衍生自副干酪乳杆菌的囊泡及其用途的制作方法

本发明涉及一种衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡及其用途，更具体地，涉及一种用于预防或治疗炎症疾病和癌症的组合物，该组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分，以及诸如此类。

本申请要求分别于2018年12月31日和2019年4月25日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2018-0174027和10-2019-0048671的优先权和权益，并且将所述专利申请的说明书和附图中公开的所有内容并入本申请中。

背景技术：

随着21世纪的开始，过去被认为是传染病的急性传染病的重要性有所下降，而由于慢性疾病，疾病的模式已变为降低生活质量并决定人类生活期望值的主要疾病。慢性疾病的特征是伴有免疫功能异常的慢性炎症，并且诸如由这些疾病引起的各种慢性炎症疾病和癌症之类的疾病已成为国民健康的主要问题。

炎症是一种针对细胞或组织的损伤或感染的局部或全身保护机制，并且通常是由在组成免疫系统的体液性介质直接响应于损伤或感染或者刺激局部或全身效应器系统时发生的一系列生物响应造成的。主要的炎性疾病的例子包含消化道疾病，例如胃炎和炎性肠炎；口腔疾病，例如牙周炎；呼吸道疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(copd)和鼻炎；皮肤病，例如特应性皮炎，脱发症和牛皮癣。诸如退行性关节炎和类风湿性关节炎之类的关节炎；癌症等。

用于治疗或预防慢性炎症疾病的常见组合物主要分为甾体和非甾体组合物，在许多情况下，大多数所述组合物通常伴有各种副作用。因此，有一种趋势，即近来对tnf-α抑制剂的兴趣增加，该tnf-α抑制剂是一种已知是慢性炎症疾病的主要致因的促炎细胞因子。

然而，迄今为止，具有低副作用并且可以通过有效地抑制tnf-α的表达而基本上用于预防和治疗慢性炎症疾病的药物的开发仍然是不足的，并且对于癌症治疗剂也是如此。

技术实现要素：

[技术问题]

为了解决相关技术中的上述问题而设计了本发明，其目的是提供一种减轻、预防或治疗炎症疾病和癌症的组合物，该组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分，以及诸如此类。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。

[技术方案]

本发明提供一种用于预防或治疗炎症疾病或癌症的药物组合物，该药物组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分。

另外，本发明提供一种用于预防或减轻炎症疾病或癌症的食品组合物，该食品组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分。

另外，本发明提供一种用于预防或治疗炎症疾病或癌症的吸入剂组合物，该吸入剂组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分。

另外，本发明提供一种用于预防或减轻炎症疾病的化妆品组合物，该化妆品组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分。

本发明的炎症疾病是由tnf-α或il-1β介导的疾病，并且包含炎性肠炎(急性肠炎、慢性肠炎等)、胃炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、鼻炎、特应性皮炎、脱发症、牛皮癣、退化性关节炎和类风湿性关节炎，但不限于此，只要炎症疾病是由炎性响应引起的疾病即可。

本发明的癌症包含结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌和前列腺癌，但不限于此。

在本发明的一种实施方式中，细胞外囊泡的平均直径优选为10至300nm，但不限于此，只要细胞外囊泡是天然或人工分泌的或分离自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡即可。

在本发明的另一种实施方式中，细胞外囊泡可以从副干酪乳杆菌的培养液，或从通过添加副干酪乳杆菌培养的食品中分离，但不限于此。

另外，本发明提供一种治疗炎症疾病或癌症的方法，该方法包含将包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分的组合物给药(administer)至受试者的步骤。

此外，本发明提供组合物用于预防和/或治疗炎症疾病或癌症的的用途，该组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分。

另外，本发明提供衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡用于生产用于抗炎症疾病和/或癌症的药物的用途。

[有益效果]

由于根据本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可以有效地抑制已知是各种慢性炎症疾病的因子的促炎细胞因子的tnf-α、il-1β等的表达，预期根据本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可广泛用作具有低副作用的用于减轻、预防或治疗各种慢性炎症疾病和癌症的药剂。

附图说明

图1a和1b是示出根据本发明一实施例分析衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的结果的视图。

图2a和2b是示出根据本发明一实施例证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的细胞毒性和炎症诱导作用的结果的视图。

图3是示出根据本发明一实施例证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的抗炎作用的结果的视图。

图4a和图4b是示出根据本发明一实施例通过qrt-pcr证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对lps诱导的炎性响应的抑制作用的结果的视图。

图5a和5b是示出根据本发明一实施例通过蛋白质印迹证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对lps诱导的炎性响应的抑制作用的结果的视图。

图6a至图6e是示出根据本发明的一种实施方式通过组织学分析方法证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎中炎性响应的抑制作用的结果的视图。

图7a至7d是示出根据本发明的一种实施方式通过qrt-pcr证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎中炎性响应的抑制作用的结果的视图。

图8a和8b是示出根据本发明的一种实施方式通过蛋白质印迹证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎中炎性响应的抑制作用的结果的视图。

图9是示出根据本发明一实施例在通过移植癌细胞制备的癌症模型中口腔内给药衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡之后随时间测量癌症大小的结果的视图。

具体实施方式

在本发明中，证实了衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡通过有效抑制与炎性响应相关的各种因子的表达表现出对炎症疾病的显著的治疗作用。因此，预期本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可以以各种方式用于减轻、预防和治疗各种慢性炎症疾病和癌症。

如本文所用，“细胞外囊泡”是指由纳米尺寸的膜形成并从各种细菌分泌的结构，并且在本发明中，“细胞外囊泡”统指由膜形成且从副干酪乳杆菌自然分泌或人工生产的所有结构。可以通过使用选自以下的一种或多种方法从包含副干酪乳杆菌细菌细胞的培养液中分离细胞外囊泡：离心、超高速离心、高压处理、挤压、超声处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械分解、化学处理、通过过滤器过滤、凝胶过滤色谱法、自由流动电泳和毛细管电泳。此外，可以进一步包括诸如洗涤以去除杂质以及浓缩所获得的囊泡之类的过程。

如本文所用，“炎症疾病”是指由体内炎性响应引起的疾病，其代表性例子包含：呼吸道炎症疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病和鼻炎；皮肤炎症疾病，例如特应性皮炎、牛皮癣、痤疮、接触性皮炎和脱发症；消化道炎症疾病，例如胃炎、胃溃疡和炎性肠炎(急性肠炎、克罗恩病、炎性肠病、贝塞氏结肠炎、溃疡性结肠炎、细菌性肠炎等)；阴道炎；关节炎，例如骨关节炎和类风湿关节炎；其并发症；等等。此外，炎性疾病用于意指除了一般的炎性疾病之外还包含与炎性响应有关的代谢性疾病，其例子包含糖尿病、肥胖症、肝炎、肝硬化等。

如本文所用，“预防”是指经由根据本发明的食物、化妆品、吸入剂或药物组合物的给药来抑制炎症疾病和癌症或延迟其发作的所有作用。

如本文所用，“治疗”是指经由根据本发明的食物、化妆品、吸入剂或药物组合物的给药来减轻或有益地改变炎症疾病和癌症的症状的所有作用。

如本文所用，“减轻”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有作用。

如本文所用，“个体”是指需要治疗疾病的受试者，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。

如本文所用，“药物组合物”可以是胶囊、片剂、颗粒、注射剂、软膏、粉末或饮料的形式，并且药物组合物可以靶向人。可以将每种药物组合物配制成以下形式：口服剂型，例如粉末、颗粒、胶囊、片剂或水性悬浮液、外用制剂、栓剂；或无菌注射溶液，但是其制剂不限于此。本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等可以用于口腔内给药，缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等的混合物可以用于注射，并且碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可以用于局部给药。通过将本发明的药物组合物与如上所述的药学上可接受的载体混合，可以不同地制备本发明的药物组合物的制剂。例如，该制剂可以以以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式制备以用于口腔内给药，并且制成单位剂量的安瓿或多种剂型以用于注射。本发明的药物组合物也可以配制成溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂等。

同时，作为用于配制的合适载体、赋形剂和稀释剂的例子，可使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。此外，本发明的药物组合物可以进一步包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。

根据本发明的药物组合物的给药途径包含但不限于口腔内、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下和直肠途径。口腔内或肠胃外给药是优选的。如本文所用，术语“肠胃外”具有包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、硬膜内、病变内和颅内注射或输注技术的含义。本发明的药物组合物也可以以栓剂的形式给药以用于直肠给药。

本发明的药物组合物可以根据各种因素而变化，这些因素包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合和要预防或治疗的特定疾病的严重程度，并且药物组合物的剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物的形式、给药途径和持续时间而变化，但可由本领域技术人员适当地选择，并且可以是每日0.0001至50mg/kg或0.001至50mg/kg。给药可以每天进行一次，并且可以分为几次。该剂量无意以任何方式限制本发明的范围。根据本发明的药物组合物可以配制成丸剂、糖衣片剂、胶囊、溶液、凝胶、糖浆、浆剂和悬浮液。

在本发明中，食品组合物可以用于各种食品，例如饮料、口香糖(gum)、茶、维生素复合物、保健食品(health-supplementaryfood)，并且可以以丸剂、粉末、颗粒、输液、片剂、胶囊或饮料的形式使用。食品组合物包含健康功能食品组合物。在这种情况下，通常在本发明中，在食品或饮料中使用的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的量，在食品组合物的情况下，可以是基于总食品重量的0.01至15wt％，在保健饮料组合物的情况下可以为基于100ml的0.02至10g，优选为0.3至1g。如本文所用，健康功能食品是使用具有对人体有用的功能的原料或成分制备和/或加工的食品，并且是指与普通食品相比在其成分中具有独特特征并具有更积极的健康维持或目的或预期效果的食品。

本发明的食品组合物可以包含本领域中典型的食品添加剂，例如调味剂、增味剂、着色剂、填充剂、稳定剂等。除了衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡以外，根据本发明的食品组合物在作为基本成分添加的成分方面没有特别限制，并且可以含有各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述天然碳水化合物的例子包括普通糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等，以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白、甜叶菊提取物(例如甜叶菊甙a，甘草素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例通常为每100ml本发明的组合物约1至20g，优选约5至12g。

除了添加剂之外，本发明的食品组合物还可含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独或以其组合使用。这些添加剂的比例不是很重要，但是通常在每100重量份本发明的组合物中占0至20重量份的范围内选择。

在本发明中，化妆品组合物可以含有衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡，其量为基于该组合物的总重量的0.0005至50wt％。此外，除了衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡外，本发明的组合物还可以含有一种或多种表现出相同或相似功能的活性成分。

使用本发明的化妆品组合物制备的化妆品可以以一般乳液制剂和一般增溶制剂的形式制备。乳液制剂的化妆品的例子包含滋养乳液、乳霜、精华液等，并且增溶制剂的化妆品的例子包含柔肤水。另外，通过含有皮肤病学上可接受的介质或基质，化妆品可以以助剂的形式制备，该助剂可以局部或全身涂敷并且通常用于皮肤病学领域。

可以以例如溶液、凝胶、固体或无水糊状产品、乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微颗粒或离子(脂质体)和非离子囊泡分散体(其通过将油相分散在水相中而获得)、乳膏、化妆水(skintoner)、洗剂、粉末、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形式提供合适的化妆品制剂。此外，化妆品组合物可以以还含有压缩推进剂的泡沫或气雾剂组合物的形式制备。

此外，本发明的药物组合物可以另外含有通常用于美容或皮肤病学领域的辅助剂，例如脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂和胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂、香料、表面活性剂、水、离子或非离子乳化剂、填充剂、金属离子螯合剂、络合剂、防腐剂、维生素、封闭剂、润湿剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲脂性活性剂、脂质囊泡或化妆品中通常使用的任何其他成分。另外，可以以皮肤病学领域中通常使用的量引入成分。

可以添加本发明的化妆品组合物的产品的例子包括化妆品，例如紧致液、柔肤水、滋养爽肤水、各种乳膏、精华液、面膜(pack)、粉底等、清洁剂、洗面奶、肥皂、护理剂、美容剂液等。

本发明的化妆品组合物的特定制剂包括润肤液(skinlotion)、柔肤水、化妆水、紧致液、洁肤液(lotion)、牛奶润肤露、保湿液(moisturizinglotion)、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、保湿霜、护手霜、精华液、滋养精华液、面膜、肥皂、洗发水、清洁泡沫、清洁乳液、清洁霜、润肤露、沐浴露、乳液(emulsion)、压粉、散粉、眼影等。

在本发明的吸入剂组合物中，可以将活性成分直接添加到吸入剂中，或者可以与其他成分组合使用，并且可以根据常规方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或治疗)适当地确定。

另外，本发明提供一种治疗炎症疾病或癌症的方法，该方法包含将包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分的组合物给药至受试者的步骤。

此外，本发明提供药物组合物用于预防和/或治疗炎症疾病或癌症的用途，该药物组合物包含衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡作为活性成分。

另外，本发明提供衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡用于生产用于抗炎症疾病或癌症的药物的用途。

在本发明中，“给药”是指通过任何合适的方法向患者施用本发明的药物组合物，并且对于本发明的组合物的给药途径，本发明的组合物可以经由各种口腔内或肠胃外途径给药，只要本发明的组合物可以到达靶组织即可。

在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

[实施例]

实施例1.从副干酪乳杆菌中分离细胞外囊泡

为了分离衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡(ev)，将副干酪乳杆菌接种到deman-rogosaandsharpe(mrs)培养基中，于37℃以200rpm培养直至吸光度(od600nm)为1.0至1.5，然后将副干酪乳杆菌重新接种到luriabertani(lb)培养基中并进行培养。然后，通过回收包括细菌细胞的培养液并于4℃以10,000g离心20分钟，获得去除了细菌细胞的上清液。又使用0.22μm的过滤器过滤所获得的上清液，并使用100kda的pellicon2盒式滤膜(merckmillipore)和masterflex泵系统(cole-parmer)将过滤的上清液浓缩至50ml或更小的体积。通过使用0.22μm过滤器再次过滤浓缩的上清液来分离衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡。使用piercebca蛋白质检测试剂盒(thermofisherscientific)测量上清液中蛋白质的量。然后，使用jem-1011透射电子显微镜(tem,jeol)和zetasizernanozs(malverninstruments)观察分离的细胞外囊泡。通过相同的方法分离衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡作为对照。结果在图1a和1b中示出。

如图1a和1b所示，证实了从副干酪乳杆菌的培养液分离的细胞外囊泡具有34.22nm的平均直径，并且通常是分离的。

实施例2.副干酪乳杆菌的细菌细胞的制备

为了比较衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡与细菌细胞，制备了副干酪乳杆菌细菌细胞。更具体地，将以与实施例1中相同方式培养的副干酪乳杆菌细菌细胞于70℃热处理1小时后，得到通过加热失活的细菌细胞，通过于4℃以10,000g离心20分钟而从细菌细胞中除去上清液。然后，在将细菌细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)再次漂浮后，使用piercebca蛋白质检测试剂盒(thermofisherscientific)测量蛋白质的量。

实施例3.证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的炎症诱导作用

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对炎性细胞中炎症响应的影响，使用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡以0.1、1和10μg/ml的浓度处理小鼠巨噬细胞系raw264.7并允许其反应，然后测量细胞凋亡的程度和tnf-α的分泌量。更具体地说，将以5x10个细胞/孔的密度分配到48孔细胞培养板中的raw264.7细胞用衍生自副干酪乳杆菌的囊泡在dulbecco氏改良的eagle氏培养基(dmem)无血清培养基中处理并培养了12个小时。然后，使用ez-cytox(dogen)测量细胞凋亡的程度，将细胞培养液放入1.5ml管中，通过以3,000g离心5分钟仅获得其上清液，然后储存在-80℃下并进行elisa。为了进行elisa，将捕获抗体用磷酸盐缓冲盐水(pbs)稀释，并将其50μl等分试样分配到96孔板中，然后于4℃反应16小时。随后，将样品用100μl的pbst(0.05％含吐温20的pbs)溶液洗涤三次，然后将rd(1％含牛血清白蛋白(bsa)的pbs)溶液分配成每孔100μl等分试样，然后在室温下封闭1小时。然后，将待测样品和标准品调节至相同浓度，向其中加入两种样品各50μl，并允许所得溶液在室温下反应2小时并使用pbst洗涤三次。然后，将检测抗体在rd中稀释，每孔添加50μl所得溶液，允许在室温下反应2小时，并使用pbst洗涤三次以彻底去除未结合的抗体，然后每孔加入在rd中以1/40稀释的50μl链霉亲和素-hrp(r&dsystem)，并允许所得物在室温下反应20分钟。最后，将样品和标准品用100μl的pbst洗涤三次，然后以每孔50μl等分试样分配四甲基联苯胺(tmb)底物(surmodics,usa)，然后在5分钟至20分钟后显色后，以每孔50μl等分试样分配1m硫酸溶液，从而终止反应，并使用spectramaxm3酶标仪(moleculardevices)测量450nm处的吸光度。结果在图2a和2b中示出。

如图2a所示，证实了衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡不影响细胞的活力，并且

如图2b所示，证实了当以10μg/ml或更高的高浓度处理时，衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡促进小鼠巨噬细胞细胞系炎性介质的分泌。

实施例4.证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的抗炎作用

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的抗炎作用，使用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡以0.1、1、10和50μg/ml的浓度预处理小鼠巨噬细胞系raw264.7，培养细胞，然后测量tnf-α的分泌量。更具体地，在将raw264.7细胞以每孔5x10个细胞的浓度等分到48孔板中之后，衍生自已经用dmem无血清培养基稀释的副干酪乳杆菌或者以与实施例2相同的方式制备的副干酪乳杆菌的细胞外囊泡被用来处理等分的raw264.7细胞，并将该细胞培养12小时。然后，用衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡以1μg/ml的浓度再次处理样品，然后再培养12小时。然后，以与实施例3相同的方式测量tnf-α的分泌量。结果在图3中示出。

如图3所示，证实了用副干酪乳杆菌细菌细胞预处理的样品不能显著降低衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡的tnf-α分泌，而在用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡处理的样品中，衍生自大肠杆菌的细胞外囊泡的tnf-α分泌以浓度依赖的方式显著降低。通过该结果，可以证实，使用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可以有效地抑制由病原细菌或由衍生自病原菌的细胞外囊泡引起的炎性响应。

实施例5：证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对lps诱导的炎性响应的抑制作用

5.1.qrt-pcr实验

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对脂多糖(lps)诱导的炎性响应的抑制作用，用lps和/或衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡处理作为结直肠癌细胞系的ht29细胞系。更具体地，在补充有10％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基中培养ht29细胞系后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞。然后，在无血清dmem培养基中培养3小时后，将衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡以500ng/ml的浓度进行预处理，并将细胞培养12小时。用1μg/ml的lps处理培养的细胞，然后再次培养12小时。然后，进行定量逆转录酶聚合酶链响应(qrt-pcr)。为了进行qrt-pcr，在按照制造商提供的方案使用trizol试剂(invitrogen)首先从培养细胞中提取总rna之后，使用nanodrop2000分光光度计测量rna的量，然后使用m-mlv逆转录酶合成cdna，并使用合成的cdna作为模板进行qrt-pcr。使用quant3studio实时pcr系统(appliedbiosystems)进行qrt-pcr，并且为了定量，根据制造商提供的协议使用cybergreenqpcrmastermix试剂盒进行qrt-pcr。所用的引物序列在表1中描述，并且结果在图4a和4b中示出。

[表1]

如图4a和4b所示，证实了由于lps促进了炎性响应，因此促炎细胞因子il-1α、il-1β、il-2、il-3和tnf-α的表达水平增加，但在用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡预处理的细胞(lpev)中，增加了的促炎细胞因子的表达得以抑制。此外，证实了il-10和tgf-β的表达增加。

5.2.蛋白质印迹实验

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对脂多糖(lps)诱导的炎性响应的抑制作用，进行了蛋白质印迹。在用冷磷酸盐缓冲液将以与实施例5.1相同方式制备的细胞洗涤两次，并用ripa裂解缓冲液(50mmtris-hcl(ph7.4),150mmnacl,1.0％np-40,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％十二烷基硫酸钠(sds),50mmnaf,0.1mm苯基甲磺酰氟和0.5％蛋白酶抑制剂混合物)裂解后，通过于4℃以12,000xg离心5分钟彻底去除细胞碎片，然后使用piercebca蛋白质检测试剂盒(thermofisherscientific)测量蛋白质的量。然后，通过使用8至12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶对40μg蛋白质进行sds-page(bio-radlaboratories)执行蛋白质分离，将已分离的蛋白质转移至hybond^tm-ecl硝酸纤维素膜(amershambioscience)。然后，使用补充了5％脱脂奶的tbst在室温下将其中转移有蛋白质的膜封闭1小时，然后用以1：2,000稀释的一抗处理，并允许于4℃反应16小时。然后，使用tbst将该膜洗涤三次，然后用已经结合了以1：2,000稀释的hrp的二抗处理，允许在室温下反应1小时，并使用ecl检测系统(amersham)进行观察。抗cox-2和活化的mmp9的抗体购自santacruz，抗nfκ和inos的抗体购自biolegend，以及抗β-肌动蛋白、磷酸化-iκκ和iκ的抗体购自cellsignalingtechnology并使用。结果在图5a和5b中示出。

如图5a和5b所示，证实了在单独用lps处理的对照中，根据lps处理时间(2、6、12和24小时)，增加了cox2、活化的mmp9和inos的表达水平并且促进了iκ的磷酸化，并且证实促进了nfκ向核内的转移。然而，证实了在用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡预处理的细胞的情况下，降低了由lps处理诱导的炎症蛋白的表达，抑制了iκ的磷酸化，并且抑制了nfκ向核内的转移。通过该结果，可以证实副干酪乳杆菌可以有效抑制lps诱导的炎性响应。

实施例6：证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎中炎性响应的抑制作用

6.1.组织学分析

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎的治疗作用，通过用葡聚糖硫酸钠(dss)处理小鼠来诱导结肠炎。更具体地，将7周大的雄性c57bl/6小鼠在一般条件下饲养一周作为适应期，然后将2w/v％dss(mpbiomedicals,llc)与饮用水混合并提供5天。对照饲喂一般饮用水5天。在dss给药的第1天，使用口服管饲法将每只小鼠10mg的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡注射到小鼠中。然后，在实验开始后的第13天，麻醉小鼠，提取结肠，然后测量从回盲连接部(ileocecaljunction)到直肠的长度，并将提取的结肠储存在-80℃下用于后续实验。每天记录疾病活动指数(dai)、体重、粪便稠度和血便水平。更具体地，当体重是相对于第0天的体重的100％或更多，90至100％，80至90％，以及80％或更少时，将疾病活动指数分别标示为1、2、3和4，并且当大便正常、稍稀、稀以及为水状时，将粪便稠度分别标示为1、2、3和4。另外，当大便正常时，当大便中有血液时，当在肛门中观察到血液时，以及当在大便和肛门中都观察到血液时，将血便水平分别标示为1、2、3和4。结果在图6a至6e中示出。

证实了在dss给药的小鼠中结肠的长度缩短了，但是在衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡和dss一起给药的实验组中，结肠的初始长度得以维持(图6a和6e)。此外，证实了在衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡和dss一起给药的实验组中，体重保持在与对照相似的水平，并且疾病活动指数与dss给药的小鼠的疾病活动指数相比也降低了(图6b和6d)。另外，证实了衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡一起给药的实验组表现出与对照相同的生存力(图6c)。通过该结果，可以证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可以有效地抑制dss诱导的结肠炎。

6.2.qrt-pcr实验

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎的治疗作用，以与实施例5.1相同的方式通过从储存在-80℃下的结肠中提取mrna来进行qrt-pcr。结果在图7a至7d中示出。

如图7a至7d所示，证实了在用衍生自衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡预处理的小鼠(lpev)中，作为促炎细胞因子的tnf-α和il-1β的增加了的表达显著降低，并且增加了il-10和tgf-β的表达。通过该结果，可以证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡有效地抑制了dss诱导的炎性响应。

6.3.蛋白质印迹实验

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡对dss诱导的结肠炎的治疗作用，以与实施例5.2相同的方式通过从储存在-80℃的结肠中提取蛋白质来进行蛋白质印迹。结果在8a和8b中示出。

如图8a和8b所示，证实了在用衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡处理的小鼠中，降低了通过dss处理诱导的炎性蛋白的表达水平，由于抑制了iκ的磷酸化而抑制了iκ的降解，并且抑制了nfκ向核内的转移。通过该结果，可以证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡有效地抑制了dss诱导的炎性响应。

实施例7.证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的抗癌作用

为了证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的抗癌作用，通过将作为小鼠结直肠癌细胞的ct26细胞注射到小鼠中来诱导癌症。更具体地，将6周大的雄性c57bl/6小鼠在一般条件下饲养3天作为适应期，然后口服20μg的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡5天。使对照(pbs)口服pbs5天。在实验开始后的第8天，将作为小鼠结直肠癌细胞的1x10⁶个ct26细胞皮下注射到小鼠中。然后，每天一次每周5天口服20μg的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡或pbs持续3周，同时测量癌症的大小。

如图9所示，在pbs单独给药的对照中，癌症的大小呈指数增加，但是在口服了衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡的实验组中，癌症的大小比对照组的小了约50％。通过该结果，可以证实衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可以有效地抑制癌症的生长。

通过该结果，证实了本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡通过有效地抑制被称为各种慢性炎症疾病的因子的tnf-α等的表达而表现出抗炎作用，并且通过有效地抑制癌症动物模型中癌症的生长而表现出预防和/或治疗各种炎症疾病和癌症的作用，从而预期本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可用于减轻、预防或治疗各种炎症疾病和癌症。

提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或实质特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例仅在所有方面进行了说明，而不是限制性的。

[工业适用性]

由于根据本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可以有效地抑制被称为各种慢性炎性疾病的因子的促炎性细胞因子tnf-α、il-1β等的表达，因此预期根据本发明的衍生自副干酪乳杆菌的细胞外囊泡可广泛用作具有低副作用的用于减轻、预防或治疗的各种慢性炎症疾病和癌症的药剂，从而具有工业应用性。

<110>md保健株式会社

<120>衍生自副干酪乳杆菌的囊泡及其用途

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