccaagctccttcctacttacatcaaacaaaatagcgagtattccgaacggtacgatgagtcaatggaaattctgaagttgtatggtaaattcaccacaagcctgaccgactactttgagactcgcaagaacatattcagtaaagaaaagatctctagcgctgtaggctatcggattgtggaggaaaatgccgagatctttctccagaaccagaatgcatacgatcgcatttgtaaaatagccggacttgacctgcatgggttggataacgaaatcaccgcttatgttgacggcaagacactgaaagaggtctgctccgatgaaggtttcgccaaggcaattacccaagagggcatcgatcggtacaatgaagccattggagctgtgaaccagtatatgaatctcctttgtcagaaaaacaaggccctgaaacccgggcaatttaagatgaaacgcttgcacaagcagatactgtgcaaaggcactacctcattcgatatcccgaagaaatttgagaatgacaagcaggtatacgatgcagtgaacagcttcacagaaattgttaccaaaaataacgacctcaagcggcttctgaatatcactcaaaacgccaatgattatgacatgaacaaaatttacgtcgtggctgatgcctatagtatgatatctcagtttatcagcaagaaatggaatttgattgaggaatgtctgctcgactactattccgataaccttccaggtaagggcaatgcaaaagagaacaaggtaaaaaaggccgtgaaagaagagacctaccgctcagttagccagctgaatgaagtcatcgagaagtattacgtggaaaaaacaggacaaagtgtatggaaggtggagtcttatattagctccttggctgaaatgataaaactggagctctgccatgaaatcgacaacgatgagaagcacaatcttattgaggacgatgagaaaatctcagaaattaaggagctgttggacatgtacatggatgttttccatataatcaaagtctttcgggtgaacgaagtactgaatttcgacgagaccttttatagcgaaatggatgagatttaccaggacatgcaggaaatcgtgcccctctataaccacgttcgcaattacgtcactcaaaagccgtataaacaggagaagtaccggctttatttccatacccctacactggccaacgggtggagtaaatctaaggaatacgataataacgcaattatattggtgcgcgaggacaaatattacctgggcatcctcaatgccaagaaaaagcccagcaaagaaattatggctggtaaggaggattgttccgaacacgcctatgcaaaaatgaactactatcttctgccgggcgccaataagatgttgccaaaagtatttctgtcaaagaaaggaatccaggactaccatcccagcagttatattgtggaggggtacaacgaaaagaaacacataaagggctctaaaaatttcgatatccggttttgccgcgacctcattgattatttcaaggagtgtatcaaaaagcatccggactggaacaaatttaatttcgaatttagcgctaccgagacttacgaagatatttccgttttctatcgggaggtcgaaaagcaaggttaccgcgtggagtggacctatataaactcagaggacatccagaaacttgaggaagatggccagctgtttttgttccaaatttacaataaggactttgccgtaggaagcacagggaaacctaacctgcacaccctctatcttaagaatctgttcagtgaggaaaacttgcgggatatcgtgctgaaactcaatggcgaggcagaaatttttttccgcaagtctagcgttcagaaacccgtcatacataagtgcggttccatccttgtgaaccggacttacgagattaccgaatcaggcacaacccgcgtacagagcatcccggagagtgaatatatggagctgtatcggtattttaattctgaaaaacaaattgagttgagcgacgaagccaagaaatacctggataaggtgcagtgtaacaaagctaagactgacatagttaaagattatcgctacaccatggacaagttctttatccacctcccaattacaatcaatttcaaagtcgataagggaaacaatgtgaacgccattgcacagcaatatatagccgggcggaaagaccttcatgtaatcggcattgatcgcggtgagcggaatctgatctacgtgtccgttattgacatgtatggccgcatattggaacagaagtcatttaacctggtcgagcaggtgagcagtcaaggaaccaaacggtactatgattacaaggaaaaactccagaatcgcgaggaagagcgggacaaggctcgccagtcttggaaaactatcgggaagattaaagaacttaaggagggctatctgagctccgtaatccacgaaattgcccaaatggtggttaaatacaacgcaataatcgccatggaggatttgaattatggtttcaagcggggccgctttaaagtcgaacggcaggtgtaccagaagttcgagaccatgctgatttcaaaactcaactatcttgctgacaagagccaagccgtagatgaacccggagggattctgcgcggctaccagatgacatatgtgccggacaatattaaaaacgttggtcggcagtgcggcataatcttttacgtccctgcagcctataccagtaagattgatcccactaccggattcatcaatgcttttaaacgcgacgtggtatctacaaacgatgccaaggagaatttcttgatgaaatttgacagcattcaatacgatatagaaaaggggctgttcaaattttccttcgactataagaactttgcaacccataaactcactcttgccaagaccaaatgggatgtgtacacaaatggcacccggattcagaacatgaaggttgagggtcactggctgtcaatggaagtcgagttgactaccaaaatgaaggaactgctcgacgatagccatattccgtatgaggaaggccagaatatccttgacgatctgcgcgagatgaaagacattacaaccatagtgaacggaatcttggaaattttctggctgactgtacaactccggaatagtcgcatcgataacccagactacgatcggattatatctcccgtgcttaataagaacggggagtttttcgacagcgatgaatataattcctacatcgacgctcagaaagccccgctgcctattgatgcagacgccaacggcgctttttgtatcgccttgaagggtatgtataccgcaaatcagattaaagagaactgggttgaaggcgagaagctgcccgccgattgcctcaaaatagaacacgcttcatggcttgccttcatgcaaggagagcgcggg，且相应的蛋白质序列为mgknqnfqefigvsplqktlrneliptettkknitqldlltedeiraqnreklkemmddyyrnvidstlhvgiavdwsylfscmrnhlrenskeskrelertqdsirsqihnkfaeradfkdmfgasiitkllptyikqnseyserydesmeilklygkfttsltdyfetrknifskekissavgyriveenaeiflqnqnaydrickiagldlhgldneitayvdgktlkevcsdegfakaitqegidryneaigavnqymnllcqknkalkpgqfkmkrlhkqilckgttsfdipkkfendkqvydavnsfteivtknndlkrllnitqnandydmnkiyvvadaysmisqfiskkwnlieeclldyysdnlpgkgnakenkvkkavkeetyrsvsqlneviekyyvektgqsvwkvesyisslaemiklelcheidndekhnlieddekiseikelldmymdvfhiikvfrvnevlnfdetfysemdeiyqdmqeivplynhvrnyvtqkpykqekyrlyfhtptlangwskskeydnnaiilvredkyylgilnakkkpskeimagkedcsehayakmnyyllpgankmlpkvflskkgiqdyhpssyivegynekkhikgsknfdirfcrdlidyfkecikkhpdwnkfnfefsatetyedisvfyrevekqgyrvewtyinsediqkleedgqlflfqiynkdfavgstgkpnlhtlylknlfseenlrdivlklngeaeiffrkssvqkpvihkcgsilvnrtyeitesgttrvqsipeseymelyryfnsekqielsdeakkyldkvqcnkaktdivkdyrytmdkffihlpitinfkvdkgnnvnaiaqqyiagrkdlhvigidrgernliyvsvidmygrileqksfnlveqvssqgtkryydykeklqnreeerdkarqswktigkikelkegylssviheiaqmvvkynaiiamedlnygfkrgrfkverqvyqkfetmlisklnyladksqavdepggilrgyqmtyvpdniknvgrqcgiifyvpaaytskidpttgfinafkrdvvstndakenflmkfdsiqydiekglfkfsfdyknfathkltlaktkwdvytngtriqnmkveghwlsmevelttkmkellddshipyeegqnilddlremkdittivngileifwltvqlrnsridnpdydriispvlnkngeffdsdeynsyidaqkaplpidadangafcialkgmytanqikenwvegeklpadclkiehaswlafmqgerg。egfr_wtcrrna序列为ggagatgttgcttctcttaattcc，ccr5crrna序列为tgcacagggtggaacaagatggat，且egfr_e2crrna序列为ggagatgtcttgatagcgacggga。ascpf1柄为taatttctactcttgtagat。细胞使用rpmi-1640(10％胎牛血清)在75t培养瓶中生长，直至充满约50％的区域，用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤，然后重悬于neonelectroporationbufferr中。将具有500ngcas9/sgrna表达的150,000个细胞加载到10μlneonpipette吸头中，并在优化条件下(1300v，20ms，2个脉冲)进行电穿孔。然后在生长培养基中回收细胞6天，并使用发光测量细胞的量。与hcc827在其基因组中没有相应序列的对照组egfr_wt相比，靶向ccr5的样品显示出76％的死亡率，而靶向egfr_e2的样品显示出83％的死亡率。结果表明，cas12a的使用可以诱导双切割或多重切割导致的癌细胞死亡，并且可以通过定制的crrna设计来控制这种作用。虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。当前第1页12