通过诱导再生样反应的癌症消退

1.本发明涉及肿瘤学领域，具体地涉及抗癌剂或机制领域。具体地，再生样反应的激活，如通过激活yap和/或taz在具有肿瘤或癌症的器官中的表达和/或功能，能够引起肿瘤或癌症的消退。


背景技术：

2.肿瘤不仅包括肿瘤细胞，而且还包括招募到生长的肿瘤中的多种其他基因正常的基质细胞。这些包括构建新血管的内皮细胞、产生胞外基质的成纤维细胞和可以具有肿瘤促进或肿瘤抑制作用的多种类型的免疫细胞(quail&joyce 2013,nat med 19:1423
‑
1437；shi等人2017,nat rev drug discov 16:35
‑
52；ungefroren等人2011,cell commun signal 9:18)。因此，肿瘤是复杂结构，其中不同细胞类型之间彼此的信号转导对其生长和存活是必不可少的。的确，多项工作涉及解释肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞之间复杂的互相依赖性以希望识别癌症疗法可以靶向的新的脆弱性(ungefroren等人2011,cell commun signal 9:18)。这些工作已提供了大量消息并且导致本发明产生了靶向基质细胞以攻击癌症的免疫疗法和抗血管生成疗法(bergers&hanahan 2008,nat rev cancer 8:592
‑
603；khalil等人2016,nat rev clin oncol 13:273
‑
290)。然而，尽管已大力研究了肿瘤微环境，但是对于肿瘤和它们正常的周围“宿主”组织之间的相互作用的关注较少。因此，对于肿瘤如何与它们的宿主器官相互作用，肿瘤
‑
周围组织如何对肿瘤的存在起反应，以及这种反应如何影响肿瘤生长知之甚少。
3.pan在他的综述(2010,dev cell 19:491
‑
505；以及其中引用的参考文献)中总结了有关最早在果蝇中发现并随后认为在哺乳动物中保守(尽管具有差异)的hippo
‑
途径的可用知识。转基因和敲除小鼠实验显示yap(果蝇yorkie(yki)的哺乳动物同源物，通过hippo信号通路调控的转录辅激活蛋白；yap的哺乳动物同源物是taz)的过表达，mstl/2(果蝇hippo的哺乳动物同源物，hpo，激酶)的敲除、sav1(果蝇salvado的哺乳动物同源物，sav，hippo的调控因子)的敲除分别导致肝脏尺寸增大，并最终导致肝细胞癌(hcc)的诱导。nf2/merlin(hippo的上游)的失活也导致了hcc和胆管肿瘤，而在mst1/2或sav1的敲除也观察到了后者。
4.在几种癌症(成神经管细胞瘤、口腔鳞状细胞癌以及肺癌、胰腺癌、食管癌、肝癌和乳腺癌)中观察到了yap基因位点的扩增。经常在肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝细胞癌和前列腺癌中观察到yap过表达，并且它是hcc中的预后标志物。
5.因此，一种新兴的癌症途径是hippo通路(harvey等人2013；zanconato等人2016)。当结合至tead家族及其他转录因子时，这种途径的效应因子，yap和taz转录共激活剂，调控基因表达(meng等人2016)。它们的活性受激酶级联调控，所述激酶级联包含哺乳动物ste20样激酶1/2(mst1/2)和大肿瘤抑制激酶1/2(lats1/2)，它们使yap/taz磷酸化。yap和/或taz的磷酸化抑制了它们的转录活性并且促进了它们的核输出和蛋白酶体降解。当lats1/2激酶是非活性的时，yap和taz在核中积累并且促进细胞增殖、干性和细胞存活(zanconato等
人2016)。这可以导致祖细胞群体扩增并最终导致癌症起始(johnson&haider 2014；zanconato等人2016)。yap或taz的激活实际上促进了几种癌细胞标志，如干性、细胞周期进程、抗药性和转移潜能提高。因此，认为yap和taz是癌症疗法的有吸引力的靶标，因为(i)大部分人癌症显示yap/taz水平和/或活性的上调；(ii)在基因或异种移植小鼠模型中，yap/taz的下调体内减缓了癌细胞扩散和肿瘤生长，和(iii)它们基本上对于多种成年小鼠组织的正常体内平衡是非必需的(harvey等人2013；johnson&haider 2014；zanconato等人2016)。因此，正在进行针对识别yap/taz药理学抑制剂的一些雄心勃勃的学术和工业项目。在本发明的框架中，在下文中讨论了这些项目的一些结果。


技术实现要素：

6.在一个方面，本发明涉及用于治疗或抑制癌症、用于抑制肿瘤生长的进程或者用于治疗或抑制肿瘤转移的yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂。
7.增强剂或激活剂对yap和/或taz的功能和/或表达的影响是直接或间接的。
8.yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂可以是药理学化合物或基因治疗性化合物。具体地，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂是能够激活yap和/或taz的表达和/或功能的核酸或者是能够阻断yap和/或taz的表达和/或功能的失活的核酸。
9.在任何上述内容中，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂瞬时起作用或者是可诱导的，或者yap和/或taz的表达和/或功能的失活的阻断是瞬时或可诱导的。
10.在任何上述内容中，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂是能够驱动yap或组成型活性的yap变体的表达的核酸；能够驱动taz或组成型活性的taz变体的表达的核酸；能够驱动yap、taz、组成型活性的yap变体或组成型活性的taz变体的任何组合的表达的核酸；或者分别单独能够驱动yap、taz、组成型活性的yap变体或组成型活性的taz变体的表达的核酸的任何组合。在本文中，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂还可以在相同或单独的核酸上进一步与能够驱动tead转录因子的表达的基因组合。
11.在任何上述内容中，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂是糖皮质激素、鞘氨醇
‑1‑
磷酸酯(s1p)、二氢
‑
s1p、溶血磷脂酸(lpa)或依沙吖啶或者与它们组合。
12.在任何上述内容中，将yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂局部施用至具有癌症或肿瘤的器官，或者瘤周、外周或全身施用；或者用于在具有癌症或肿瘤的器官的局部施用中使用或者用于在瘤周、外周或全身施用中使用。
13.在任何上述内容中，可以结合巨噬细胞集落刺激因子1(csf1)、β
‑
连环蛋白、粒性白细胞集落刺激因子(gcsf)、rage抑制剂或者结合它们的任何组合施用yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂。
14.作为另外一种选择，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂用于在与巨噬细胞集落刺激因子1(csf1)、β
‑
连环蛋白、粒性白细胞集落刺激因子(gcsf)、rage抑制剂的施用结合或者与其任何组合结合的施用中使用。
15.在任何上述内容中，可以结合细胞分裂弱化剂、抗纤维化剂或者结合它们的任何组合施用yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂。作为另外一种选择，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂用于在与细胞分裂弱化剂、抗纤维化剂的施用结合
或者与其任何组合结合的施用中使用。
16.在任何上述内容中，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂可以以任何方式与其他抗癌治疗或抗肿瘤剂组合。作为另外一种选择，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂用于在与其他抗癌治疗或抗肿瘤剂结合的施用中使用。
17.此外，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂可以用于治疗或抑制癌症、用于抑制肿瘤生长的进程，或者用于治疗或抑制肿瘤转移，具体地在残余肿瘤或癌症组织的手术切除之前。此外，yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂可以用于治疗或抑制癌症、用于抑制肿瘤生长的进程，或者用于治疗或抑制肿瘤转移，具体地在yap和/或taz的表达和/或功能的抑制剂的施用之前。
18.在任何上述内容中，所述癌症或肿瘤具体地为肝癌或肝肿瘤。更具体地，所述肝肿瘤可以是肝胆管型肝癌、肝细胞癌或者可以是转移性肝肿瘤。
19.在另一个方面，本发明涉及用于治疗或抑制肝癌，用于抑制肝肿瘤生长的进程或者用于治疗或抑制肝肿瘤转移的肝再生增强剂或激活剂。
附图说明
20.图1.肿瘤细胞存活取决于周围肝脏组织中的yap/taz水平
21.(a)小鼠野生型(顶部图)和icc(肝内肝胆管型肝癌)肝脏(底部图)组织切片上的yap的免疫荧光检测。通过ha
‑
akt表达(绿色)检测肿瘤细胞。箭和箭头分别表示胆管和门动脉中的yap。比例尺，100μm。(b)示意性实验概要。对yap
fl/fl
；taz
fl/fl
小鼠的肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt和sb11载体。在4周时，这些小鼠接受他莫昔芬治疗(连续5天)和/或aav
‑
cre，并且在7周时处死并分析。(c)遗传肝脏示意图(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和在不同肝脏区室/组织中具有条件性yap和taz缺失的具有icc的小鼠肝脏的相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片。通过ha
‑
akt表达，通过免疫荧光染色(绿色)检测肿瘤细胞(比例尺，500μm)。箭表示肿瘤。(d)在肿瘤发展7周时，野生型、无cre、sb
‑
cre
ert2
和sb
‑
cre
ert2
+aavcre处理小鼠肝脏的肝脏与体重之比的定量。在肿瘤发展7周时，野生型和具有icc的yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏的(e)肿瘤面积相对百分比和(f)绝对肿瘤负荷的定量。(g)野生型和yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
小鼠的肿瘤和肝细胞裂解液的总yap和taz(顶部)和ha
‑
akt表达(底部)的免疫印迹。(h)肿瘤yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
(顶部图)以及肿瘤和肝细胞yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
(底部图)组织切片上的yap的免疫荧光检测。通过ha
‑
akt表达(绿色)检测肿瘤细胞。箭头表示yap阳性内皮细胞。比例尺，100μm。(i)野生型(顶部)、肿瘤特异性重组(中间)以及肿瘤和肝细胞重组(底部)中tdtomato报告子的免疫荧光检测。比例尺，100μm。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.1。
22.图2.yap在小鼠和人肝脏中的瘤周肝细胞中上调。
23.(a)具有icc的肝脏切片中yap(左图)和taz(右图)蛋白表达模式的免疫荧光检测。。通过ha
‑
akt表达(红色)标记肿瘤细胞。比例尺，100μm。(b)人肝脏切片上yap的免疫组织化学检测。比例尺，200μm。(c)正常和瘤周纯化的肝细胞的yap和taz的定量rt
‑
pcr。(d
‑
e)肝脏切片的免疫荧光检测和定量，其显示在用ha
‑
标签化yap
±
tead4高压转染的野生型肝脏和具有icc的肝脏中异位yap蛋白定位的变化。比例尺，100μm。(f)热图显示相对于具有正常肝细胞的相匹配的对照肝脏，瘤周肝细胞中yap标签基因上调(sohn等人2016)。(g)gsea
图显示了从人hcc(肝细胞癌)样品(sohn等人2015)和过表达yap的培养细胞(zhao等人2008)中识别的两组yap标签基因的分布。(h)通过yap靶标基因的定量rt
‑
pcr对yap特征的验证。参见实施例2.2。
24.图3.瘤周肝细胞中的yap非细胞自主作用以限制肿瘤生长。
25.(a
‑
b)tdtomato报告子的免疫荧光检测和定量，其显示r26
‑
tdtomato报告子的重组在肝细胞(红色)中特异，但在肿瘤细胞中不是(通过ha
‑
akt标记，绿色)。比例尺，100μm。(c)示意性实验概要。对yap
fl/fl
；taz
fl/fl
小鼠的肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt和sb11载体。在4周时，对这些小鼠注射aav
‑
cre，并在7周时处死并分析。(d)野生型和用aav
‑
cre处理的具有和不具有n
‑
akt肿瘤的yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
小鼠的yap和taz的定量rt
‑
pcr。(e)野生型和yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏的完整肝脏裂解液的免疫印迹显示yap和taz有效缺失。(f)显示在肝细胞中具有条件性yap和taz缺失的具有icc的小鼠肝脏的遗传操纵(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片的肝脏示意图。通过表达(红色)标记肝细胞，通过dapi标记核(灰色)(比例尺，500μm)。(g)在肿瘤发展7周时，野生型和具有icc的yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏的平均肝脏与体重之比的定量。(h)在肿瘤发展7周时，野生型和具有icc的yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏的相对肿瘤面积百分比的定量。(i)在肿瘤发展7周时，野生型和具有icc的yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏的肿瘤负荷的定量。(j
‑
k)通过在yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏中的ki67染色(红色)，野生型和yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏切片的免疫荧光分析和定量显示肿瘤细胞增殖提高。通过ha
‑
akt表达(绿色)标记肿瘤细胞。比例尺，100μm。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.3。
26.图4.瘤周肝细胞中yap的超激活引起肿瘤细胞消除。
27.(a)示意性实验概要。对lats1
fl/fl
；lats2
fl/fl
或lats1
fl/fl
；lats2
fl/fl
；yap
fl/fl
；taz
fl/fl
小鼠的肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt和sb11载体。在4周时，对这些小鼠注射aav
‑
cre，并在6周时处死并分析。(b)在肿瘤发展4周时，lats1
fl/fl
；lats2
fl/fl
肝脏的完整肝脏和苏木精
‑
伊红(h&e)切片。比例尺分别为1cm和1000μm。(c)完整肝脏裂解液的免疫印迹显示与野生型肝脏相比，在aav
‑
cre注射后的不同天数，lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏中yap磷酸化降低(s112)并且taz水平升高。(d
‑
e)在野生型、lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
和lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
；yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
突变体肝脏的切片中的肝细胞增殖的免疫荧光分析和定量。通过ki67(红色)标记增殖细胞，通过ha
‑
标签化akt(绿色)标记肿瘤细胞。比例尺，100μm。(f)与野生型肝脏相比，lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏的肝脏与体重之比升高，并且挽救了lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
；yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
肝脏。(g)在肝细胞中具有条件性lats1/lats2和yap/taz缺失的具有icc的小鼠肝脏的显示遗传操纵的肝脏示意图(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片。通过ha
‑
akt表达(绿色)检测肿瘤细胞，通过dapi(蓝色)检测核(比例尺，500μm)。在肿瘤发展6周时，野生型、具有icc的lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
和lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
；yap
‑
/
‑
；taz
‑
/
‑
突变体肝脏的(h)相对肿瘤面积百分比和(i)绝对肿瘤负荷的定量。(j)5周后，肿瘤负荷发展显示lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏中肿瘤负荷减小。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.4。
28.图5.瘤周肝细胞中的yap
1sa
表达降低了肿瘤负荷并且延长了存活。
29.(a)示意性实验概要。对apoe
‑
rtta；teto
‑
yap
1sa
小鼠肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt和sb11载体。在4周时，当处死和分析小鼠时，随意(ad libitum)施用多西环素2周。(b)apo>
hyap
1sa
肝脏切片的免疫荧光检测，其显示了肝细胞特异性人yap
1sa
表达(红色)，但是在肿瘤细胞中不表达(通过ha
‑
akt标记，绿色)。比例尺，100μm。(c)具有条件性人yap
1sa
表达的具有icc的小鼠肝脏的遗传肝脏示意图(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片。通过ha
‑
akt表达，在免疫荧光染色(绿色)中检测肿瘤细胞(比例尺，500μm)。(d)在肿瘤发展6周时，野生型和具有icc的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的平均肝脏与体重之比的定量。(e)在肿瘤发展6周时，野生型和具有icc的apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏的绝对肿瘤负荷的定量。(f)5周后，肿瘤负荷发展显示apo>yap
1sa
肝脏中肿瘤负荷减小。(g)野生型和具有icc的apo>yap
1sa
小鼠的存活百分比(**，p＝0.0033)。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.5。
30.图6.癌细胞中bcl2的过表达防止通过瘤周肝细胞中yap激活所诱导的肿瘤消除。
31.(a
‑
b)在aav
‑
cre施用后6天，野生型和具有n
‑
akt肿瘤的lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏切片的tunel染色(绿色)和定量。通过ha
‑
akt(红色)标记肿瘤细胞。比例尺，100μm。(c)野生型和lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
肝脏切片中癌症相关免疫细胞(cd45+和cd3+)数目的定量。(d)对于yap、taz和切割的半胱天冬氨酸酶3水平的变化，肿瘤和完整肝脏裂解液的免疫印迹。将通过ccl4所造成的肝损伤用作对照样品以检测细胞死亡标志物变化。(e)来自野生型和lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏的肿瘤的免疫印迹分析显示了坏死性凋亡、细胞凋亡和缺氧标志物。(f)示意性实验概要以有条件地诱导bcl2在肿瘤细胞中的表达并使lats1和lats2缺失。对lats1
fl/fl
；lats2
fl/fl
小鼠肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt、teton
‑
bcl2和sb11载体。在4周时，对这些小鼠注射aav
‑
cre，并且当处死和分析小鼠时，随意施用多西环素2周。(g)野生型以及表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏的完整肝脏照片(左图)(比例尺，1cm)和相应免疫荧光染色切片(右图)。通过ha
‑
akt表达(黑色)检测肿瘤细胞，通过dapi(蓝色)检测核(比例尺，500μm)。(h)野生型以及表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏的平均肝脏与体重之比。(i)野生型以及表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏中的相对肿瘤面积的定量。(j)野生型以及表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
突变体肝脏中的绝对肿瘤负荷的定量。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.6。
32.图7.瘤周肝细胞中yap的激活引起肝细胞癌和转移性黑素瘤癌细胞的消除。
33.(a)示意性实验概要。对apoe
‑
rtta；teto
‑
yap
1sa
小鼠肝脏高压注射myc
‑
i
‑
nras、sh
‑
rtta、sh
‑
hyap
1sa
和sb11载体。在4周时，当处死和分析小鼠时，随意施用多西环素2周。(b)在6周时，野生型和具有hcc、sh
‑
rtta和sh
‑
hyap
1sa
的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的平均肝脏与体重之比的定量。(c
‑
d)在肿瘤发展6周时，野生型和具有hcc、sh
‑
rtta和sh
‑
hyap
1sa
的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的相对(c)和绝对(d)肿瘤负荷的定量。(e)在6周时，具有条件性人yap
1sa
肝细胞表达的具有icc、sh
‑
rtta和sh
‑
hyap
1sa
的小鼠肝脏的显示遗传操纵的肝脏示意图(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片。在对磷酸化
‑
erk表达呈阳性(绿色)并且对dpp
‑
iv呈阴性(红色)的免疫荧光染色中检测肿瘤细胞(比例尺，500μm)(f)示意性实验概要。对apoe
‑
rtta；teto
‑
yap
1sa
小鼠肝脏高压注射10.000nras
+
/ink4a
‑
/
‑
黑素瘤细胞。在4周时，当处死和分析小鼠时，随意施用多西环素2周。(g)在6周时，野生型和具有nras
+
/ink4a
‑
/
‑
黑素瘤转移的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的平均肝脏与体重之比的定量。(h
‑
i)在肿瘤发展6周时，野生型和具
有nras
+
/ink4a
‑
/
‑
黑素瘤转移的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的相对(h)和绝对(i)肿瘤负荷的定量。(j)具有条件性人yap
1sa
肝细胞表达的具有nras
+
/ink4a
‑
/
‑
黑素瘤转移的小鼠肝脏的遗传肝脏示意图(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片。在对s100表达呈阳性(绿色)并且对dppiv呈阴性(红色)的免疫荧光染色中检测肿瘤细胞(比例尺，500μm)。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.7。
34.图8.肿瘤细胞存活取决于周围肝脏组织中的yap/taz水平。
35.(a)在野生型小鼠中，在不同的时间点(4至7周)具有icc的小鼠肝脏的位置肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)切片(比例尺，1000μm)。(b)在不同肝脏区室中，具有cre的具有icc的小鼠肝脏的免疫荧光染色切片。通过ha
‑
akt表达，在免疫荧光染色(绿色)中检测肿瘤细胞(比例尺，500μm)。(c)平均肝脏与体重之比的定量。在肿瘤发展7周时，具有以下治疗：无cre、sb
‑
cre
ert2
和sb
‑
cre
ert2
+aavcre治疗的小鼠肝脏的野生型小鼠的(d)相对肿瘤面积百分比和(e)绝对肿瘤负荷的定量。(f)野生型(顶部)和肝细胞重组(底部)中tdtomato报告子的免疫荧光检测，其显示了完全肝细胞重组。比例尺，100μm。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.1。
36.图9.yap在小鼠和人肝脏中的瘤周肝细胞中上调。
37.(a)人肝脏切片上yap的免疫组织化学检测。比例尺，200μm。(b
‑
c)人hcc和icc群组的表，其显示了根据瘤周yap以及它们的病因学水平的患者分布。(d)显示人hcc和icc肝脏的瘤周肝细胞中yap的不同水平的患者百分比。(e)示意性实验概要。对rosa26 tdtomato小鼠的肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt和sb11载体。在4周时，对这些小鼠注射aav
‑
cre，并在7周时处死并分析。(f)facs点图显示了percoll分离的肝细胞的纯度。(g)以p
‑
值显示的在瘤周肝细胞中高度富集的yap相关基因本体(gene ontology，go)条目(terms)。(h
‑
i)正常肝脏和具有icc的肝脏之间的增殖肝细胞的免疫荧光分析和定量。比例尺，100μm。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.2。
38.图10.瘤周肝细胞中的yap1sa表达降低了肿瘤负荷并且延长了存活。
39.(a)在2周内，在apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏中平均肝脏与体重之比升高。(b)在apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏切片中，肿瘤细胞增殖的免疫荧光分析。通过ki67(绿色)标记增殖细胞，通过dapi(蓝色)标记核。比例尺，100μm。(c)野生型和apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏的完整肝脏裂解液的免疫印迹显示了有效的yap过表达。(d)在7周时，具有icc的野生型c57bl/6小鼠肝脏的完整肝脏照片和苏木精
‑
伊红(h&e)切片。比例尺分别为1cm和1000μm。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.5。
40.图11.癌细胞中bcl2的过表达防止通过瘤周肝细胞中yap激活所诱导的肿瘤消除。
41.(a
‑
b)在野生型(顶部)和lats1
‑
/
‑
；lats2
‑
/
‑
(底部)突变体肝脏切片中，免疫细胞浸润的免疫荧光分析。通过cd45和cd3(红色)标记免疫细胞，通过ha
‑
标签化akt(绿色)标记肿瘤细胞。比例尺，100μm。(c)示意性实验概要以有条件地诱导bcl2在肿瘤细胞中的表达和hyap
1sa
的过表达。对apo>hyap
1sa
小鼠的肝脏高压注射n
icd
、ha
‑
akt、teton
‑
bcl2和sb11载体。在4周时，对这些小鼠注射aav
‑
cre，并且当处死和分析小鼠时，随意施用多西环素2周。(d)表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏中的相对肿瘤面积的定量。(e)表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏中的绝对肿瘤负荷
的定量。(f)表达和不表达bcl2的具有icc肿瘤的apo>hyap
1sa
±
多西环素肝脏的完整肝脏照片(左图)(比例尺，1cm)和相应免疫荧光染色切片(右图)。通过migg表达(红色)检测肿瘤细胞，通过dapi(蓝色)检测核(比例尺，500μm)。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.6。
42.图12.瘤周肝细胞中yap的激活引起肝细胞癌细胞消除。
43.(a)示意性实验概要。对apoe
‑
rtta；teto
‑
yap
1sa
小鼠肝脏高压注射myc
‑
i
‑
nras、sh
‑
renilla、sh
‑
rtta或者sh
‑
hyap
1sa
和sb11载体。在4周时，当处死和分析小鼠时，随意施用多西环素2周。(b)在6周时，野生型和具有hcc、sh
‑
renilla、sh
‑
rtta或sh
‑
hyap
1sa
的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的平均肝脏与体重之比的定量。(c)在肿瘤发展6周时，野生型和具有hcc、sh
‑
renilla、sh
‑
rtta或sh
‑
hyap
1sa
的apo>yap
1sa
±
多西环素肝脏的绝对肿瘤负荷的定量。(d)在6周时，具有条件性人yap
1sa
肝细胞表达的具有icc、sh
‑
renilla、sh
‑
rtta或sh
‑
hyap
1sa
的小鼠肝脏的显示遗传操纵的肝脏示意图(左图)，完整肝脏照片(比例尺，1cm)和相应苏木精
‑
伊红(h&e)(比例尺，1000μm)和免疫荧光染色(右图)切片。在对磷酸化
‑
erk表达呈阳性(绿色)并且对dppiv呈阴性(红色)的免疫荧光染色中检测肿瘤细胞(比例尺，500μm)。(e)sh
‑
renilla、sh
‑
rtta或sh
‑
hyap
1sa
在小鼠肝脏中的免疫荧光验证。在对gfp(绿色)呈阳性的免疫荧光染色中检测了shrna表达。比例尺，100μm。数据为平均值
±
sem。参见实施例2.7。
具体实施方式
44.hippo通路效应因子yap和taz的抑制逐渐成为有吸引力的治疗干预。然而，在导致本发明的工作中，识别了yap和taz本身的意外的肿瘤抑制活性。与正常肝脏中的肝细胞相反，瘤周肝细胞显示出高yap/taz活性水平。yap和taz在瘤周肝细胞中的缺失导致肝肿瘤加速生长。然而，相反地，瘤周肝细胞中的yap的超激活意外地引发了所建立的肝细胞癌、肝胆管型肝癌和黑素瘤源性转移性病变向肝脏的消退。在yap激活后数天内发生了yap
‑
介导的肿瘤细胞消除(即通过yap和/或taz的表达和/或功能的提高或激活所介导的肿瘤消除)。因此，识别了新型肿瘤抑制机制，借此瘤周yap/taz激活(即yap和/或taz的表达和/或功能的提高或激活)抑制了致瘤作用和转移的出现。这些发现提供了(具体地)治疗过表达yap和/或taz的(肝)癌和(肝)转移的新的治疗途径：如由瘤周区域(例如，瘤周肝细胞)中的yap和taz的超激活所引起的(肝)修复/再生反应的激活导致了肿瘤细胞的除去并预防了转移。基于此，在以下方面和实施方式中定义了本发明，下文中对此进行了更详细地描述。
45.在一个方面，本发明涉及用于在治疗或抑制癌症(的方法)中使用，用于在抑制肿瘤生长的进程(的方法)中使用或者用于在治疗或抑制肿瘤转移(的方法)中使用；或者用于在用于治疗或抑制癌症、用于抑制肿瘤生长的进程或者用于治疗或抑制肿瘤转移的药剂的生产中使用的yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂。在本文中，所述增强剂或激活剂可以直接或间接激活yap和/或taz的表达和/或功能。在一个实施方式中，所述癌症是肝癌或者所述肿瘤是肝肿瘤。
46.作为另外一种选择，但不必需互相排斥，本发明涉及用于在治疗或抑制肝癌(的方法)中使用，用于在抑制肝肿瘤生长的进程(的方法)中使用或者用于在治疗或抑制肝肿瘤转移(的方法)中使用；或者用于在用于治疗或抑制癌症、用于抑制肿瘤生长的进程或者用于治疗或抑制肿瘤转移的药剂的生产中使用的肝再生激活剂。在本文中，肝再生激活剂可
以直接或间接激活yap和/或taz的表达和/或功能。
47.在任何上述内容中，yap和/或taz的表达和/或功能的激活剂或者肝再生的激活剂可以是如将在下文中解释的药理学化合物或者基因治疗性化合物。
48.当yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂或者肝再生的激活剂是基因治疗性化合物时，它可以(例如)是能够提高或激活yap和/或taz的表达和/或功能的核酸或者是能够阻断yap和/或taz的表达和/或功能的失活的核酸。在本文中，yap和/或taz的表达和/或功能的增强或激活可以是瞬时的或可诱导的，或者yap和/或taz的表达和/或功能的失活的阻断可以是瞬时的或可诱导的。具体地，所述基因治疗性化合物可以是能够驱动yap或组成型活性的yap变体的表达的核酸；能够驱动taz或组成型活性的taz变体的表达的核酸；能够驱动yap、taz、组成型活性的yap变体或组成型活性的taz变体的任何组合的表达的核酸；或者分别单独能够驱动yap、taz、组成型活性的yap变体或组成型活性的taz变体的表达的核酸的任何组合。这可以任选地(在相同或单独的核酸上)进一步与能够驱动tead转录因子的表达的基因组合。驱动基因表达的要求包括启动子(如器官特异性启动子)、蛋白
‑
编码序列和终止子之间的可操作性连接。
49.当yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂是药理学化合物时，它可以(例如)是糖皮质激素、鞘氨醇
‑1‑
磷酸酯(s1p)、二氢
‑
s1p、溶血磷脂酸(lpa)或依沙吖啶。当肝再生的激活剂是药理学化合物时，它可以(例如)是三碘甲状腺氨酸或胆汁酸。
50.用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂或肝再生激活剂的施用是施用于具有癌症或肿瘤的哺乳动物受试者，并且将有效量的所述增强剂或激活剂或者有效量的包含所述增强剂或激活剂的(药物可用的)组合物施用于对其有需要的哺乳动物受试者。具体地，用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂和/或任何肝再生激活剂向所述哺乳动物受试者的施用可以是局部施用于具有癌症或肿瘤的器官(如肝脏)或者可以是瘤周、外周或全身的。在外周或全身施用的情况下，可以设计所述增强剂或激活剂，从而它对具有癌症或肿瘤的器官显示出趋向性(例如，通过以任何方式连接至靶向剂，所述靶向剂将所述激活剂靶向至器官或所述器官中的细胞)。
51.可以将用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂或者肝再生激活剂与巨噬细胞集落刺激因子1(csf1)、β
‑
连环蛋白、粒性白细胞集落刺激因子(gcsf)、rage抑制剂的施用(在任何类型的治疗方案中)结合或组合或者与其任何组合，即csf1、β
‑
连环蛋白、gcsf和/或rage抑制剂的任何组合的施用(在任何类型的治疗方案中)结合或组合施用于哺乳动物受试者。
52.可以将用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂或者肝再生激活剂与细胞分裂弱化剂、抗纤维化剂的施用(在任何类型的治疗方案中)结合或组合或者与其任何组合，即细胞分裂弱化剂和/或抗纤维化剂的任何组合的施用(在任何类型的治疗方案中)结合或组合施用于哺乳动物受试者。具体地，在所述增强剂或激活剂的更长期/更慢性施用的情况下设想了这种组合以减少可能由于瘤周细胞分裂的长期激活所造成的副作用，如器官损伤或器官组织破坏。
53.用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂或者肝再生激活剂可以以任何方式(在任何类型的治疗方案中)与其他抗癌治疗
或抗肿瘤剂结合或组合施用于哺乳动物受试者。
54.在一个具体应用中，可以在肿瘤或癌症的手术干预或手术去除之前将用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂或肝再生激活剂施用于具有肿瘤或具有癌症的哺乳动物受试者。在后一种情况下，任何所述增强剂或激活剂的施用引起肿瘤或癌症缩小，尺寸或体积消退或减小，这有利于除去残余肿瘤或癌症的手术干预，或者有利于残余肿瘤或癌症的后续手术去除。
55.在其他具体应用中，可以在施用yap和/或taz的表达和/或功能抑制剂之前，将用于上文所述的(方法中的)用途的任何yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂施用于具有肿瘤或具有癌症的哺乳动物受试者。在后一种情况下，任何所述增强剂或激活剂的施用引起肿瘤或癌症缩小，尺寸或体积消退或减小，并且然后通过yap和/或taz的表达和/或功能的抑制剂攻击残余的肿瘤或癌症。通过所述抑制剂的施用，yap和/或taz的表达和/或功能的增强或激活作用减小(或终止或抑制；解毒作用(antidote effect))，因此及时限制了yap和/或taz的表达和/或功能的增强剂或激活剂的作用，因此限制了所述增强剂或激活剂潜在的副作用。照此，本文所述的发明的发明构思(提高或激活yap和/或taz的表达和/或功能以使肿瘤或癌症消退)可以与目标为抑制yap和/或taz的hippo信号通路中的现有干预组合。
56.在任何上述内容中，所述器官具体地为肝脏，所述肝肿瘤可以是原发性肝肿瘤(例如，肝胆管型肝癌和/或肝细胞癌)或者可以是转移性肝肿瘤(来源于非肝脏原发肿瘤的继发性肝肿瘤)。
57.在任何上述内容中，具体地将所述增强剂或激活剂设计或施用于对其有需要的哺乳动物，以这样的方式它能够引起瘤周(肝)细胞增殖。
58.通过实施例并且通过如下文所包括的描述所述方面和实施方式中所使用的术语的详细解释支持了如上所述的本发明的方面和实施方式。
59.治疗
[0060]“治疗”是指与保持未治疗时的疾病或病症或其单一症状的发展或预期发展相比，疾病或病症或其单一症状的发展的任何速率降低、延缓或延迟。更期望地，治疗导致疾病或病症或其单一症状不/零发展(即“抑制”或“发展抑制”)，或甚至导致已发展的疾病或病症或其单一症状的任何速率降低。在此背景下，“抑制”可以用作“治疗”的替代。治疗还表示实现与疾病或病症或者任何其单一症状有关的一种或多种临床症状的显著改善。根据情况，可以对显著改善定量或定性打分。定性标准可以(例如)通过患者健康程度。就定量评价来说，显著改善通常为与治疗前的情况相比，10％或以上，20％或以上，25％或以上，30％或以上，40％或以上，50％或以上，60％或以上，70％或以上，75％或以上，80％或以上，95％或以上或者100％的改善。评价改善的期间时限将取决于标准类型/所观察的疾病并且可以通过本领域技术人员确定。
[0061]
肿瘤、癌症、赘生物；和肝癌
[0062]
术语肿瘤和癌症有时可互换地使用，但是彼此可以是不同的。肿瘤是指可以是良性(大体上无害)或者恶性(癌性)的“块”。癌症是危害类型的肿瘤。肿瘤有时被称为赘生物：异常细胞生长，通常比正常细胞生长更快。良性肿瘤或赘生物是非恶性/非癌性的，通常是局部的且通常不扩散/转移至其他位置。由于它们的尺寸，它们可以影响相邻器官并因此可
以需要去除和/或治疗。癌症、恶性肿瘤或恶性赘生物在本质上是癌性的，可以转移并且有时在它所去除的位点再次发生(复发)。
[0063]
癌症开始出现的初始位点导致产生了原发性癌。当癌细胞从原发性癌(“种子”)离开时，它们可以移动(例如，通过血液和/或淋巴液)至甚至远离初始位点的另一个位点。如果另一个位点允许这些移动癌细胞定殖和生长，则可以出现新的癌症，其称为继发性癌症(“土壤”)。导致产生继发性癌症的过程也被称为转移，并且继发性癌症也被称为转移瘤。例如，肝癌可以起源于原发性癌，但是也可以是来源于(例如)原发性乳腺癌、肠癌或肺癌的继发性癌症；一些癌症类型显示出器官特异性转移模式。事实上，大部分癌症死亡是通过转移，而不是通过原发肿瘤造成的(chambers等人2002,nature rev cancer 2:563
‑
572)。
[0064]
在2012年，癌症是美国的第二主要死亡原因，但是与第一主要原因心脏病非常接近。2016年，美国的新癌症病例的预计数目(在相关的情况下，男女两者)从高到低排名为乳腺癌、肺和支气管癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤黑素瘤和膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌以及肾和肾盂癌、宫体癌、胰癌和直肠癌以及肝和肝内胆管癌；总计约129.3万新病例(约77％的总预期新病例)(siegel等人2016,ca cancer j clin 66:7
‑
30)。
[0065]
良性肝肿瘤包括血管瘤、肝腺瘤和局灶性结节性增生(focular nodular hyperplasia)。原发性肝癌包括从肝细胞起始的肝细胞癌或肝癌(hcc)；纤维板层hcc；在胆管中发生的肝胆管型肝癌或肝小胆管癌(cc)或胆管癌(肝内或肝外)；在肝血管中起始的血管肉瘤和血管内皮瘤；肝胚细胞瘤(通常在儿童中)；肝细胞和胆管细胞混合癌(chc
‑
cc)或者其他组合。来源于原发性癌的继发性肝癌或肝转移形成了不同于肝脏的器官或组织。在临床实践中，发现多种继发性肝癌的来源为结肠或结肠直肠癌。
[0066]
yap和taz
[0067]
yap1、yes相关蛋白1、yap、yap2或yap65(可互换使用)表示激活细胞增殖基因并且抑制参与细胞凋亡的基因的转录辅因子。它是控制器官尺寸的hippo信号通路的一部分。通过可变剪接产生不同的同工型，从而产生了多个转录本变体(在下文中提供genbank登录号：同工型1：np_001123617.1；同工型2：np_006097.2；同工型3：np_001181973.1；同工型4：np_001181974.1；同工型5：np_001269027.1；同工型6：np_001269026.1；同工型7：np_001269028.1；同工型8：np_001269029.1；同工型9：np_001269030.1)。已报道yap通过共有hx(r/h)xxs基序(seq id no:18)中的丝氨酸残基上的lats
‑
激酶磷酸化；5种这种基序存在于yap2中，包括ser61、ser109、ser127、ser164和ser381(在单一物种中的yap
‑
同工型中或者在不同物种的yap蛋白中，这些丝氨酸残基的相对编号可以不同)。作为单个突变，s127a是最强的组成型激活yap变体，但是所有5个丝氨酸残基的组合突变是最强的组成型激活yap变体(zhao等人2007,genes dev 21:2747
‑
2761；iwasa等人2013,exp cell res 319:931
‑
945)。
[0068]
taz(具有pdz结合基序的转录共激活因子；编码tafazzin蛋白)是yap1的密切横向同源物，并且同样作为不同同工型存在(在下文中提供了genbank登录号：同工型1：np_000107.1；同工型2：np_851828.1；同工型3：np_851829.1；同工型4：np_851830.1)。与yap类似，taz包含共有基序hx(r/h)xxs基序(seq id no:18)(参见，例如，hong&guan 2012,sem cell dev biol 230:785
‑
793中的图1)以及在该已报道的基序中包含丝氨酸残基突变的组成型活性变体(例如，lei等人2008,mol cell biol 28:2426
‑
2436)。
[0069]
激活剂/激活
‑
增强剂/增强
[0070]
增强剂或激活剂是能够激活如本文所述的过程/导致其激活的任何化合物。
[0071]
将yap和/或taz的表达的增强或激活称为在mrna和/或蛋白水平积极影响或提高yap和/或taz的表达的事件。
[0072]
将yap和/或taz的功能的增强或激活称为消极影响或降低yap
‑
和/或taz
‑
蛋白的磷酸化，同时积极影响或提高yap
‑
和/或taz
‑
蛋白的核定位的事件，或者称为另外积极影响或提高yap
‑
和/或taz
‑
蛋白的核定位的事件。
[0073]
在上述内容中，所述增强或激活可以是直接的，这表示yap和/或taz的表达的增强或激活是通过在yap和/或taz基因本身的水平上的事件(基因表达或转录的激活)或者在yap和/或taz mrna水平上的事件(蛋白表达或翻译的激活)；或者表示yap和/或taz的功能的增强或激活是通过在yap和/或taz蛋白本身的水平上的事件(例如，蛋白稳定、翻译后修饰、胞内运输)。在间接增强或激活的情况下，增强或激活信号是直接增强或激活信号的上游事件，但是最终导致直接增强或激活信号——换言之，间接增强或激活通过了不在yap和/或taz基因、mrna或蛋白本身水平上的中间事件，但尽管如此仍导致yap和/或taz基因、mrna或蛋白的增强或激活。
[0074]
基因表达的增强或激活是通过基因治疗方式可实现的并且依赖于其中包括/可操作性地连接了适合的启动子、蛋白编码序列和适合的终止子的遗传构建体。器官特异性或细胞特异性启动子可以添加至通过可操作性连接的编码序列所编码的蛋白的器官特异性或细胞特异性表达。
[0075]
在上述内容中，所述增强或激活可以是瞬时、可诱导的(或者作为另外一种选择，条件性的)，或者可以在诱导后是瞬时的(或者作为另外一种选择，在条件性增强或激活之后是瞬时的)。
[0076]
如将在下文中描述的，可以通过药理学化合物(小分子、有机分子(中)、有机化合物(中)、肽和(聚)蛋白、修饰的肽和(聚)蛋白)或者通过核酸或包含核酸的化合物，或者作为另外一种选择，基因治疗性化合物，或者作为另外一种选择通过基因疗法或核酸疗法(可互换使用)；或者通过药理学化合物和核酸疗法的组合来引发所述增强或激活。由于其逐渐从细胞、器官和/或身体中去除，药理学化合物的单次施用通常导致瞬时效果，并且反映在所述化合物的药物动力学行为中。基于所期望的激活水平，可能需要药理学化合物的两次或更多次(多次)施用。当通过对通常不存在于靶细胞、靶器官或靶身体中的要施用的信号起反应的启动子控制时，通过基因或核酸疗法或者通过基因治疗性(核酸或包含核酸)化合物的激活可以是可诱导的。照此，通过基因或核酸疗法的激活可以是瞬时的(例如，通过从靶细胞、靶器官或靶身体除去要施用的信号)。在核酸或包含核酸的化合物的情况下，一旦在靶细胞、靶器官或靶身体中降解(例如，在未整合到基因组中的情况下)，则所述化合物的作用通常是瞬时的。
[0077]
如本发明中所设想的方法的增强或激活是指不同的可能的激活水平，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者至少100％或大于100％的增强或激活(与正常情况相比)。对于本发明，增强或激活化合物的性质不是至关重要/重要的，只要增强或激活了所设想的方法，从而治疗或抑制肿瘤生长或引起所建立的肿瘤的消退。
pat 28:867
‑
873已总结了有关yap/taz
‑
tead相互作用的小分子抑制剂的专利。这些抑制剂包括如wo2017064277和wo2018185266中所公开的基于双
‑
芳基肼骨架的化合物。作为另外一种选择，这些抑制剂靶向所有4种tead核心处的脂质口袋，这通常被棕榈酰配体占据并且对于tead折叠、稳定性和yap结合是重要的；参见，例如，wo2017/053706。还已报道氟芬那酸或其衍生物，如包含氯甲基酮部分并且结合至tead的脂质口袋中的保守半胱氨酸的衍生物作为yap和/或taz与tead的相互作用的抑制剂(pobbati等人2015,structure23:2076
‑
2086；bum
‑
erdene等人2018,cell chem biol 26:378
‑
389)。作为yap
‑
taz/tead抑制剂，还报道了环状yap样肽(zhang等人2014,acs med chem lett 5,993
‑
998)和模拟vgll4(vestigial样蛋白4)的肽(jiao等人2014,cancer cell 25:166
‑
180)。已报道达沙替尼、抑制素和帕唑帕尼抑制核定位和yap和taz的靶标基因表达，并因此是其他类型的yap和/或taz抑制剂(oku等人2015,febs open bio 5:542
‑
549)。通过基因疗法(例如，通过施用yap和/或taz的sirna、shrna或反义寡核苷酸)或者通过施用yap和/或taz的药理学抑制剂(例如，抗体)，下调过表达的yap
‑
和/或taz
‑
表达同样是可行的。这将在本文中进一步更详细地描述。通过基因疗法，例如，通过lats1
‑
和/或lats2
‑
表达的上调，或者通过tead因子表达的下调，yap和/或taz表达和/或功能的抑制剂的表达的上调也是可行的(参见背景部分)。
[0084]
肝再生
[0085]
在健康状况下，肝细胞是相对休眠的。因此，将肝再生的激活称为积极影响或提高肝细胞增殖的事件。几种因素可以引发或有助于肝细胞增殖(通过tao等人2017,mediators inflammation,论文id 4256352综述)。
[0086]
肝再生的诱导是临床相关过程(forbes&newsome 2016,nature genetics 13:473
‑
485)并且对其理解的工作在本发明的背景中是适用的。在药理学上，可以通过(例如)三碘甲状腺氨酸(t3)的施用来诱导肝再生。forbes等人1998(gene ther 5:552
‑
555)在使肝细胞对于基于反转录病毒的整合基因转移(需要复制细胞)可接受的背景中应用了这种方法。随后报道t3的施用具有抑制新肿瘤发生(neocarcinogenesis)的优势，所述新肿瘤发生是延长肝再生诱导的可能的副作用(perra等人2009,hepatology 49:1287
‑
1296)。还假设肝再生过快可能导致产生在结构上组织破坏的组织。将控制肝再生速率，具体地减缓该速率提议为避免这些不希望的影响的方式。将erk1/2抑制剂和选择性mek抑制剂应用于这种作用(ninomiya等人2010,am j transplant 10:1580
‑
1587)。可以通过施用氯沙坦来抑制潜在地与快速肝再生有关的纤维化(colmenero等人2009,am j physiol gastrointest liver physiol 297:g726
‑
g734)。
[0087]
还已报道胆汁酸水平的升高刺激肝再生。在小鼠中，饲喂5天0.2％的胆酸在无毒性作用的情况下导致肝脏尺寸增大30％。据认为胆汁酸是负责在健康动物中导致肝细胞增殖的可溶性循环信号(之一)，这可能(parabiotically)与经受部分肝切除术的动物有关(huang等人2006,science 312:233
‑
236)。通过核胆汁酸受体fxr(法尼酯x受体)感知胆汁酸，并且fxr或stat3的过表达保护避免后续肝损伤(meng等人2010,mol endocrinol 24:886
‑
897)。
[0088]
需要存在足够水平的巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf/csf1)，并因此足够水平的m
‑
csf
‑
诱导的库柏法细胞(肝组织巨吞噬细胞)以支持肝再生。这些库柏法细胞似乎是引发肝再生所需的il
‑
6的来源(amemiya等人2011,j surg res 165:59
‑
67；tao等人2017,
mediators inflammation:4256352)。在急性肝功能衰竭的情况下，csf1的血清水平是患者存活的预后标志物，其可能与肝巨噬细胞的免疫功能有关(stutchfield等人2015,gastroenterology 149:1896
‑
1909)。
[0089]
类似地，β
‑
连环蛋白水平需要足够高以支持肝再生，至少在受损的肝脏中(apte等人2009,am j pathol 175:1056
‑
1065)。
[0090]
还已报道粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)有助于肝再生，至少在受损的肝脏中，并且可能不会导致纤维化(yannaki等人2005,exp hematol33:108
‑
119；garg等人2012,gastroenterology 142:505
‑
512)。
[0091]
最终，阻断rage(晚期糖基化终产物的受体)，例如，通过施用可溶性rage(srage)还可以有助于有效的肝再生(zeng等人2004,hepatology 39:422
‑
432)。
[0092]
可以通过以下方法抵消肝细胞增殖激活的不希望的作用，例如，通过施用减缓增殖速率的化合物(如(例如)细胞周期抑制剂，如小分子、肽或核酸；例如，dickson&schwartz 2009,current oncol 16:36
‑
43；peyressatre等人2015,cancers 7:179
‑
237；jin等人1995,cancer res 55:3250
‑
3253；或者如cdk4
‑
6(细胞周期依赖性激酶)的抑制剂，如pd 0332991(flaherty等人2012,clin cancer res 18:568
‑
576)或者瑞博西尼(ribociclib)或帕博西尼(palbociclib))或者施用抗纤维化化合物(参见，例如rosenbloom等人2013,biochem biophys acta 1832:1088
‑
1103)。通常，肝细胞增殖的激活受时间限制。所述时间应足以使预期治疗效果(肝癌的治疗或抑制，或者肝癌发展的抑制，其中所述肝癌是原发性肝癌或从来自其他癌症的转移中产生的肝癌)发生，在此之后激活的增殖应逐渐消退/关闭/失活以返回正常，即使增殖肝细胞回到它们的休眠或近休眠状态。后者对预防持续肝细胞增殖的潜在副作用(肝脏过大，肝癌发生概率提高)是重要的。
[0093]
肝脏靶向
[0094]
肝脏中或肝肿瘤附近(瘤周)的局部药物施用是可行的，如通过使用(例如)允许重复施用的微创导管。此外，高压递送有利于肝细胞吸收。对药理学化合物或基因治疗性化合物赋予肝细胞靶向性质可以使这种化合物能够外周和/或全身施用。
[0095]
已对化合物和肝细胞特异性基因疗法的肝细胞靶向递送进行了大量工作。这已通过kang等人2016(crit rev biotechnol 36:132
‑
143)和poelstra等人2012(j controlled rel 161:188
‑
197)进行了总结。该工作的大部分与肝纤维化、肝硬化、肝炎和hcc的治疗有关。所产生的问题涉及肝脏靶向策略对患病细胞的潜在相对不良选择性。在本发明的框架中，由于靶向健康肝细胞的事实，预计这些问题是不太关心的。
[0096]
不再重复kang等人2016(crit rev biotechnol 36:132
‑
143)或poelstra等人2012(j controlled rel 161:188
‑
197)的全部工作，已设计了策略来靶向肝细胞、库柏法细胞、肝窦内皮细胞和肝星形细胞(例如，kang等人2016的表1)。通过靶向甘露糖/n
‑
乙酰葡萄糖胺受体，例如，可以将化合物递送至肝细胞、库柏法细胞和肝窦内皮细胞。通过使用(重组)乙型肝炎病毒前
‑
s1蛋白或者前
‑
s1来源的肽，例如，或者通过(重组)乙型肝炎病毒l蛋白纳米胶囊(可能具有一个或多个半胱氨酸对另一种氨基酸的替换)(nagaoka等人2007,j control rel 118:348
‑
356)，可以使化合物靶向肝细胞。
[0097]
例如，n
‑
乙酰葡萄糖胺缀合的蜂毒素样肽与胆固醇缀合的sirna一起的共注射导致了靶标基因的有效敲低(wooddell等人2013,mol ther 21:973
‑
985)。还已应用了反义寡
核苷酸(在脂质体(lipofectin)中配置)以降低肝细胞中的基因表达(例如，zhang等人2000,nat biotechnol 18:862
‑
867；zhang等人2003,j pharmacol exp ther 307:24
‑
33)。在peg化的干扰素α
‑
2b(peg
‑
内含子)的情况下使用了被动靶向，其中peg化导致循环延长，从而导致肝细胞的吸收延长(在poelstra等人2012,jcontrolled rel 161:188
‑
197中综述)。例如，在pathak等人2008的表1中提供了设计以将基因特异性递送至肝细胞(并且通常包括阳离子聚合物，如聚亚乙基亚胺、聚烯丙基胺、聚
‑
l
‑
赖氨酸或壳聚糖)的纳米载体、脂质体复合物、脂质体或多聚复合物(polyplexes)的长列表(int j nanomed 3:31
‑
49)。
[0098]
肝细胞溶酶体内的降解可以阻碍肝细胞中的非病毒基因递送。据报道在非病毒基因递送试剂中包含融合肽(作为溶酶体破坏元件)提高了这种施用方式的效率。另一方面，据报道纳米颗粒(如plga的纳米颗粒)从溶酶体中逸出(在pathak等人2008,int j nanomed 3:31
‑
49)。
[0099]
已表明腺病毒相关病毒(aav；具体地无肠aav)，如aav2和aav8适合于将遗传信息或基因治疗性化合物运输到肝细胞中。aav8对肝脏更强的趋向性(此外，与aav2相比，在人中具有较低的血清阳性率)使得能够外周施用基因治疗性化合物(如本文中的实施例中所使用的)。与单链aav表达盒相比，使用在aav中作为互补二聚体(自补)包装的基因表达盒观察到更高的基因表达(nathwani等人2011,n engl j med 365:2357
‑
2365)。aav是非整合载体，并因此与转染细胞的更新一起消失。尽管正常肝细胞是休眠的，本发明在一个方面设想提高它们的复制(再生反应)，因此导致了通过aav
‑
转染递送的转基因的稀释，因此降低了其整体影响并有助于瞬时转基因表达。
[0100]
还可以或另外通过使用肝特异性基因启动子获得基因治疗性化合物表达的肝特异性。肝特异性aat
‑
脱脂蛋白e(apoe)启动子(haat启动子和人apo e增强子或其衍生物的4个拷贝；haat＝人α1抗胰蛋白酶)是一个这种实例(van linthout等人2002,hum gene ther 13:829
‑
840)。其他所报道的肝特异性启动子是包含偶联至人甲状腺素结合球蛋白(tbg)的核心启动子的α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子的两个拷贝的启动子，和包含与鼠科甲状腺素运载蛋白启动子连接的随机组装的肝细胞特异性转录因子结合位点的启动子(在kattenhorn等人2016,hum gene ther 27:947
‑
961中综述)。
[0101]
例如，通过使用tet
‑
依赖性表达，递送至肝细胞的转基因的表达的调控是可行的(仍如在如下文中所述的实施例中所使用的)。例如，这在施用于肝细胞的慢病毒载体中应用(这种载体可以在分裂或非分裂细胞两者中稳定整合)(vigna等人2005,mol ther 11:763
‑
775)。
[0102]
除aav和慢病毒之外，已在肝基因疗法中应用了反转录病毒(例如，hiv)、日本血球凝集病毒(hvj)和乙型肝炎病毒颗粒。修饰包括(例如)用仙台病毒融合蛋白f伪型的hiv载体和hvj与阳离子脂质体的融合以达到病毒体(在poelstra等人2012,j controlled rel 161:188
‑
197中综述)。nguyen and ferry 2004(gene ther 11:s76
‑
s84)已综述了用于向肝细胞体内和离体转移的腺病毒载体、aav载体、慢病毒载体和鼠科白血病反转录病毒载体，以及肝细胞移植(可能在离体基因转移之后)。
[0103]
可以将肝脏靶向应用于本文所设想的方法的激活剂，具体地肝再生激活剂和yap
‑
和/或taz的表达和/或功能的激活剂。在如下文所列的实施例中使用了aav8载体和apoe
‑
和tbg
‑
启动子。
[0104]
核酸或基因疗法
[0105]
对基于核酸的疗法的关心程度逐年提高。基于(病毒)dna的疗法的关键在于载体中转录信号的存在，其使得能够在靶细胞中产生可翻译的mrna。考虑到有关基于dna和基于载体的疗法的安全性问题，编码用于疫苗接种的可翻译的(m)rna的抗原的使用获得了吸引力。与病毒载体或质粒dna相比，基于(m)rna的疗法具有几个优势。在缺少在宿主基因组中整合的能力中，据认为这更安全(无偶然突变，并且编码蛋白的瞬时表达导致了受控的抗原暴露和最小耐受性诱导)。不需要潜在外源序列，如质粒主链或病毒启动子，从而降低了产生免疫应答时的风险。此外，它提供了缓慢转染非分裂细胞的可能性，因为rna不需要穿过用于蛋白表达的核屏障。在本文中设想了所有导致靶标蛋白的瞬时，或者替代的可诱导的表达，或者导致其他替代的可诱导的瞬时表达和/或核酸向肿瘤、癌症或赘生物的靶向递送的改进。直接胞内或器官内递送代表了靶向递送的其他方法。
[0106]
施用核酸的方法包括应用非病毒(dna或rna)或病毒核酸(dna或rna病毒载体)的方法。非病毒基因疗法的方法包括裸dna(环状或线性)的注射、电穿孔、基因枪、超声穿孔、磁转染、寡核苷酸、脂质体复合物(例如，核酸与dotap或dope的复合物或它们的组合，与其他阳离子脂质的复合物)、树枝状聚合物、病毒样颗粒、无机纳米颗粒、高压递送、光化学内化的使用(berg等人2010,methods mol biol 635:133
‑
145)或它们的组合。
[0107]
已在人核酸疗法试验中使用了多种不同载体并且列表可见于http://www.abedia.com/wiley/vectors.php。目前，主要的组为腺病毒或腺病毒相关病毒载体(分别在约21％和7％的临床试验中)、反转录病毒载体(约19％的临床试验)、裸或质粒dna(约17％的临床试验)和慢病毒载体(约6％的临床试验)。组合也是可能的，例如，仅列出其中一些，与腺病毒组合的裸或质粒dna或者与裸或质粒dna组合的rna。在核酸疗法中使用了其他病毒(例如，辛德毕斯病毒)并且在本发明的上下文中不排除其他病毒。
[0108]
可以通过核酸(例如)在脂质体(脂质体复合物)或者聚合物囊泡(脂质体的合成变体)中，作为多聚复合物(与聚合物复合的核酸)、在树枝状聚合物上携带的，在无机(纳米)颗粒(例如，在磁转染的情况下含有氧化铁)中或者与细胞穿透肽(cpp)组合的特殊制剂辅助施用以提高细胞吸收。器官
‑
或细胞靶向策略还可以应用于核酸(与器官
‑
或细胞靶向部分组合的核酸)；这些包括被动靶向(大部分通过改进的制剂实现)或主动靶向(例如，通过将包含核酸的纳米颗粒与结合至靶器官特异性或细胞特异性抗原的任何化合物(例如，适体、抗体或其片段、抗原结合分子、单体、affitin、抗运载蛋白、darpins、阿尔法体、单域抗体或其片段)偶联)(例如，steichen等人2013,eur j pharm sci 48:416
‑
427)。
[0109]
cpps使得与它们偶联的所关心的药物能够跨膜易位。作为另外一种选择，将cpp称为蛋白转导域(ptd)，其通常包含30个或以下(例如，5至30或者5至20)个氨基酸，并且通常富含碱性残基，并且来源于天然存在的cpp(通常大于20个氨基酸)或者是建模或设计的结果。cpp的非限制性选择包括tat肽(来源于hiv
‑
1tat蛋白)、穿透肽(来源于果蝇触角足(drosophila antennapedia)
‑
antp)、pvec(来源于鼠科血管内皮钙粘素)、信号
‑
序列基肽或膜移位序列、模型两亲肽(map)、转运肽(transportan)、mpg、聚精氨酸；有关这些肽的更多信息可见于torchilin 2008(adv drug deliv rev 60:548
‑
558)和其中引用参考文献。cpp可以偶联至载体，如纳米颗粒、脂质体、胶束或通常任何疏水性颗粒。偶联可以通过吸收或化学键合，如通过cpp和载体之间的间隔臂。为了提高靶标特异性，可以将结合至靶标特
异性抗原的抗体(或者其他试剂；参见上文)进一步偶联至载体(torchilin 2008,adv drug deliv rev 60:548
‑
558)。cpp已用于递送细胞内部多样的有效负荷，如质粒dna、寡核苷酸、sirna、肽核酸(pna)、蛋白和肽、小分子和纳米颗粒(stalmans等人2013,plos one 8:e71752)。
[0110]
同样设想了在如本文所列的核酸或者包含核酸的化合物的应用的背景中有用的提高核酸疗法效力的dna或rna的任何其他修饰。提高的效力可以在于提高的表达，提高的递送性质，提高的稳定性等。因此，如本文所列的核酸或包含核酸的化合物的应用可以依赖于使用如上所述的或者如以下部分中所述的修饰的核酸。
[0111]
低炎性核酸
[0112]
例如，腺病毒核酸疗法的已知问题是其对炎症反应的引发。作为另外一种选择，较低炎性(低炎性)的辅助病毒依赖型或无肠腺病毒载体可以用作核酸疗法的低炎性腺病毒载体。其他方案包括病毒壳体蛋白(例如，通过peg化)的共价修饰，修饰腺病毒尾丝结(组成)、载体在聚合物中的包封和/或切换或恢复为非人腺病毒载体的血清型(例如，ahi等人2011,curr gene ther 11:307
‑
320)。
[0113]
裸dna核酸疗法同样可以引起炎性反应。据报道从中除去细菌主链序列的线性dna的炎性(低炎性)低于包含细菌主链序列的线性dna并且其炎性低于环状dna(zhu等人2009,biomed pharmacother 63:129
‑
135)。降低未甲基化的cpg基序的量或者阳离子脂质体，然后裸质粒dna的后续注射是实现低炎性dna疗法的其他替代选择(niidome&huang 2002,gene therapy 9:1647
‑
1652)。
[0114]
在基于rna的表达构建体的情况下，还据报道它们可以诱导炎性免疫应答，其可以改善它们的效力。kariko等人2005(immunity 23:165
‑
175)确认与接近未修饰的rna(真核或其他)相比，修饰至极大修饰的真核rna不是免疫刺激性的。另一方面，缺少多聚(a)
‑
尾的mrna也是免疫刺激性(即使来自真核来源)。这导致了以下建议：在治疗性rna中包括天然存在的修饰的核苷(存在大于100个，列表可得自http://mods.rna.albany.edu/mods/)，如5
‑
甲基胞苷和假尿嘧啶核苷(pollard等人2013mol ther 21:251
‑
259)。如本文所提及的低炎性rna是通过包括天然存在的修饰的核苷所构建的异源rna以最大程度降低潜在的炎性反应，其中所述修饰的核苷优选地对其中将施用异源低炎性rna的物种的rna是唯一的并且在所述rna中经常使用。
[0115]
表达或功能的调节
[0116]
调节所关心的基因的表达的一种方法在于反义寡核苷酸(aso)或其变体，如间隙体(gapmer)。反义寡核苷酸(aso)是通过沃森
‑
克里克碱基配对以序列特异性方式与互补mrna杂交的核苷酸和/或核苷酸类似物的短链。aso
‑
mrna复合物的形成最终导致靶标蛋白表达的下调。基于靶标序列，aso可以以不同方式起作用。如果通过细胞内吞作用吸收aso并且aso在细胞质中与靶标mrna杂交，则aso
‑
mrna复合物的形成可以引起rna酶h的激活(所结合的mrna的选择性降解)或者可以空间干扰核糖体组装。在aso可以进入核的情况下，可以通过5'帽形成的抑制、mrna剪接的抑制或者rna酶h的激活来调节mrna成熟(chan等人2006,clin exp pharmacol physiol 33:533
‑
540；该参考文献还描述了可用于辅助aso设计的一些软件)。可以在一个或多个水平引入aso的修饰：磷酸酯键修饰(例如，一个或多个磷酸二酯、磷酰胺脂或硫代磷酸酯键的引入)、糖修饰(例如，引入一个或多个lna(锁核酸)、2'
‑
o
‑
甲基、2'
‑
o
‑
甲氧基
‑
乙基、2'
‑
氟代、s
‑
约束的乙基或三环
‑
dna)和/或非核糖修饰(例如，一个或多个磷二酰胺吗啉基化合物或肽核酸)。2'
‑
修饰的引入已显示提高了反义寡核苷酸的安全性和药理学性质。依赖于通过rna酶h的mrna降解的反义策略需要具有游离2'
‑
氧的核苷酸的存在，即所述反义分子中并非所有的核苷酸应被2'
‑
修饰。为此，已发展了间隙体(gapmer)策略。间隙体(gapmer)反义寡核苷酸由中央dna区(通常最少7或8个核苷酸)以及侧接所述中央dna区两端的(通常2或3个)2'
‑
修饰的核苷组成。这对于抵抗核酸外切酶的保护是充分的，同时允许rna酶h作用于(无2'
‑
修饰的)间隙区。解毒策略是可用的，如通过与反义寡核苷酸完全互补的寡核苷酸的施用所证明的(crosby等人2015,nucleic acid ther 25:297
‑
305)。
[0117]
调节所关心的基因的表达的另一种方法基于rna干扰的天然过程。它依赖于通过被称为dicer的酶所切割的双链rna(dsrna)，从而导致产生了20
‑
25个核苷酸长的双链小干扰rna(sirna)分子。然后，sirna结合至细胞rna诱导的沉默复合体(risc)，从而将两条链分离成随从链和引导链。当随从链降解时，risc在通过引导链所指示的位点特异性切割mrna。mrna的破坏防止所关心的蛋白的产生并且该基因“沉默”。sirna是具有2nt 3'末端悬突的dsrna，而shrna是含有加工成sirna的环结构的dsrna。使用任选地可以稳定地整合到基因组中的载体(例如，细菌或病毒)将shrna引入靶细胞的核中。除了检查缺少与非靶标基因的交叉反应性外，rnai产品的厂商提供了设计sirna/shrna的指南。19
‑
29nt之间的sirna序列通常是最有效的。大于30nt的序列可以导致非特异性沉默。理想的靶标位点包括aa二核苷酸和靶标mrna序列中它们的19nt的3'端。通常，具有3'dudu或dtdt二核苷酸悬突的sirna是更有效的。其他二核苷酸悬突可以维持活性，但是应避免gg悬突。还应避免具有4
‑
6个聚(t)簇(poly(t)tract)(起rna pol iii的终止信号的作用)的sirna设计，并且建议g/c含量在35
‑
55％之间。shrna应包含通过环结构分隔的正义和反义序列(建议长度分别为19
‑
21nt)和3'aaaa悬突。建议有效的环结构为3
‑
9nt长。建议在设计shrna盒时应按照正义
‑
环
‑
反义顺序，并且在shrna构建体中避免5'悬突。shrna通常转录自载体，例如，通过pol iii u6启动子或者hi启动子驱动。载体允许诱导型shrna表达，例如，依赖可商购的tet
‑
开(tet
‑
on)和tet
‑
关(tet
‑
off)诱导系统，或者依赖通过昆虫激素蜕皮激素诱导的修饰的u6启动子。cre
‑
lox重组系统已用于实现小鼠中的控制表达。合成shrna可以是化学修饰的以实现它们的活性和稳定性。可以通过转染(脂质转染、基于阳离子聚合物的纳米颗粒、脂质或细胞穿膜肽缀合)或者电穿孔将质粒dna或dsrna递送至细胞。病毒载体包括慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。
[0118]
核酶(核糖核酸酶)是可以用于调节靶标基因表达的另一种类型的分子。它们是能够催化特异性生化反应的rna分子，在本发明的背景中，能够使核苷酸序列靶向切割的rna分子。核酶的实例包括锤头状核酶、varkud卫星核酶、leadzyme和发夹状核酶。除抑制性rna技术的使用之外，可以在dna水平实现所关心的基因的表达的调节，如通过基因疗法敲除或破坏靶标基因。如本文所使用的，“基因敲除”可以是基因敲低或者可以通过突变敲除基因，如点突变、插入、缺失、移码或错义突变，所述突变通过如下文所述的技术进行，其包括(但不限于)反转录病毒基因转移。其中可以敲除基因的另一种方法是通过锌指核酸酶的使用。锌
‑
指核酸酶(zfn)是通过锌指dna结合域与dna
‑
切割域的融合所产生的人工限制性内切酶。可以将锌指域工程化设计以靶向所期望的dna序列，这使得锌
‑
指核酸酶能够靶向复杂
基因组内的独特序列。通过利用内源dna修复机制，这些试剂可以用于准确改变高等生物的基因组。
[0119]
可以用于敲除基因的用于基因组定制的其他技术是大范围核酸酶和tal效应因子核酸酶(talens,cellectis bioresearch)。由融合至引入双链断裂(dsb)的核酸内切酶的催化域的用于序列特异性识别的tale dna结合域组成。的dna结合域能够以高精度靶向大识别位点(例如17bp)。大范围核酸酶是序列特异性核酸内切酶，是天然存在的“dna剪刀”，其来源于多种单细胞生物，如细菌、酵母、藻类和一些植物细胞器。大范围核酸酶具有12至30个碱基对之间的长识别位点。可以修饰天然大范围核酸酶的识别位点以靶向天然基因组dna序列(如内源基因)。近期另一种基因组编辑技术是crispr/cas系统，其可以用于实现rna
‑
引导的基因组工程。crispr干扰是允许在原核和真核细胞中序列特异性控制基因表达的遗传技术。它基于细菌免疫系统
‑
来源的crispr(规律成簇间隔短回文重复序列)途径。最近，已证实crispr
‑
cas编辑系统还可以用于靶向rna。已表明2类vl
‑
a型crispr
‑
cas效应因子c2c2可以编程以切割具有互补前间隔序列的单链rna靶标(abudayyeh等人2016science353/science.aaf5573)。c2c2是一旦由单一crrna向导引导至靶rna，介导ssrna切割的单一效应因子内切rna酶。
[0120]
可以通过(例如)与所关心的蛋白结合的结合部分实现对结构的干扰，这可以导致功能的抑制或激活。非限制性实例为(单克隆)抗体或其抗原结合片段、α
‑
体、纳米抗体、胞内抗体(结合至胞内靶标和/或对胞内靶标起作用的抗体；这通常需要抗体在靶细胞内的表达，这可以通过基因疗法实现)、适体、darpins、亲和体(affibody)、affitin、抗运载蛋白、单体、磷酸酶(在磷酸化靶标的情况下)和激酶(在可磷酸化靶标的情况下)。
[0121]
如本文所使用的术语“抗体”是指抗体或抗原结合蛋白的任何天然存在的形式，它们的产生是通过免疫系统(免疫球蛋白或igg)诱导的。然而，显然并非所有抗体是天然存在的，因为(例如)在一些抗原的免疫原性较差或完全没有免疫原性，或者不能被免疫系统识别(例如，自体抗原)的意义上，一些抗原是成问题的；可能需要人工技巧(artificial tricks)来获得这些抗原的抗体(例如，敲除小鼠：例如，declercq等人1995,j biol chem 270:8397
‑
8400；例如，跨膜抗原的dna免疫；例如，liu等人2016,emerg microbes infect 5:e33)。“常规”抗体包含通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链，每一条轻链通过二硫键连接至每一条重链。每一条重链在一端具有可变域(vh)，然后是几个恒定域(基于抗体种类，3或4个恒定域，ch1、ch2、ch3和ch4)。每条轻链在一端具有可变域(vl)并且在其另一端具有恒定域(cl)；轻链恒定域分别与重链第一恒定域对齐，并且轻链可变域分别与重链可变域对齐。这类抗体与仅由两条重链组成的“非常规”天然存在的类型的抗体一起存在于骆驼、单峰驼和美洲驼中，并因此缺少轻链。其他“非常规”天然存在的抗体存在于铰口鲨(绞口鲨科(ginglymostomatidae))和须鲨(须鲨科(orectolobidae))的血清中。这后一种抗体被称为ig新型抗原受体(ignar)。它们是由5个恒定域(cnar)和1个可变域(vnar)组成的二硫键合的同型二聚体。不存在轻链，并且单个可变域在溶液中是独立的并且似乎不跨过疏水界面结合(greenberg等人1995,nature 374:168
‑
173；nuttall等人2001,mol immunol 38:313
‑
326；diaz等人2002,immunogenetics 54:501
‑
512；nuttall等人2003,eur j biochem 270:3543
‑
3554)。由于骆驼科和鲨鱼抗体的重链二聚体结构特征，有时将这些
称为“重链微型抗体”(mnhcab)或者简称为“微型抗体”(mnab)(holliger&hudson 2005,nature biotechnol 23:1126
‑
1136)。骆驼抗体和鲨鱼抗体的互补决定区3(cdr3)(分别包含约16
‑
21个氨基酸和约16
‑
27个氨基酸)通常比小鼠vh区的cdr3(包含约9个氨基酸)长(muyldermans等人1994,prot eng 7:1129
‑
1135；dooley&flajnik 2005,eur j immunol 35:936
‑
945)。在没有轻链的情况下，这些重链抗体通过一个单域，称为vab(骆驼科抗体)或v
‑
nar(鲨鱼抗体)的重链免疫球蛋白的可变抗原结合域结合至它们的抗原。将这些最小的完整且独立功能性抗原结合片段vab称为纳米抗体(nano
‑
antibody)或者纳米抗体(nanobody)(muyldermans 2001,j biotechnol 74:277
‑
302)。在一些情况下，由于它们潜在更高的细胞吸收和保留，多价(二价、三价、四价和五价等)vab和/或v
‑
nar域可以是优选的，并且可以通过重组技术或通过化学方法，如wo 2010/033913中所述制备。轻链和/或重链的可变域直接参与抗体与抗原的结合。天然存在的轻链和重链的可变域具有相同的一般结构：通过3个互补决定区(cdr)连接的4个框架区(fr)(参见，例如，kabat等人1991,sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md)。轻链或重链中的cdr通过fr保持紧邻并且有助于抗原结合位点的形成。如下文所述的抗体或抗体片段还可以是多价和/或多重特异性抗原结合分子的一部分。在brinkmann&kontermann 2017(mabs 9:182
‑
212)中提供了(例如)可用的双重特异性形式(约100种)的综述。术语“抗体片段”是指包含抗体(亲代抗体)的一个或多个片段(通常一个或多个cdr)，从而使其结合至亲代抗体所结合的相同抗原的任何分子。抗体片段包括fv、fab、fab'、fab'
‑
sh、单链抗体分子(如scfv)、f(ab')2、单个可变vh域和单个可变vl域(holliger&hudson 2005,nature biotechnol 23:1126
‑
1136)、vab和v
‑
nar。该术语还包括微抗体，即通常仅包含一个cdr的亲代抗体的最小识别单元(heap等人2005,j gen virol 86:1791
‑
1800)。可以将任何片段引入多价和/或多重特异性大分子，例如，单特异性或双重特异性fab 2、单特异性或三重特异性fab 3、双
‑
scfv(单特异性或双重特异性)、双链抗体(单特异性或双重特异性)、三链抗体(例如，三价单特异性)、四链抗体(例如，四价单特异性)、微抗体等(holliger&hudson 2005,nature biotechnol 23:1126
‑
1136)。还可以将任何片段引入(例如)鲨鱼抗体的v
‑
nar域或者骆驼科抗体的vhh域(纳米抗体)。在术语“抗体片段”中包括所有这些。
[0122]
阿尔法体也称为细胞
‑
渗透阿尔法体并且是工程化以结合至多种抗原的10kda小蛋白。
[0123]
已相对于小分子、毒素、肽、蛋白、病毒、细菌并且甚至对于完整细胞选自了适体。dna/rna/xna适体是单链的并且通常为约15
‑
60个核苷酸长，尽管已选择了220nt的更长的序列；它们可以含有如对于反义rna所述的非天然核苷酸(xna)。fda已批准结合至血管内皮生长因子(vegf)的核苷酸适体用于治疗黄斑变性。rna适体的变体为镜像适体，并且其完全由非天然l
‑
核糖核酸主链组成。除它结合至其靶标分子的镜象之外，具有相同序列的镜像适体具有与相应rna适体相同的结合性质。肽适体由一个(或多个)短可变肽域组成，其在两端附接至蛋白骨架，例如，基于胱抑素蛋白折叠的粘合素骨架。例如，在wo 2004/077062中描述了其他变化，例如，2个肽环附接至有机骨架。例如，在wo 2009/098450中已证明这些肽的噬箘体
‑
展示筛选是可能的。
[0124]
darpins代表设计的锚蛋白重复蛋白。已在dna水平上产生了具有随机化潜在靶标
相互作用残基，具有超过10^12个变体的多样性的darpins文库。由此，可以选择darpins，从而以皮摩尔亲合力和特异性结合至所选靶标。
[0125]
affitin或nanofitin是在结构上来源于在嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)中发现的dna结合蛋白sac7d的人造蛋白质。通过使氨基酸在sac7d的结合表面上随机化并且对所产生的蛋白文库进行数轮核糖体展示，则亲合力可以针对多个靶标，如肽、蛋白、病毒和细菌。
[0126]
抗运载蛋白来源于人脂质运载蛋白，它是天然结合蛋白家族，并且结合位点处的氨基酸突变使得能够改变对所关心的靶标的亲合力和选择性。它们的组织渗透性优于抗体，并且在高达70℃的温度下稳定。
[0127]
单体是作为分子骨架从纤连蛋白iii型域(fn3)开始构建的合成结合蛋白。
[0128]
基于上述内容，可以应用选自反义寡核苷酸、间隙体(gapmer)、sirna、shrna、反义寡核苷酸、锌指核酸酶、大范围核酸酶、tal效应因子核酸酶、crispr
‑
cas效应因子、抗体或其片段(结合至与全长抗体相同的抗原)、α
‑
体、纳米抗体、胞内抗体、适体、darpins、亲和体(affibody)、affitin、抗运载蛋白和单体的分子以激活如在本发明的背景中所设想的过程，更具体地在肝再生激活中或者在yap和/或taz的表达和/或功能的激活中应用。
[0129]
在上述内容中，所述分子对它们的预期靶标特异，将其称为以下事实：所述分子在预期靶标的水平上起作用并且不在不同于所述预期靶标的靶标的水平上起作用。可以通过(例如)确定分子与它们的预期靶标的物理相互作用来确定特异性。
[0130]
组合疗法
[0131]
本发明的治疗方式(它是药理学化合物、核酸或包含核酸的化合物)可以在组合疗法中与一种或多种其他抗肿瘤、抗癌或抗瘤疗法组合(同时或以任何顺序；在任何治疗方案中)。下文中列出了几种类型的抗肿瘤、抗癌或抗瘤疗法。然而，显然这些列表无一表示穷举并且仅出于说明性目的包括。
[0132]
如上文所提及的，本发明的治疗方式的施用可以(例如)在所述肿瘤、癌症或赘生物的手术去除(肿瘤、癌症或赘生物块消蚀)时发生，尽管可以优选地在手术去除前实施本发明的治疗方式的施用，从而为要发展的本发明的治疗方式的治疗潜能提供足够的时间和/或足够的(残留的)肿瘤、癌症或赘生物细胞。在多种(如果不是全部)情况下，采集肿瘤、癌症或赘生物的活组织检查；由于该程序提供了对肿瘤、癌症或赘生物的接近，因此可以在该时间点施用本发明的治疗方式。还可以设想本发明的治疗方式的施用与放射疗法或化疗的组合。
[0133]
不作为穷举，抗肿瘤、抗癌或抗瘤剂包括烷化剂(氮芥类：美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺；亚硝基脲；烷基磺酸盐；二甲亚胺；三氮烯；甲基肼；铂配位络合物：顺铂、卡铂、奥沙利铂)、抗代谢物(叶酸拮抗剂：甲氨蝶呤；嘌呤拮抗剂；抗嘧啶类：5
‑
氟尿嘧啶、阿糖孢苷)、天然植物产物(长春花生物碱：长春新碱、长春碱；紫杉烷：紫杉醇、多西他赛；表鬼臼毒素：依托泊苷；喜树碱：伊立替康)、天然微生物产物(抗生素：多柔比星、博来霉素；酶：l
‑
天冬酰胺酶)，激素和拮抗剂(皮质类固醇：泼尼松、地塞米松；雌激素：乙炔雌二醇；抗雌激素药：他莫昔芬；激孕甾酮衍生物：甲地孕酮；雄激素：丙酸睾酮；抗雄激素：氟他胺、比卡鲁胺；芳香酶抑制剂：来曲唑、阿那曲唑；5
‑
α还原酶抑制剂：非那雄胺；gnrh类似物：亮脯利特、布舍瑞林；生长激素、高血糖素和胰岛素抑制剂：奥曲肽)。其他抗瘤或抗肿瘤剂包括羟基脲、伊马
替尼甲磺酸盐、表柔比星、硼替佐米、唑来膦酸、吉非替尼、亚叶酸、帕米膦酸和吉西他滨。
[0134]
不作为穷举，抗肿瘤、抗癌或抗瘤抗体(抗体疗法)包括利妥昔单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗替坦(tiuxetan)、托西莫单抗、本妥昔单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑珠单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、培妥莫单抗、奥戈伏单抗、明瑞莫单抗(minretumomab)、法利珠单抗(farletuzumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、马帕木单抗、地诺单抗和西罗珠单抗(sibrotuzumab)。
[0135]
设计了抗肿瘤、抗癌或抗瘤剂的具体种类以刺激免疫系统(免疫检查点或其他免疫刺激疗法)。这些包括所谓的免疫检查点抑制剂或共抑制受体抑制剂并且包括pd
‑
1(程序细胞死亡11)抑制剂(例如，派姆单抗、纳武单抗、皮地利珠单抗(pidilizumab))、pd
‑
l1(程序细胞死亡11配体)抑制剂(例如，阿特珠单抗、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗)、ctla
‑
4(细胞毒t
‑
淋巴细胞相关蛋白4；cd152)抑制剂(例如，普利木单抗、替西木单抗(tremelimumab))(例如，sharon等人2014,chin j cane 33:434
‑
444)。pd
‑
1和ctla
‑
4是在t细胞上表达的共受体的免疫球蛋白超家族成员。作为抗肿瘤、抗癌或抗瘤剂进行评价的其他共抑制受体的抑制包括lag
‑
3抑制剂(淋巴细胞激活基因3)、tim
‑
3(t细胞免疫球蛋白3)和tigit(t细胞免疫球蛋白和itm域)(anderson等人2016,immunity 44:989
‑
1004)。还对于抗肿瘤、抗癌或抗瘤疗法评价了在t细胞上表达的共受体tnfr超家族成员的刺激，如4
‑
1bb(cd137)、ox40(cd134)或者gitr(糖皮质激素
‑
诱导的tnf受体家族相关基因)的刺激(peggs等人2009,clin exp immunol 157:9
‑
19)。
[0136]
其他抗肿瘤、抗癌或抗瘤剂包括免疫
‑
刺激剂，如
‑
或新表位癌症疫苗(新抗原或新表位疫苗接种；基于患者的测序数据以找到肿瘤特异性突变，因此导致产生了一种个性化免疫疗法形式；kaiser 2017,science 356:112；sahin等人2017,nature 547:222
‑
226)和一些toll样受体(tlr)配体(kaczanowska等人2013,j leukoc biol 93:847
‑
863)。
[0137]
其他抗肿瘤、抗癌或抗瘤剂包括溶瘤病毒(溶瘤病毒疗法)，如在溶瘤病毒免疫疗法中所使用的(kaufman等人2015,nat rev drug discov 14:642
‑
662)、任何其他癌症疫苗(癌症疫苗施用；guo等人2013,adv cancer res 119:421
‑
475)和任何其他抗癌核酸疗法(其中“其他”是指不同于使用已在本发明中具体设想的核酸或包含核酸的化合物的疗法)。
[0138]
因此，在本发明的任何方面和实施方式中，本发明的治疗方式可以进一步与针对肿瘤、癌症或赘生物的另一种疗法组合。这些其他疗法包括(例如)手术、辐射、化疗、免疫检查点或其他免疫刺激疗法、新抗原或新表位疫苗接种、癌症疫苗施用、溶瘤病毒疗法、抗体疗法或靶向肿瘤、癌症或赘生物的任何其他核酸疗法。
[0139]
其他定义
[0140]
相对于具体实施方式并且参考某些附图描述了本发明，但是本发明不限于此，而是仅受权利要求限制。不应将权利要求中的任何参考符号视为对范围的限制。所述附图仅是示意性的而并非限制。在附图中，一些元素的尺寸可以放大并且出于说明性的目的，未按比例绘制。当在本发明的描述和权利要求中使用术语“包含”时，它不排除其他元素或步骤。当表示单数名词时，在使用不定冠词或定冠词的情况下，例如，“一个”、“所述”，除非具体说明其他东西，否则这包括该名词的复数。此外，在描述中以及在权利要求中，术语第一、第二、第三等用于区分类似的元素，并且不必需描述依次顺序或按时间的顺序。应理解在适当
情况下，所使用的术语是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方式能够以不同于本文中所述或所示的其他顺序操作。除非在本文中具体定义，否则本文所使用的所有术语具有与本发明的领域的技术人员所理解的含义相同的含义。对于本领域的定义和术语，实践人员具体参考sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,第4版,cold spring harbor press,plainsview,new york(2012)；和ausubel等人,current protocols in molecular biology(增补版100),john wiley&sons,new york(2012)。本文所提供的定义不应视为具有小于本领域的常规技术人员所理解的范围。
[0141]
如本文所使用的术语“seq id no:x所定义的”是指由seq id no:x中所提供的氨基酸或核苷酸序列组成的生物序列。例如，seq id no:x中所定义的/由seq id no:x所定义的抗原由seq id no:x中所提供的氨基酸序列组成。其他实例是包含seq id no:x的氨基酸序列，它表示氨基酸序列比seq id no:x中所提供的氨基酸序列更长，但是完全包含了seq id no:x中所提供的氨基酸序列(其中seq id no:x中所提供的氨基酸序列可以位于更长的氨基酸序列的n
‑
末端或c
‑
末端或者可以嵌入更长的氨基酸序列中)或者表示由seq id no:x中所提供的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
[0142]
如上所述的方面和实施方式通常可以包含激活剂向对其有需要的哺乳动物的施用，即具有需要治疗的肿瘤、癌症或赘生物的哺乳动物。通常，将(治疗)有效量的激活剂施用于对其有需要的哺乳动物以获得所述临床反应。(治疗)有效量的激活剂将取决于多种因素，如施用途径和肿瘤块并且将由医师基于逐个病例确定。通常，通过激活剂的潜在毒性确定可以施用于哺乳动物的最大剂量的(治疗)有效量的激活剂并且其反映在最大耐药量(mtd)，即不引起不可接受的副作用的激活剂的最高剂量。“施用”表示导致试剂(例如，如本文所述的激活剂)或者包含试剂的组合物(如药剂或药物组合物)与所述试剂或组合物接触的对象(例如，细胞、组织、器官、体腔)之间相互作用的任何接触模式。可以在所述试剂或组合物的施用时立即或接近立即开始发生，可以在延长的时间段内(在所述试剂或组合物的施用时立即或接近立即开始)发生，或者可以相对于所述试剂或组合物的施用时间延迟试剂或组合物与对象之间的相互作用。更具体地，“接触”导致将有效量的试剂或包含所述试剂的组合物递送至所述对象。
[0143]
术语“有效量”是指试剂(例如，如本文所述的激活剂)或者包含所述试剂的组合物(例如，药剂或药物组合物)的剂量施用方案。有效量通常将取决于接触或施用模式和/或将需要对接触或施用模式进行调整。试剂或包含所述试剂的组合物的有效量是获得所期望的临床结果或治疗效果，同时不导致明显或不必需的毒性作用的量。为了获得或维持有效量，可以作为单一剂量或在多个剂量中施用试剂或包含所述试剂的组合物。还可以基于需要治疗的病况的严重程度来改变有效量；这可以取决于哺乳动物或患者的整体健康和身体状况，并且通常将需要治疗医生或医师的评价来建立有效量。还可以通过不同类型的接触或施用的组合来获得有效量。
[0144]
除人之外，哺乳动物组包括哺乳动物，如灵长类动物、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、美洲驼、单峰驼和骆驼，以及哺乳动物宠物(狗、猫、沙鼠、仓鼠、灰鼠、雪貂等)。
[0145]
应理解尽管本文已对于根据本发明的细胞和方法讨论了具体实施方式，具体构造以及材料和/或分子，但是可以在不背离本发明的范围和精神的的情况下对形式和细节做
出多个改变或修改。提供以下实施例以更好地说明具体实施方式，并且不应将它们认为是对本发明申请的限制。本发明申请仅受权利要求的限制。
[0146]
本文所引用的文档的内容作为参考并入。
[0147]
实施例
[0148]
1.材料和方法
[0149]
小鼠品系
[0150]
由erik olson产生并且通过r.l.johnson赠送了yap
flox/flox
；taz
flox/flox
小鼠品系(xin等人2013；xin等人2011)。由r.l.johnson产生并赠送了last1
flox/flox
；last2
flox/flox
(heallen等人2013；heallen等人2011)。由c.marine友好提供了rosa26
‑
lox
‑
stop
‑
lox
‑
tdtomato小鼠(madisen等人2010)。由d.pan.l产生并赠送了apoe
‑
rtta,tre
‑
yap小鼠品系(dong等人2007)。通过last1
flox/flox
；last2
flox/flox
和yap
flox/flox
；taz
flox/flox
系杂交，在实验室产生了last1
flox/flox
；last2
flox/flox
；yap
flox/flox
；taz
flox/flox
小鼠(如上所述)。c57bl/6小鼠购自charles river。性别和年龄匹配的对照是同窝动物。根据kuleuven动物研究委员会批准的规程安放、饲养和处理小鼠。kuleuven机构伦理委员会(institutional ethical commission)批准并且根据相关机构和国家指南和法规进行所有小鼠实验。
[0151]
患者样品
[0152]
肝脏活组织检查在鲁文大学医院(university hospital leuven)得自具有hcc或icc的患者。在获得书面知情同意后，采集所有样品。在肿瘤手术去除(切除样品)后立即将组织固定在6％的福尔马林中并石蜡包埋。根据世界卫生组织的标准进行hcc或合并icc的组织病理学诊断。本研究经比利时鲁文大学医院的伦理委员会批准。
[0153]
质粒
[0154]
表达人myc标签化tead4(myc
‑
tead4)的质粒和超活性睡美人(pcmv/sb11)质粒得自addgene(分别为#24638和#26552)。小鼠十八烷基化和ha
‑
标签化的akt、myc
‑
标签化的notch1受体和诱导型cre
ert2
的片段分别得自pt3
‑
ef1α
‑
myr
‑
ha
‑
akt(addgene#31789)、pt3
‑
ef1α
‑
myc
‑
n
icd
(addgene#86500)和pcag
‑
cre
ert2
(addgene#14797)载体，并亚克隆至睡美人载体psbbi
‑
puro(addgene#60523)的sfil限制性位点中。人bcl2基因片段通过pcr得自flag
‑
bcl2载体(addgene#18003)并且亚克隆至诱导型睡美人载体psbtet
‑
rh(addgene#60500)的sfil限制性位点中。人yap片段通过pcr得自pegfp
‑
c3
‑
yap2(addgene#19055)载体；将ha
‑
标签加入至5'引物，并且将pcr产物亚克隆至pcdna3.1载体(invitrogen)的noti和xbai限制性位点中。通过l.zender产生并赠送了表达小鼠myc和nras
g12v
的pcamin质粒。靶向人yap cdna和rtta
s
‑
m2的shrna作为97bp ultramers订购自idt并且如前所述克隆至修饰的prrl
‑
lt3
‑
gepir载体中(fellmann等人2013)。对于组成型表达，通过ncoi
‑
nhei消化具有shrna的prrl
‑
lt3
‑
gepir载体并且通过使用ncoi
‑
xbai位点将所得的gfp
‑
mir
‑
e片段克隆到psbbi
‑
puro载体中。
[0155]
黑素瘤小鼠细胞系的产生
[0156]
使用钳和剪将来自tyr::n
‑
ras
q61k ink
4a
‑
/
‑
(tyr::cre
ert2
)动物的黑素瘤分成小块。使用胶原酶i(2mg/ml，sigma aldrich，产品目录c0130)和iv(2mg/ml，sigma aldrich，产品目录c5138)混合物，将组织在37℃消化20min，然后用胰蛋白酶(胰蛋白酶
‑
edta 0.05％，thermofisher scientific，产品目录25300054)在37℃消化5min。使用40μm细胞滤
网从残余组织中分离单细胞，并使用补充有10％胎牛血清和100μg/ml青霉素/链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dmem)离体培养。
[0157]
高压尾静脉注射
[0158]
对于转座子系统的肝内递送(kang等人,2011)，固定8至10周大的小鼠并通过侧尾静脉高压注射1μg pcmv/sb11、4μg psbbi
‑
puro
‑
myrakt
‑
ha、20μg psbbi
‑
puro
‑
myc
‑
nicd或者10μg cmyc
‑
ires
‑
nras。对于sb
‑
cre
ert2
或诱导型bcl2的表达，分别将15μg psbbi
‑
puro
‑
cre
ert2
或者10μg psbteton
‑
rh
‑
flag
‑
bcl2加入至质粒混合物。将所有质粒在无菌过滤的0.9％nacl中稀释，并将总体积调节至总体重(以克为单位)的10％(以ml为单位)。
[0159]
对于肿瘤细胞的肝内接种，对小鼠高压注射10.000个在无菌最低必需培养基(mem)中稀释且调节至总体重(以克为单位)的10％(以ml为单位)的小鼠黑素瘤细胞(nras
+
/ink4a
‑
/
‑
)。每天监测所有注射的小鼠，并在适当的时间点成组处死。所有实验和对照组含有5至10只小鼠。
[0160]
多西环素和他莫昔芬施用
[0161]
yap和taz的条件性缺失，通过腹膜内注射以1.6mg/kg在玉米油中的浓度，连续5天施用他莫昔芬。为了激活apo>hyap
1sa
小鼠中teton
‑
bcl2的表达或者人yap表达，将0.2mg/ml多西环素在补充有2.5％蔗糖的无菌过滤饮用水中稀释并任意施用。将含有多西环素的水瓶避光保存并每隔一天更换一次。
[0162]
aav8
‑
cre施用
[0163]
在肝细胞特异性启动子tbg的控制下表达cre重组酶的腺病毒相关病毒血清型8型(aav8)购自upenn(aav8.tbg.pi.cre.rbg，产品目录号av
‑8‑
pv1091)。小鼠通过尾静脉注射接受在200μl 1
×
磷酸盐缓冲盐水(pbs)中稀释的5
×
10
11
gc的aav8.tbg.pi.cre.rbg。
[0164]
组织学和免疫组织化学
[0165]
用yap和taz抗体对人福尔马林
‑
固定的石蜡
‑
包埋的组织载玻片(5μm厚)染色。使用dab
‑
发色团，然后通过苏木精复染进行显像。将小鼠肝脏在4℃用4％多聚甲醛(pfa)固定48小时。将石蜡切片(6μm)用于组织学并用苏木精和伊红(h&e)染色，并且使用slide scanner axio scan.z1显微镜成像。
[0166]
免疫荧光染色和图像分析
[0167]
对于免疫荧光分析，将肝脏样品包埋在4％琼脂糖在pbs中的溶液中，然后使用vibratome(leica vt 1000s型)以100μm厚切片。用0,5％tritonx
‑
100使肝脏切片透性化10分钟，并在室温下在3％牛血清抗体(bsa)在pbs中的溶液中封闭2小时。然后，将切片在第一抗体溶液中培育过夜。次日，将切片在室温下在第二抗体溶液中培育2小时。然后，清洗切片并固定在mowiol上，并通过olympus fv1200共聚焦显微镜分析。在imagej中用bio
‑
formats importer插件处理图片。
[0168]
肝细胞分离
[0169]
通过腹膜内注射戊巴比妥钠(nembutal，50mg/kg)使小鼠麻醉。用40ml灌注媒介物sc
‑
1灌注肝脏5分钟以除去血液，随后用含有10mg胶原酶的30ml sc
‑
2媒介物灌注5分钟。切掉每个肝叶并切成小块，将其置于含有60ml sc
‑
20，20mg胶原酶(roche)和1ml dna酶i(sigma)的烧杯中，然后在37℃旋转培育20min。通过70μm滤网过滤细胞，并在室温下以500rpm离心2min。将肝细胞在5ml sc
‑
2媒介物中再混悬，施加到25％percoll溶液上方，并
在4℃离心20分钟。
[0170]
定量rt
‑
qpcr
[0171]
根据生产商的说明，使用rneasy mini试剂盒(qiagen)从小鼠组织分离总rna。用oligo dt和revertaid h minus反转录酶(thermo scientific)，将rna样品反转录为互补dna。使用lc 480sybr green imaster(roche)反应进行实时定量pcr。所有实验重复三次，并将表达水平归一化为gapdh水平。在重要资源表中提供了引物的详细列表。
[0172]
免疫印迹
[0173]
将完整肝脏样品、显微切割的肿瘤和肝细胞样品在补充有蛋白酶抑制剂混合物(sigma)的rppa缓冲液中超声处理。使用bca测定(pierce)确定蛋白浓度。将裂解液在laemmli样品缓冲液中稀释，将20μg蛋白样品加载至sds
‑
page凝胶并转移至pvdf膜(millipore)。通过使用增强化学发光膜(ge healthcare life sciences)使蛋白条带显象。使用imagej软件进行条带的光密度定量。
[0174]
rna
‑
seq分析
[0175]
总计，在该rna
‑
seq分析中使用了6个样品。将3个瘤周肝细胞(peri tu)重复定义为：ph_wt_tumors_r1、ph_wt_tumors_r2、ph_wt_tumors_r3。将以下样品用作瘤周肝细胞的对照(3个重复)(peri tu ctrls)：ph_wt_notreat_r1、ph_wt_notreat_r2、ph_wt_notreat_r3。使用fastq
‑
mcf清除原始测序读序的接头。将清除的读序绘制成小家鼠(mus musculus)10基因组(grcm38/mm10)并且使用star：rna
‑
seq比对器分配基因(dobin等人2013)。对原始计数矩阵(通过star获得)过滤低表达基因(每个样品不足1个计数)。使用multiple experiment viewer(mev)对log2归一化的中值中心表达数据产生热图(saeed等人2003)。使用转化为log2坐标的前置过滤计数数据进行主成分分析。然后，使用1.16.1版的deseq2 r软件包进行差异基因表达分析(love等人2014)。
[0176]
基因集富集
[0177]
为了构建瘤周肝细胞的基因排序(gene rankings)，基于统计值(stat value)对基因排序。使用gsea软件v3.0进行基因集富集(mootha等人2003；subramanian等人2005)。
[0178]
数据和软件可用性
[0179]
在本论文中报道的单细胞测序数据集的登录号为geo：gse103788。
[0180]
定量和统计
[0181]
使用imagej软件进行所有定量。通过测量肿瘤面积(通过n
‑
akt模型中的ha
‑
akt阳性细胞，myc
‑
ras模型中的磷酸化
‑
erk表达或者黑素瘤模型中的s100表达标记)和总面积(通过dapi标记)进行相对肿瘤面积定量。另外，在该测量中排除了肿瘤的腔空间，因为这些不会产生肿瘤细胞块。我们通过将肿瘤面积乘以每只小鼠的肝脏重量推断出绝对肿瘤负荷(绝对肿瘤负荷(cm3)＝肿瘤面积(cm)
×
肝脏重量(克))
[0182]
使用imagej细胞计数器插件(cell counter plugin)进行细胞死亡和细胞增殖的定量。使用prism7(graphpad)进行所有统计分析。除非另有说明，否则作为平均值
±
sem提供数据，并且将非配对学生t检验用于每个时间点的分析。将p值0.05认为是统计学显著的。*，**，和***对应于p值分别<0.05、0.01和0.001。
[0183]
数据和软件可用性
[0184]
在本发明申请中报道的单细胞测序数据集的登录号为geo：gse103788。
[0185]
寡核苷酸
[0186]
psbbi
‑
puro
‑
sh1rtta
[0187]
tgctgttgacagtgagcgacaacagagaaacagtacgaaatagtgaagccacagatgtatttcgtactgtttctctgttggtgcctactgcctcgga(seq id no:1)
[0188]
psbbi
‑
puro
‑
sh2rtta
[0189]
tgctgttgacagtgagcgagcccttgacgatptgacttatagtgaagccacagatgtataagtcaaaatcgtcaagggcgtgcctactgcctcgga(seq id no:2)
[0190]
psbbi
‑
puro
‑
sh3rtta
[0191]
tgctgttgacagtgagcgccaggagcatcaagtagcaaaatagtgaagccacagatgtattttgctacttgatgctcctgttgcctactgcctcgga(seq id no:3)
[0192]
psbbi
‑
puro
‑
sh1hyap
[0193]
tgctgttgacagtgagcgccgacagtcttcttttgagatatagtgaagccacagatgtatatctcaaaagaagactgtcgatgcctactgcctcgga(seq id no:4)
[0194]
psbbi
‑
puro
‑
sh2hyap
[0195]
tgctgttgacagtgagcgcacaggtgatactatcaaccaatagtgaagccacagatgtattggttgatagtatcacctgtatgcctactgcctcgga(seq id no:5)
[0196]
mm yap1 qpcr正向引物：gccatgttgttgtctgatcg(seq id no:6)
[0197]
mm yap1 qpcr反向引物：cctgatgatgtaccactgcc(seq id no:7)
[0198]
mm taz qpcr正向引物：tgccatgtggtgattttctc(seq id no:8)
[0199]
mm taz qpcr反向引物：cctatgacgtgaccgacgag(seq id no:9)
[0200]
mm ctgf qpcr正向引物：gcttggcgattttaggtgtc(seq id no:10)
[0201]
mm ctgf qpcr反向引物：cagactggagaagcagagcc(seq id no:11)
[0202]
mm cyr61 qpcr正向引物：tttacagttgggctggaagc(seq id no:12)
[0203]
mm cyr61 qpcr反向引物：caccgctctgaaagggatct(seq id no:13)
[0204]
mm ankrd1 qpcr正向引物：tgaggctgaaccgctataaga(seq id no:14)
[0205]
mm ankrd1 qpcr反向引物：cagtgcaacaccagatccat(seq id no:15)
[0206]
mm gapdh qpcr正向引物：cgtcccgtagacaaaatggt(seq id no:16)
[0207]
mm gapdh qpcr反向引物：ttgatggcaacaatctccac(seq id no:17)
[0208]
[0209]
[0210][0211]
2.结果
[0212]
2.1.肝癌细胞存活对yap/taz的依赖取决于瘤周肝细胞中yap/taz的激活
[0213]
为了研究肝肿瘤中和周围的yap和taz的功能，我们使用了通过高压尾静脉注射驱动多种(激活的)致癌基因的表达的基因组
‑
整合的睡美人(sb)质粒在成年小鼠中包括散布肝细胞的体细胞转化的小鼠模型。我们首先通过共表达刻痕受体(notch receptor)(刻痕胞内域，n
icd
)的激活形式和akt(十八烷基化和ha
‑
标签化，ha
‑
akt)诱导了肝内肝胆管型肝癌(icc)的发生(fan等人,2012)。这些质粒的注射导致在dna注射后6
‑
7周产生了多个肉眼可见的肿瘤(图8a，在下文中称为n
‑
akt肿瘤)(fan等人2012)。
[0214]
如人肝胆管型肝癌中所观察的(kim等人2013；marti等人2015；pei等人2015)，小鼠n
‑
akt肿瘤细胞具有高yap和taz水平(图1a)。肿瘤细胞中的yap水平与其中yap高度表达的胆管和内皮细胞中的那些一样高(图1a)(wang等人2017；zhang等人2010)。为了测试yap和taz对肿瘤维持的重要性，我们使yap及其同源物taz缺失以消除所建立的n
‑
akt肿瘤中的潜在的补偿冗余。我们将表达他莫昔芬诱导型cre
ert2
(sb
‑
cre
ert2
)的质粒以及n
icd
和ha
‑
akt质粒共注射到yap
fl/fl
；taz
fl/fl
双flox控制的小鼠(double floxed mice)中，然后当已形成肉眼可见的肿瘤时，通过4周后的他莫昔芬施用引发了yap和taz缺失(图1b，图8a)。由于将sb
‑
cre
ert2
质粒与n
icd
和ha
‑
akt质粒一起共注射，这引起了肿瘤细胞中特异的yap和taz flox控制的等位基因的重组。肿瘤细胞中yap和taz的缺失强烈降低了肿瘤负荷(图1c
‑
f)。yap/taz缺失后3周，无肉眼可见的肿瘤并且大致肝脏形态和外观相对正常(图1c)。突变体肝脏的组织学分析显示肝实质基本上由正常肝细胞组成并且含有少量肿瘤残余(图1c)。肝脏切片上相对肿瘤面积的定量(排除肿瘤腔空间，因为这些不是真正的肿瘤块)和绝对肿瘤
质量的确定(通过相对肿瘤面积乘以肝脏重量)确认了宏观评价并且显示通过yap/taz缺失，肿瘤严重减小(图1e，f)。作为对照，我们通过处理具有表达sb
‑
cre
ert2
的n
‑
akt肿瘤的野生型(c57bi/6j)小鼠(图8b
‑
e)和具有不表达sb
‑
cre
ert2
的n
‑
akt肿瘤的yap
fl/fl
；taz
fl/fl
双flox控制的小鼠(图1c，顶部图)，测试了他莫昔芬施用对肿瘤生长的影响。与未处理的wt动物中的肿瘤生长相比，在这些对照群组中的任一个中肿瘤的出现和生长不受影响(图8b
‑
e)。因此，n
‑
akt肿瘤细胞的存活需要yap/taz。
[0215]
为了模拟全身yap/taz抑制，我们在肿瘤细胞和周围肝细胞两者中使yap和taz缺失。我们通过在sb
‑
cre
ert2 yap/taz flox控制的小鼠中注射表达cre的腺病毒相关病毒(在下文中，aav
‑
cre)引发了肝细胞中yap/taz的缺失。值得注意地，这些aav
‑
cre病毒在肝细胞中特异性地引起cre表达，但是在胆管细胞或肝胆管型肝癌细胞中不引起，这是因为aav
‑
cre是血清型8型，它在肝脏中仅感染肝细胞，并且因为cre表达受肝细胞特异性tbg启动子控制(图8f)(fan等人2012；wang等人2010；yanger等人2013)。中试实验确定了在几乎每个肝细胞中促进重组所必需的aav
‑
cre病毒的最优剂量(图8f)并且还显示aav感染不影响肿瘤发展(图8b
‑
e)。用rosa26
‑
loxp
‑
stop
‑
loxp
‑
tdtomato报告子监测cre活性显示在几乎所有的肿瘤细胞和肝细胞中普遍的tdtomato表达(图1i)。向yap
fl/fl
；taz
fl/fl
小鼠注射n
icd
、ha
‑
akt和sb
‑
cre
ert2
质粒后4周，我们通过施用他莫昔芬和aav
‑
cre在n
‑
akt肿瘤细胞和周围肝细胞中同时使yap和taz缺失(图1b)。显著地，这些小鼠出现了生长至与对照小鼠中的那些相同尺寸的n
‑
akt肿瘤(图1c)。这通过相对肿瘤面积和绝对肿瘤负荷的定量进一步建立(图1d
‑
f)。通过免疫组织化学和免疫印迹确认肿瘤细胞和正常肝细胞两者中yap/taz蛋白的有效减少(图1g，图1h)。
[0216]
这些数据显示当被野生型，而不是yap/taz突变体肝细胞围绕时，n
‑
akt肿瘤细胞的存活需要yap/taz。
[0217]
2.2.yap在瘤周肝细胞中激活
[0218]
以上数据表明yap/taz不仅在肿瘤细胞中起作用，而且还在瘤周肝细胞中起作用。一致地，在围绕n
‑
akt肿瘤的肝细胞中检测到yap，而不是taz的水平升高(图1a，图2a)。相反，仅在正常肝脏的肝细胞中检测到yap(或taz)水平。注意，如先前所示，还容易地在胆管和内皮细胞中检测到yap(图1a)(wang等人2017；zhang等人2010)。与这些小鼠数据一致，在大部分人肝细胞癌(hcc，82个中有44个)和icc肿瘤(26个中有13个)的瘤周肝细胞中观察到显著的yap和/或taz核积累，但是在健康人肝脏的肝细胞中未观察到(图2b，图9a
‑
图9d)。
[0219]
n
‑
akt肿瘤周围yap/taz的积累不是由于肝细胞中yap和taz mrna水平的升高(图2c)，因此我们通过测量yap定位的变化测定了转录后调控。然而，由于yap在正常肝细胞中不易检测并且为了避免对yap翻译的影响，我们测定了异位表达的ha
‑
标签化yap以测量对yap定位的影响。我们通过对具有n
‑
akt肿瘤的小鼠高压注射，用表达受组成型ef1α启动子控制的ha
‑
标签化yap的睡美人质粒体内转染瘤周肝细胞。然后，在3天后，使ha
‑
yap定位显像和定量。在来自对照小鼠的正常肝脏中，ha
‑
yap主要在细胞质和核中等同分布。相反，ha
‑
yap在具有肝肿瘤的小鼠肝细胞核中积累(图2d
‑
图2e)。这种影响与yap与其核伴侣tead4共表达时相当(图2d，图2e)。因此，肝肿瘤的存在引发了yap在瘤周肝细胞中的核积累。
[0220]
我们接着通过绘制从正常肝脏和具有n
‑
akt肿瘤的肝脏facs纯化的肝细胞的转录组谱测试了对基因表达的影响(图9e，图9f)。与正常肝细胞相比，rnaseq分析在来自n
‑
akt
小鼠的瘤周肝细胞中识别了3273个显著上调的基因(log2fc>1，fdr<0.05)和523个下调的基因(log2fc<1，fdr<0.05)。对于在细胞增殖、应激反应、创伤愈合、血管生成和细胞死亡中起作用的因素富集了上调基因(图9g)。值得注意地，具有先前建立的来自yap
‑
驱动的肝细胞癌和来自过表达yap的mcf10a细胞的yap特征的基因集富集分析(gsea)(sohn等人2016；zhao等人2008)在瘤周肝细胞中检测到显著的hippo通路基因表达特征(log2fc<1，fdr<0.05)(图2f，图2g)。显著的yap靶标，包括ctgf、cyr61、pdgfrβ、fbn1、ankrd1和birc5在上调基因中。定量rt
‑
qpcr确认了yap靶标基因的上调(图2h)。与yap激活一致，肝细胞在携带肿瘤的肝脏中异位增殖。除高度增殖的肿瘤细胞之外，约6％的瘤周肝细胞(通过hnf4a(hnf4α)表达标记)以及其他hnf4a阴性实质细胞表达ki67(图9h，图9i)。在正常肝脏中，不到0.2％的肝细胞表达ki67(图9h，图9i)。总体上，这些数据显示瘤周肝细胞异位激活yap并且是增殖性更强的。
[0221]
2.3.瘤周yap活性限制肿瘤生长
[0222]
为了确定yap在瘤周肝细胞中的功能，我们通过利用aav
‑
cre特异性感染肝细胞，而不感染胆管细胞或肝胆管型肝癌细胞的事实，特异性地使yap和taz在瘤周肝细胞，而不在肿瘤细胞中缺失(fan等人2012；wang等人2010；yanger等人2013)。对于本文中的实验，我们在肿瘤发展4周后通过将其注射到具有建立的n
‑
akt肿瘤的r26
‑
loxp
‑
stop
‑
loxp
‑
tdtomato报告子小鼠中确认了aav
‑
cre对瘤周肝细胞的特异性。3天后，在瘤周肝细胞中，但是在不到0.05％的ha
‑
标签阳性肝胆管型肝癌细胞中观察到了tdtomato报告子的重组和激活(图3a，图3b)。
[0223]
我们接着在瘤周肝细胞中特异性地缺失了yap和taz。通过高压尾静脉注射n
icd
和ha
‑
akt质粒，我们在yap
fl/fl
；taz
fl/fl
双flox控制的小鼠中诱导了肝胆管型肝癌形成(图3c)。4周后，通过用aav
‑
cre注射这些小鼠，我们使yap和taz在肝细胞中缺失。对于未缺失对照，我们将aav
‑
cre注射到具有n
‑
akt肿瘤的c57bl/6wt小鼠中，或者将媒介物(pbs)注射到具有n
‑
akt肿瘤的yap
fl/fl
；taz
fl/fl
双flox控制(double floxed)的小鼠中。然后，在3周后，分析小鼠，使肿瘤发展的总时长达到7周(图3c)。yap和taz mrna和蛋白水平分析确认yap/taz在瘤周肝细胞中缺失(图3d，e)。
[0224]
yap和taz在瘤周肝细胞中的缺失导致肿瘤负荷增加(图3f
‑
i)。我们控制了aav
‑
cre感染的潜在影响并且发现与注射媒介物的c57bl/6小鼠相比，aav
‑
cre注射不会影响c57bl/6小鼠中的总肿瘤体积(图8b
‑
e)。因此，yap/taz突变体肝脏中肿瘤负荷的增加是由于瘤周肝细胞中yap和taz活性的降低并且不是由于aav
‑
cre感染所引起的间接影响所造成的。显著地，yap和taz在瘤周肝细胞中的缺失引起肿瘤细胞增殖增加，如通过增殖标记的ki67的表达升高所证明的(图3j
‑
k)。这些快速生长的肿瘤最终替换肝实质，如通过肿瘤负荷增加，同时肝脏与体重之比保持不变所证明的。瘤周yap/taz缺失后3周，仅保留了一小部分肝实质，并且大部分组织被肿瘤占据(40％)。在yap+/taz+肝脏中，肿瘤仅占肝脏面积的20％(图3h)。因此，yap/taz促进瘤周肝细胞存活，其反过来抑制相邻肿瘤细胞增殖。这些数据突出了yap/taz在瘤周肝细胞中的意外活性，其非自主地限制了肿瘤生长。
[0225]
2.4.瘤周肝细胞中lats1/2缺失(删除，deletion)引起肿瘤消退
[0226]
我们对瘤周肝细胞中yap/taz的内源激活限制肿瘤生长的发现提示我们测试瘤周肝细胞中yap/taz的更强的激活是否可以进一步提高肿瘤抑制。为此，我们通过lats1和
lats2的条件性缺失组成型激活了肝细胞中的yap/taz。为了使lats1和lats2同时在瘤周肝细胞中特异性缺失，我们将aav
‑
cre注射到对lats1和lats2的flox控制的等位基因双重纯合的具有肿瘤的小鼠中(lats1
fl/fl
,lats2
fl/fl
)(图4a)。作为对照小鼠，我们使用了用媒介物(pbs)注射的lats1
fl/fl
,lats2
fl/fl
小鼠。我们因此在n
‑
akt肿瘤诱导后4周注射了aav
‑
cre，这是肝脏已具有肉眼可见的肿瘤的时间点(图4b)。lats1/2在具有n
‑
akt肿瘤的小鼠中的瘤周缺失的确引起了无活性磷酸化
‑
s112
‑
yap的减少(即活性yap增加)和总taz水平升高(图4c)并且导致肝细胞增殖和肝脏尺寸的强烈增加(图4d
‑
图f)。因此，lats1/2的缺失将yap/taz超激活至野生型瘤周肝细胞中的水平以上。
[0227]
显著地，lats1/2缺失后2周，大部分突变体肝脏显示与对照相比，肿瘤负荷显著降低(图4g
‑
j)。在肝脏切片中定量肝细胞和肿瘤面积确定在对照小鼠中，肝肿瘤占肝脏面积的40％，而在lats1/2突变体中，肝肿瘤占不到5％(图4h)。这种显著减小还反映在绝对肿瘤负荷，其中lats1/2缺失引起肿瘤负荷超过70％的降低(图4i)。另外，肿瘤外观改变，从而突变体肝脏中的肿瘤通常失去它们的乳突状形态，并且较小的肿瘤通常似乎是消退肿瘤的残余物(图4g)。重要地，与野生型相比，超过一半的突变体肝脏具有降低的肿瘤负荷，并且20％的突变体肝脏是接近无肿瘤的(图4i)。这些结果表明瘤周肝细胞中lats1/2的缺失引起肿瘤消退。
[0228]
由于lats1/2缺失导致yap/taz的强激活，因此我们想要直接测试lats1/2缺失所引起的肿瘤消除是否是由于yap/taz的超激活或者是由于lats1/2独立于yap/taz的功能所造成的。为了测试该想法，我们在瘤周肝细胞中使yap、taz、lats1和lats2同时缺失。我们通过高压尾静脉注射n
icd
和ha
‑
akt质粒在yap
fl/fl
；taz
fl/fl
；lats1
fl/fl
；lats2
fl/fl
四重flox控制的小鼠中诱导肝胆管型肝癌形成，在肿瘤发展4周后注射aav
‑
cre并在2周后分析小鼠(图4a)。yap/taz的缺失完全挽救了lats1/2缺失所引起的肝脏生长和肿瘤抑制表型(图4g)。四重突变体肝脏具有类似于野生型肝脏的肿瘤负荷，并且无异位肝细胞增殖和肝脏过度生长(图4d
‑
图4i)。这表明通过驱动瘤周肝细胞中的yap/taz激活，瘤周肝细胞中lats1/2的缺失导致肝胆管型肝癌抑制。
[0229]
2.5.瘤周yap激活足以引发肿瘤消退
[0230]
我们然后测试了由于主要lats1/2磷酸化位点的突变，yap的组成型活性形式(yap
1sa
；这是具有突变ser127ala的yap变体；参见上文中的描述)的过表达是否足以重现由lats1/2缺失所引起的肿瘤消退。我们使用了在肝细胞中受多西环素(dox)诱导型启动子(teton系统)控制有条件地过表达人yap
1sa
并且其中反向四环素反式激活因子(rtta)的表达受肝细胞特异性apoe启动子(在下文中，apo>hyap
1sa
)控制的转基因小鼠(dong等人,2007)。通过饲喂多西环素，如先前所报道的，apo>hyap
1sa
小鼠引起肝细胞增殖并且出现肝脏过度生长(图10a，图10b)(dong等人2007)。然后，我们在apo>hyap
1sa
小鼠中诱导n
‑
akt肿瘤并且通过向它们的饮用水中添加多西环素，在肿瘤发展4周后诱导hyap
1sa
表达(图5a)。如所期望的，在多西环素处理的apo>hyap
1sa
小鼠中，yap蛋白水平升高，但是在未处理的apo>hyap
1sa
小鼠或者在多西环素处理的c57bl/6小鼠中不升高(图10c)。由于从肝细胞特异性apoe启动子表达rtta，因此hyap
1sa
仅在瘤周肝细胞中表达，而不在肝胆管型肝癌细胞中表达(图5b)。
[0231]
多西环素处理2周后，与未处理的apo>hyap
1sa
同胞小鼠(siblings)相比，hyap
1sa
的
过表达引起肿瘤负荷显著降低(图5c
‑
图5e)，这与lats1/2突变体肝脏中观察到的情况类似(图4)。处理的apo>hyap
1sa
小鼠的肿瘤负荷平均降低超过5倍，并且5/10的小鼠仅具有少量肿瘤残余(图5c，图5e)。随时间测量肿瘤负荷显示未处理的apo>hyap
1sa
对照小鼠随时间具有剧烈的肿瘤生长，但是处理的apo>hyap
1sa
小鼠在hyap
1sa
诱导后肿瘤负荷降低(图5f)。显著地，在肿瘤起始后，2周多西环素施用足以将apo>hyap
1sa
小鼠的存活延长至14周(图5g)。因此，尽管一半对照小鼠在肿瘤起始6周内死亡，但是超过80％的所处理的apo>hyap
1sa
小鼠此时仍存活，并且比对照小鼠平均存活长4周。然而，肿瘤消除不完全，并且这些小鼠最终死于重新生长的肝胆管型肝癌。这些结果表明瘤周肝细胞中的yap激活足以引起肿瘤消退，并且短暂的yap激活可以延长具有肝胆管型肝癌的小鼠的存活。
[0232]
2.6.通过程序细胞死亡消除肿瘤细胞
[0233]
为了研究肿瘤细胞消除机制，我们首先分析了细胞死亡。lats1/2突变体肝细胞围绕的n
‑
akt肿瘤显著提高了对tunel染色呈阳性的细胞数目(图6a，图6b)，这测定了dna断裂并且标记了经历程序细胞死亡的细胞(elmore 2007；kressel&groscurth 1994)。在aav
‑
cre施用后6天，当被lats1/2突变体肝细胞围绕时，超过40％的肿瘤细胞是tunel阳性的，而当被对照肝脏中的野生型肝细胞围绕时，不到6％的肿瘤细胞是tunel阳性的(图6b)。具体地，对照肝脏显示tunel阳性细胞主要处于大肿瘤中心，而不是小肿瘤中，尽管在lats1/2突变体中，小肿瘤和大肿瘤均对tunel是高度阳性的(图6a)。因此，当被lats1/2突变体肝细胞围绕时，肿瘤细胞经历细胞死亡水平升高。
[0234]
我们监测了免疫细胞浸润(cd45和cd3)和肿瘤缺氧水平(hif2α，glut1表达)，但是我们在这些过程中未检测到显著差异(图6c，图6e；图11)。肿瘤从突变体lats1/2肝脏中消退的免疫印迹分析还显示与对照肿瘤相比，taz、yap和磷酸化yap的量无明显差异(图6d)，从而消除了消退表型是由于对hippo通路本身的一些反馈抑制所造成的可能性。然后，我们分析了不同细胞死亡途径对lats1/2突变体肝细胞所围绕的肿瘤细胞的消除的贡献。肿瘤消退显示与对照肿瘤相比，磷酸化和非磷酸化mlkl和ripk3的量无差异(图6d，图6e)，而用ccl4处理以引起急性肝损伤的正常肝脏显示pmlkl升高而ripk3水平降低。总体上，这些结果因此表明半胱天冬氨酸酶3介导的细胞凋亡和ripk3介导的坏死性凋亡可以不在肿瘤细胞消除中起显著作用。然而，当与来自对照小鼠的肿瘤相比时，lats1/2突变体的肿瘤消退显示抗
‑
凋亡蛋白bcl2的水平降低(图6e)。为了确定bcl2调控对肿瘤细胞消除的贡献，我们在lats1/2在周围肝细胞中缺失时开始，使bcl2在肿瘤细胞中有条件地过表达。我们因此将n
icd
和ha
‑
akt质粒与有条件地过表达受多西环素诱导型teton系统控制的bcl2的质粒一起注射到lats1/2双flox控制的小鼠中(图6f)。肿瘤发展4周后，我们注射aav
‑
cre以使lats1/2在瘤周肝细胞中缺失，并且在饮用水中提供多西环素以在肿瘤细胞中诱导bcl2表达(图6g)。显著地，在lats1/2缺失后，bcl2表达完全挽回了肿瘤消除(图6g
‑
图6j)。在其中lats1/2在瘤周肝细胞中未缺失的对照小鼠的肿瘤内的bcl2过表达不会显著改变n
‑
akt肿瘤的尺寸(图6g
‑
图6j)。当bcl2在apo>hyap
1sa
小鼠肿瘤内过表达时，观察到了相同的效果(图11c
‑
图11f)。这些结果表明瘤周肝细胞中yap/taz的激活在肿瘤细胞中引发了程序细胞死亡，而bcl2过表达防止了这种情况。
[0235]
2.7.yap激活消除了肝细胞癌
[0236]
以上数据显示瘤周肝细胞抑制n
‑
akt诱导的icc的生长。我们接着测试了这种肿瘤
抑制剂机制是否是影响其他肝肿瘤，具体地肝细胞癌的生长发育的一般机制。我们因此测试了瘤周yap激活对通过共表达myc和nras
g12v
所引起的小鼠肝细胞癌(在下文中myc
‑
ras肿瘤，seehawer等人2018)的影响。然而，我们不可以简单地使用apo>hyap
1sa
或aav
‑
cre介导的lats1/2缺失来激活瘤周肝细胞中的yap，因为myc
‑
ras hcc细胞可以被aav
‑
cre感染，并且它们还表达apoe和tbg启动子，这将引起yap在肿瘤细胞中的激活。我们因此修改了我们的apo>hyap
1sa
策略并且通过共注射表达靶向rtta和hyap
1sa
转基因的shrna的质粒来防止hyap
1sa
在肿瘤细胞中的表达(图7a)。值得注意地，yap
1sa
转基因表达人yap，这允许我们设计特异性靶向人yap
1sa
转基因，而不是内源小鼠yap基因的shrna。靶向rtta和hyap
1sa
的shrna质粒的注射有效地抑制了apo>hyap
1sa
小鼠中hyap
1sa
转基因的表达(图12e)。因此，将rtta和hyap shrna的肿瘤特异性表达与apo>hyap
1sa
转基因组合使得我们能够在围绕myc
‑
ras hcc的肝细胞中特异性地诱导hyap
1sa
表达。
[0237]
为了测试瘤周yap
1sa
表达对hcc的影响，我们将myc
‑
ras质粒与表达靶向rtta、hyap或者作为对照的海肾荧光素酶的shrna的质粒一起注射到apo>hyap
1sa
小鼠中。当出现大hcc结节时，在尾静脉dna注射后6
‑
7周，必须使表达myc
‑
ras的小鼠安乐死(seehawer等人2018)。因此，在dna注射以激活hyap
1sa
表达后4周，我们施用了多西环素。明显地，2周后，表达rtta shrna或者hyap shrna的小鼠的肿瘤负荷降低并且两者的组合显示接近完全的hcc肿瘤消除(图7c
‑
图7e，图12c)。相反，表达rtta和hyap shrna但是未接受多西环素并因此不诱导hyap
1sa
表达的对照小鼠具有高hcc肿瘤负荷(图7b
‑
图7e，图12)。另外，在表达对照海肾荧光素酶shrna的apo>hyap
1sa
小鼠的肿瘤细胞中未防止hyap
1sa
表达并且这些小鼠具有大肿瘤负荷(图12c)。因此，瘤周肝细胞中的yap激活足以消除myc
‑
ras hcc肿瘤。
[0238]
2.8.yap激活消除了肝脏中的转移性黑素瘤
[0239]
多种癌症类型转移至肝脏(agarwala等人2014；sherman&mahvi2014)。黑素瘤肝转移对于患者是特别致命的，特别是对于具有激活nras
‑
突变的那些(damsky等人2013)。为了测试yap激活的肝细胞抑制转移性黑素瘤生长的能力，我们通过高压尾静脉注射，将具有激活的nras突变和p16ink4a缺陷的小鼠黑素瘤细胞注射到apo>hyap
1sa
小鼠中。细胞的高压注射对于在肝脏中建立肿瘤生长是非常有效的，并且其次是肾脏和肺(li等人2011)。为了避免免疫排斥，我们注射了来源于分离自纯c57bl/6tyr:nras
q61k
‑
/+
；ink4a
‑
/
‑
小鼠的自发肿瘤的黑素瘤细胞。在5周后，注射10,000个黑素瘤细胞的小鼠出现肉眼可见的肿瘤，并且在7周后必须安乐死。在细胞注射后3周，我们在饮用水中施用了多西环素以诱导hyap
1sa
在肝细胞中的表达(图7f)。显著地，yap激活后2周，apo>yap
1sa
小鼠显示出肿瘤负荷的极强烈降低(98％)(图g
‑
j)。因此，yap激活的肝细胞促进了高侵袭性nras
‑
突变体转移性黑素瘤细胞的自发消退。
[0240]
2.9.讨论
[0241]
在本文中，我们描述了其中围绕肝肿瘤的正常组织抑制肿瘤生长和存活的新型肿瘤抑制机制。具体地，我们将hippo通路效应因子yap/taz识别为该机制的重要驱动因素。这种新型肿瘤抑制剂机制的存在基于两个重要发现。首先，我们发现yap/taz在具有icc的小鼠的瘤周肝细胞中的缺失导致肿瘤生长加速和肿瘤负荷增加。其次，我们发现yap在瘤周肝细胞中的异位超激活引发了很好确立的hcc、icc模型以及靶向肝脏的黑素瘤转移模型的消除。因此，我们的数据识别了非细胞自主肿瘤抑制机制，借此yap/taz在瘤周肝细胞中的作
用引发了肿瘤生长抑制。
[0242]
值得注意地，我们测试了肝脏中不同的原发性和转移性瘤模型，其代表肝脏中3种最主要的肿瘤类型，即hcc、icc和肝转移。我们发现所有3种肿瘤类型受到瘤周yap激活的抑制。因此，我们在本文中描述的非自主肿瘤抑制剂机制可以是更一般的肿瘤抑制剂途径，至少在肝脏中是。重要地，我们的发现为治疗仍具有有限治疗选择和不良预后的不同类型的肝癌的治疗方法提供了新的方向。另外，考虑到消除转移性疾病代表了现代肿瘤学家所面对的最重要的临床挑战之一，因此它也可以抑制肝转移的发现是特别令人兴奋的并且可以具有深远治疗意义。
[0243]
我们的发现的有趣方面在于肿瘤细胞中yap/taz功能的要求取决于相邻肝细胞中yap/taz的活性水平。因此，我们发现当嵌入野生型肝脏中时，yap/taz对n
‑
akt肿瘤细胞的存活是必不可少的，但是当它们被yap/taz突变体肝细胞围绕时，其对于肿瘤细胞的增殖和存活是非必需的。这种发现表示所建立的肿瘤的癌细胞的存活不固有地需要yap/taz。然而，我们想要指出我们的实验不必需排除yap/taz在肿瘤细胞中的固有作用的存在，如细胞迁移和抗药性。尽管如此，我们的数据的确表明yap/taz对细胞竞争的影响是它们如何促进肿瘤细胞在小鼠肝脏中存活和生长的主要功能。
[0244]
考虑到提出将yap/taz作为癌症疗法的有前景的靶标，我们的结果具有重要意义。我们的发现表明先前对yap/taz在癌症中的功能的研究的解释将受益于考虑yap/taz在肿瘤周围组织中的功能以及yap/taz响应组织体内平衡的破裂，即由于肿瘤形成，而作为细胞竞争驱动因素起作用的可能性。这对于使用肿瘤特异性yap/taz敲除或超激活的动物中的实验是特别重要的。通过在肿瘤环境中抑制yap/taz所引起的肿瘤促进作用还产生了作为抗癌策略的yap/taz的治疗性抑制的潜在副作用问题。
[0245]
在机理上，我们的yap/taz功能丧失数据表明所观察到的肿瘤抑制显示了在野生型小鼠中起作用的内源机制的存在。在健康肝脏中，yap/taz在肝细胞中是无活性且不需要的(lu等人2018)。然而，我们发现yap/taz在围绕生长的肝肿瘤的肝细胞中激活。这通过yap在小鼠和人肝肿瘤的瘤周肝细胞中的核积累，通过对于yap特征富集的基因表达谱的诱导和通过正常休眠的肝细胞的细胞周期再进入得到证明。然后，这种yap/taz激活限制了肿瘤生长，因为瘤周yap/taz缺失加速了肿瘤生长。尽管它减缓了肿瘤生长，但是内源yap/taz激活的量不足以防止过表达n
‑
akt和myc
‑
ras的肿瘤的发生。与这种想法一致，然而，yap在瘤周肝细胞中的额外超激活导致了这些肿瘤的消退。因此，可以通过实验yap过表达来放大内源激活的yap/taz肿瘤抑制强度，从而使其足以防止这些快速生长的肿瘤的生长并且甚至导致它们中的一些的完全去除。另外，据估计在整个生命期间天然出现了数百万的癌细胞，但它们中仅有少量发展成了肿瘤块(bissell&hines 2011；klein 2009)。如何消除这些起源癌细胞仍是未知的，但是在本报告中所述的肿瘤抑制机制足以消除这些肿瘤
‑
起始细胞，其可以表达不如我们在icc和hcc小鼠模型中所使用的那些强的致癌组合。
[0246]
这种非自主肿瘤抑制剂机制如何工作？所观察到的细胞相互作用使人想起细胞竞争，它是其中当面临生长更快或更健康的细胞(称为优胜者细胞(winner cells))时，减缓生长或另外从组织从消除不太健康的细胞(称为失败者细胞(loser cells))的过程(merino等人2016；vincent等人2013)。
[0247]
已在果蝇中识别了少数影响细胞竞争(健康)的信号通路，其中最值得注意的是
myc转录因子和hippo通路(merino等人2016；vincent等人2013)。细胞竞争的特性在于细胞的存活不严格取决于其myc或yorkie(yap/taz的果蝇同源物)的绝对水平，而是取决于与相邻细胞相比的相对水平。因此，在成虫盘(imaginal discs)中，当面临myc或yorkie缺陷型细胞时，野生型细胞是优胜者细胞，但当面临过表达myc或yorkie(这将细胞转化成超级竞争者)的细胞时，野生型细胞是失败者细胞(de la cova等人2004；neto
‑
silva等人2010)。类似地，在我们的实验中，基于周围肝细胞中的yap水平，n
‑
akt和myc
‑
ras肿瘤细胞从优胜者转变为失败者细胞。也就是说，当被野生型肝细胞围绕时，n
‑
akt和myc
‑
ras癌细胞作为优胜者细胞起作用，但是当yap在周围肝细胞中超激活时，作为失败者细胞起作用。本文所报道的数据表明在小鼠肝脏中，肿瘤细胞参加与瘤周肝细胞的竞争性相互作用，借此肿瘤细胞中的yap/taz活性保护它们避免细胞竞争和被周围实质的消除。
[0248]
在果蝇中，具有多种基因型且在不同组织中的肿瘤和过度增殖细胞通常激活yki并且在与相邻野生型细胞的竞争中胜出(merino等人2016；vincent等人2013)。相反，在果蝇的肠中，刺激yki活性和提高干细胞的存活和竞争性可以抑制apc突变体干细胞的过度生长(suijkerbuijk等人2016)。
[0249]
因此，yorkie/yap/taz控制不同果蝇组织和小鼠肝脏中肿瘤细胞和周围正常细胞之间的相互作用，从而产生了保存机制的可能性。然而，我们目前尚不知道yap激活的肝细胞如何引起癌细胞的去除，并且尽管进行了深入的研究，但是识别和引发失败者细胞死亡的细胞竞争机制仍未完全理解。基于遗传证据，已假设它们可以包括机械压力(levayer等人2015；levayer等人2016；wagstaff等人2016)，对于成形素的竞争(moreno等人2002)，通过toll样受体的信号转导(alpar等人2018；meyer等人2014)和氧化还原状态(kucinski等人2017)。我们在肝脏中进行了当前的分析并且类似的肿瘤抑制机制是否在其他器官中起作用仍是未知的。然而，由于细胞竞争存在于多个组织并且是跨门的，因此本文所述的肿瘤抑制机制可以在其他器官中很好地起作用。
[0250]
yap/taz对于它们的生长和肿瘤促进能力是熟知的(harvey等人2013；zanconato等人2016)。因此，yap/taz在肿瘤细胞中的水平升高通常与癌症侵袭性增强以及存活不良有关。yap/taz的这种肿瘤促进作用如何可以与本文中所识别的瘤周肝细胞中的肿瘤抑制作用相调和？yap/taz作为细胞竞争性的促进因素起作用的模型可以解释这种看似矛盾的情况。在该模型中，yap/taz在癌细胞中的活性驱使肿瘤生长和癌症的侵袭性，因为它提高了癌细胞的竞争性，由于它们功能中的固有缺陷，所述癌细胞可以暴露于通过正常相邻细胞所施加的肿瘤抑制作用。作为这种假设的支持，果蝇yap同源物yorkie的异位激活可以挽回异常细胞通过细胞竞争的消除(merino等人2016；vincent等人2013)。的确，具有癌变前遗传畸变(如顶
‑
底极性缺陷)的细胞存活和最终肿瘤形成需要异位yki激活。同样地，例如，皮肤、肠和肺腺癌的起始需要yap/taz(azzolin等人2014；debaugnies等人2018；maglic等人2018；mao等人2017；zanconato等人2015)。因此，在不存在yap激活的情况下，可以通过细胞竞争消除肿瘤前细胞。yap/taz促进细胞竞争性的模型也可以解释肿瘤抑制作用：在本文中，瘤周实质细胞中的yap/taz(超)激活提高了它们的健康程度，同时发挥了对肿瘤细胞更强的肿瘤抑制作用。因此，yap/taz在这两种情况中的功能是相同的，即促进竞争性，但是基于哪种细胞激活yap/taz，所述作用是不同的。
[0251]
总之，我们的数据识别了肝肿瘤和周围实质之间的新的相互作用，借此瘤周肝细
胞感知肿瘤的存在，激活yap依赖性遗传程序并且反过来抑制肿瘤生长。这至少为肝肿瘤生长的抑制或限制提供了新的方向。
[0252]
参考文献
[0253]
agarwala et al.2014,cancer 120:781
‑
789.
[0254]
alpar et al.2018,cell 46:706
‑
719.e705.
[0255]
azzolin et al.2014,cell 158:157
‑
170.
[0256]
bissell&hines 2011,nat med 17:320
‑
329.
[0257]
casazza et al.2014,oncogene 33:1743
‑
1754.
[0258]
claveria et al.2013,nature 500:39
‑
44.
[0259]
damsky et al.2013,oncogene 33:2413.
[0260]
de la cova et al.2004,cell 117:107
‑
116.
[0261]
debaugnies et al.2018.embo rep 19.
[0262]
dobin et al.2013,bioinformatics 29:15
‑
21.
[0263]
dong et al.2007,cell 130:1120
‑
1133.
[0264]
elmore 2007,toxicologic pathology 35:495
‑
516.
[0265]
fan et al.2012,j clin invest 122:2911
‑
2915.
[0266]
fellmann et al.2013,cell reports 5:1704
‑
1713.
[0267]
gabrilovich&nagaraj 2009,nat rev immunol 9:162
‑
174.
[0268]
harvey et al.2013,nat rev cancer 13:246
‑
257.
[0269]
heallen et al.2013,development 140:4683
‑
4690.
[0270]
heallen et al.2011,science 332:458
‑
461.
[0271]
hogan et al.2009,nat cell biol 11:460
‑
467.
[0272]
johnson&haider 2014,nat rev drug discov 13:63
‑
79.
[0273]
kim et al.2013,plos one 8:e75449.
[0274]
klein 2009,proc natl acad sci usa 106:859
‑
863.
[0275]
kon et al.2017,nat cell biol 19:530
‑
541.
[0276]
kressel&groscurth 1994,cell tissue res 278:549
‑
556.
[0277]
kucinski et al.2017,nat commun 8:136.
[0278]
leung&brugge 2012,nature 482；410.
[0279]
levayer et al.2016,current biology 26:670
‑
677.
[0280]
levayer et al.2015,nature 524:476
‑
480.
[0281]
li et al.2011,cancer biol ther 12:737
‑
741.
[0282]
love et al.2014,genome biology 15:550.
[0283]
lu et al.2018,exp mol med 50:e423.
[0284]
madisen et al.2010,nat neurosci 13:133
‑
140.
[0285]
maglic et al.2018,embo j 37:e98642.
[0286]
mao et al.2017,oncotarget 8:110877
‑
110889.
[0287]
marti et al.2015,hepatology 62:1497
‑
1510.
[0288]
martins et al.2014,nature 509:465
‑
470.
[0289]
meng et al.2016,genes dev 30:1
‑
17.
[0290]
merino et al.2016,trends cell biol 26:776
‑
788.
[0291]
meyer et al.2014,science 346:1258236.
[0292]
mootha et al.2003,nat genet 34:267
‑
273.
[0293]
moreno et al.2002,nature 416:755.
[0294]
neto
‑
silva et al.2010,dev cell 19:507
‑
520.
[0295]
pei et al.2015,oncotarget 6:17206
‑
17220.
[0296]
quail&joyce 2013,nat med 19:1423
‑
1437.
[0297]
saeed et al.2003,biotechniques 34:374
‑
378.
[0298]
seehawer et al.2018,nature 562:69
‑
75.
[0299]
sherman&mahvi 2014,53
‑
liver metastases.in abeloff's clinical oncology(fifth edition),j.e.niederhuber,j.o.armitage,j.h.doroshow,m.b.kastan,and j.e.tepper,eds.(philadelphia:content repository only！),pp.778
‑
793.e773.
[0300]
shi et al.2017,nat rev drug discov 16:35
‑
52.
[0301]
sohn et al.2016,clin cancer res 22:1256
‑
1264.
[0302]
subramanian et al.2005,proc natl acad sci usa 102:15545
‑
15550.
[0303]
suijkerbuijk et al.2016,curr biol 26:428
‑
438.
[0304]
ungefroren et al.2011,cell commun signaling 9:18
‑
18.
[0305]
villa del campo et al.2014,cell rep 8:1741
‑
1751.
[0306]
vincent et al.2013,nat rev mol cell biol 14:581
‑
591.
[0307]
wagstaff et al.2016,nat commun 7:11373.
[0308]
wang et al.2010,mol ther 18:118
‑
125.
[0309]
wang et al.2017,dev cell 42:462
‑
478.e467.
[0310]
xin et al.2013,proc natl acad sci usa 110:13839
‑
13844.
[0311]
xin et al.2011,sci signal 4,ra70.
[0312]
yanger et al.2013,genes dev 27:719
‑
724.
[0313]
zanconato et al.2016,cancer cell 29:783
‑
803.
[0314]
zanconato et al.2015,nat cell biol 17:1218
‑
1227.
[0315]
zhang et al.2017,proc natl acad sci usa 114:498
‑
503.
[0316]
zhang et al.2010,dev cell 19:27
‑
38.
[0317]
zhao et al.2008,genes dev 22:1962
‑
1971。