一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用

一种冠状病毒主蛋白酶3clpro抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种冠状病毒主蛋白酶3clpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒主蛋白酶3clpro也被称为3c
‑
like protease(3clpro)，因为其切割位点的特异性与微小rna病毒(picornavirus)的3c蛋白酶(3c protease)很相似，两者并称为3clpro。3clpro能够处理病毒中的多聚蛋白，病毒rna在进入人类细胞后最初被翻译成为多聚蛋白。3clpro蛋白酶可从多聚蛋白中切割出12个更小的蛋白，而这些蛋白质将会参与病毒rna的复制。由于3clpro作为一个重要的蛋白酶，在抑制病毒复制的过程中起到了至关重要的作用且人体内没有同源蛋白，故3clpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点，此外，3clpro在β冠状病毒中保守性高，筛选出的3clpro抑制剂具有一定程度的广谱抗冠状病毒能力。目前还没有发现具有疗效好、特异性高的小分子冠状病毒主蛋白酶3clpro抑制剂。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种冠状病毒主蛋白酶3clpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。
4.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
5.一种冠状病毒主蛋白酶3clpro抑制剂，其特征在于：抑制剂含具有抗炎作用的药物、天然产物中的一种或几种。
6.所述抑制剂含拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分中的一种或几种。
7.所述的拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分别为如下结构所示的药物：
[0008][0009]
其中：r1为h或ch3；r2为h，och3，och2och3或o
‑
c
‑
f3；r3为h，ch3或och3；r4为h，och3，ochf2或吡咯环；
[0010]
所述拉唑类药物为艾普拉唑、埃索美拉唑、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、兰索拉唑或泮托拉唑，具体结构式为：
[0011][0012]
所述抑制剂含从姜科姜黄属植物、龙胆科獐芽菜属植物、爵床科穿心莲属植物、毛茛科翠雀属植物、马鞭草科牡荆属植物中提取出的化合物及其异构体或白皮杉醇或茶黄素。
[0013]
所述从姜科姜黄属植物蓬莪术中提取出来的二苯庚烯类化合物如结构式(i)所示化合物或其异构体；
[0014]
[0015]
其中，r1和r3可相同或不同的选自h或och3；r2，r4和r5可相同或不同的选自h或oh；
[0016]
从龙胆科獐芽菜属植物瘤毛獐牙菜或茄科假酸浆属植物假酸浆中提取出来的苯并色原酮类化合物如结构式(ii)所示化合物或其异构体
[0017][0018]
其中：r1为h，d
‑
葡萄糖或oh；r2，r3和r5可相同或不同的选自h或oh；r4为h，och3或oh；
[0019]
从爵床科穿心莲属植物穿心莲或毛茛科翠雀属植物翠雀中提取，或者通过穿心莲内酯为基本母核合成得到的二萜类化合物，n大于等于1，如结构式(iii)所示化合物或其异构体：
[0020][0021]
其中，r1为h，(ch2)
n
oh，ch3，酰胺或r2为h，oh或r3为h或oh；
[0022]
从马鞭草科牡荆属植物蔓荆子中提取出来的黄酮类化合物，如结构式(iv)、(v)所示化合物或其异构体
[0023][0024]
其中，r1为h，oh，d
‑
葡萄糖，l
‑
鼠李糖，芸香糖或r2，r3和r5各自独立地为h或oh；r4为h，oh或och3；r6为h，oh，d
‑
葡萄糖，l
‑
鼠李糖或芸香糖；
[0025]
白皮杉醇结构式为(vi)，茶黄素结构式为(vii)，
[0026][0027]
所述天然产物为如下化合物1～16中任一种或该化合物的异构体；
[0028]
[0029]
[0030][0031]
所述抑制剂在制备靶向冠状病毒主蛋白酶3clpro的抗病毒药物中的应用。
[0032]
所述的含有冠状病毒蛋白酶3clpro的病毒包括：多种冠状病毒，如新型冠状病毒、sars病毒、mers病毒等。
[0033]
所述抗病毒药物含所述抑制剂和药学上可接受的载体。
[0034]
所述的抗病毒药物的剂型为口服剂型、注射剂型和外用剂型。
[0035]
所述的在药学上可接受的载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药剂型的载体。给药方式可根据临床需要选择口服、注射或者局部外用，根据给药途径的选择相应的药物剂型，口服剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、微丸剂、微片剂、含片，注射剂型包括粉针剂、注射液、脂质体微球注射液，外用剂包括溶液、混悬液、乳剂等。
[0036]
本发明技术方案的有益效果及特点：
[0037]
本发明针对冠状病毒主要蛋白酶3clpro的抑制剂为天然产物或对该蛋白酶具有抑制性的药物。本发明抑制剂能有效地抑制疗冠状病毒蛋白酶3clpro，可以用于制备抗病毒药物；可根据临床需要选择不同的给药方式或者剂型。
[0038]
本发明获得具有抗炎作用的药物以及天然产物，如拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔以及天然产物与冠状病毒蛋白酶3clpro，具有较强的结合亲和力并且直接抑制冠状病毒主蛋白酶3clpro的酶活性。并且基于酶活性评价体系和mst结合力测定试验可见上述药物与冠状病毒蛋白酶3clpro具有较强的结合亲和力并且直接抑制冠状病毒蛋白酶3clpro的酶活性，可以作为冠状病毒蛋白酶3clpro的抑制剂并用于抗病毒药物的制备。
附图说明
[0039]
图1为本发明实施例1提供的重组冠状病毒蛋白酶3clpro的体外酶促表征和酶抑制试验。
[0040]
(a)冠状病毒主蛋白酶3clpro的底物饱和曲线。
[0041]
(b)冠状病毒主蛋白酶3clpro的ec50测定曲线。
[0042]
(c)拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔对冠状病毒蛋白酶3clpro抑制活性的量效曲线。
[0043]
图2为本发明实施例2提供的mst方法测定拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3clpro之间的结合亲和力。
[0044]
图3为本发明实施例3提供的重组冠状病毒蛋白酶3clpro的体外酶促表征和酶抑制试验。
[0045]
(a)冠状病毒主蛋白酶3clpro的底物饱和曲线。
[0046]
(b)冠状病毒主蛋白酶3clpro的ec
50
测定曲线。
[0047]
(c)天然产物对冠状病毒蛋白酶3clpro抑制活性的量效曲线。
[0048]
图4为本发明实施例4提供的mst方法测定天然产物与冠状病毒蛋白酶3clpro之间的结合亲和力。
具体实施方式
[0049]
通过结合以下实施例对本发明作进一步阐释，同时便于本领域技术人员深入理解对使用到的实验方法与核心思想作较为详尽的描述。
[0050]
下述酶活性评价试验是在50mm tris
‑
hcl(ph7.3)，1mm edta条件下进行的，首先用一定浓度的dmso配制一系列浓度的待检测药物溶液，将3clpro蛋白溶液稀释到所需浓度，底物(mca
‑
avlqsgfr(dnp)
‑
lys
‑
nh2)溶于水中，配制成浓度为22μm的溶液，需要注意的是底物溶液需要现用现配。药物与3clpro蛋白于室温下反应1小时，利用酶标仪进行荧光检测。检测时先加入底物溶液，后加入药物与3clpro蛋白反应后的混合溶液，启动程序进行检测。检测结果利用graphpad prism 7.0软件进行分析，拟合回归曲线得到ic
50
值，ic
50
数值越小，表示该药物对3clpro蛋白的抑制作用越强。
[0051]
mst结合力测定试验是利用nano temper完成，在50mm hepes(ph7.3)和1mm edta条件下进行，首先用一定浓度的dmso配制一系列不同浓度的待检测药物溶液，用buffer将3clpro蛋白稀释到所需浓度，加入染料后于暗处染色30min，完成后用空间排阻柱对3clpro蛋白进行分离，收集分离后蛋白，并用nano temper对其进行检测，得到荧光吸收较好的3clpro蛋白，该3clpro蛋白与药物室温反应10min，再次利用nano temper进行检测，检测结果利用分析软件mo.affinityanalysis_x86进行处理，导入微量热泳动曲线，拟合出平衡解离常数k
d
值。k
d
值越小，表示药物和3clpro蛋白的结和力越强。
[0052]
基于酶活性评价体系以及靶向性验证，拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔能够靶向性的抑制冠状病毒蛋白酶3clpro活性。
[0053]
实施例1
[0054]
酶活性评价体系确定拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔靶向抑制冠状病毒蛋白酶3clpro活性
[0055]
一、冠状病毒蛋白酶3clpro的蛋白表达纯化；
[0056]
冠状病毒蛋白酶3clpro(ncbi id 43740578)的表达和纯化的详细步骤参考本领域公开的文献记载方法(doi：10.1126/science.1085658)。将编码冠状病毒蛋白酶3clpro氨基酸3264
‑
3569的基因序列，克隆到带有n端分泌信号肽和c端his标签的pgex
‑
6p
‑
1载体中。将表达质粒转化到感受态细胞e.coli bl21(de3)condon plus中，均匀涂布于带有氨苄抗性的固体平板上，37℃培养过夜。利用菌斑先培养少量细菌，而后进行大量培养，培养前加入相应抗生素，37℃培养4小时后，加iptg，并于18℃下诱导表达16小时。在4100rpm/min下离心10min收集沉淀下来的细菌。利用lysis buffer(20mm tris
‑
hclph8.0，300mm nacl)重悬菌体，进行破碎。破碎后离心21500rpm/min，30min。取上清，其中加入终浓度为10mm咪唑，利用ni
‑
nta琼脂糖亲和色谱进行纯化。上清液过后，wash buffer(buffera)洗杂10ml(20mm tris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl,10mm咪唑)，用wash buffer(buffera)将ni
‑
nta重悬起来，加入3c酶后定容至10ml，进行柱上酶切过夜。酶切后的上清溶液通过ni
‑
nta琼脂糖亲
和色谱法继续纯化。wash buffer(buffera)洗脱10ml(20mm tris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl,10mm咪唑)，elution buffer(bufferb)洗脱10ml(20mm tris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl,150mm咪唑)，将流穿液和wash buffer(buffera)收集起来进行浓缩，然后进行分子筛纯化(50mmtris
‑
hcl ph7.3,1mm edta)分离得到冠状病毒主蛋白酶3clpro。经过上述分离纯化过程，最终得到均一性好、纯度高的3clpro蛋白。
[0057]
二、酶活性体系评价拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔靶向抑制冠状病毒蛋白酶3clpro；
[0058]
酶抑制活性是通过连续动力学分析来测定拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔对冠状病毒蛋白酶3clpro的抑制活性。底物mca
‑
avlqsgfr
‑
lys(dnp)
‑
lys
‑
nh2(gl biochem)，分别使用320nm和405nm的激发和发射波长进行测定。将上述所得3clpro蛋白用50mmtris
‑
hcl ph7.3，1mm edta稀释至148nm，同时对所筛选化合物设置不同浓度梯度，设有浓度10个，数值依次为100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.563μm、0.7810μm、0、3906μm、0.1953μm，3clpro蛋白与上述各不同浓度的药物分别于20℃孵育1小时。孵育完成后立即与底物(22μm)混合，进行酶活性测定，其测定结果如表1所示。
[0059]
使用biotek synergy h1酶标仪在室温下，检测0
‑
100μm不同浓度下mca
‑
avlqsgfr
‑
lys(dnp)
‑
lys
‑
nh2释放的荧光团的量及随时间增加的相对荧光强度升高速率(rfu/min)(图1a和1b)。由图1a初始速率vi(δrfu/min中)与不同浓度的荧光底物mca
‑
avlqsgfr
‑
lys(dnp)
‑
lys
‑
nh2的关系，通过关系数据拟合到伪一阶速率曲线来确定vmax和km，从而得出计算值和最佳拟合曲线，即km＝27.24μm，vmax＝23.55fru/min，相应的最佳拟合曲线如图1
‑
a所示。图1b通过曲线来确定冠状病毒主蛋白酶3clpro最适反应浓度。将数据导入graphpad prism 5.01拟合回归方程计算ic
50
值，所述的回归是ic
50
＝ki*(1+[s]/km)，其中ki代表初始反应速率，[s]代表底物浓度。
[0060]
由上述获得回归方程计算获得各待测药物的酶活性结果如表1和图1c所示。
[0061]
表1所测试药物对3clpro蛋白的ic
50
值
[0062]
[0063]
由图1c中各药物抑制活性的量效曲线以及计算获得ic
50
值，通过数值表明拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔可以显著抑制3clpro重组蛋白的酶活性。
[0064]
实施例2
[0065]
由上述实施例确定具有显著抑制3clpro重组蛋白酶活性的药物，再进一步对其与冠状病毒蛋白酶3clpro的结合亲和力进行检测，以表1中记载拉唑类药物为例，具体为：
[0066]
1、冠状病毒蛋白酶3clpro表达和纯化
[0067]
方法同实施例1冠状病毒蛋白酶3clpro表达和纯化。
[0068]
2、微量热泳动法测定拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3clpro的结合亲和力
[0069]
微型热泳(mst)是一种基于荧光检测和热泳的技术，用于检测蛋白质
‑
蛋白质或蛋白质
‑
小分子的相互作用。为了进一步验证酶活性测定的结果，使用mst方法评估拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3clpro之间的结合亲和力(参见表2和图2)。
[0070]
表2所测试药物与3clpro的结合解离常数(k
d
)
[0071][0072]
由上述表2和图2分析得各拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3clpro的结合解离常数(k
d
)，由结合解离常数(k
d
)表明拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3clpro具有很强的结合亲和力。
[0073]
基于酶活性评价体系以及靶向性验证，天然产物能够靶向性的抑制冠状病毒蛋白酶3clpro活性。
[0074]
实施例3
[0075]
酶活性评价体系确定天然产物靶向抑制冠状病毒蛋白酶3clpro活性
[0076]
一、冠状病毒蛋白酶3clpro的蛋白表达纯化
[0077]
冠状病毒蛋白酶3clpro(ncbi id 43740578)的表达和纯化的详细步骤参考本领域公开的文献记载的方法(doi：10.1126/science.1085658)。将编码冠状病毒蛋白酶3clpro氨基酸3264
‑
3569的基因序列，克隆到带有n端分泌信号肽和c端his标签的pgex
‑
6p
‑
1载体中。将表达质粒转化到感受态细胞e.coli bl21(de3)condon plus中，均匀涂布于带有氨苄抗性的固体平板上，37℃培养过夜。利用菌斑先培养少量细菌，而后进行大量培养，培养前加入相应抗生素，37℃培养4小时后，加iptg，并于18℃下诱导表达16小时。在4100rpm/min下离心10min收集沉淀下来的细菌。利用lysis buffer(20mmtris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl)重悬菌体，进行破碎。破碎后离心21500rpm/min，30min。取上清，其中加入终浓度为10mm咪唑，利用ni
‑
nta琼脂糖亲和色谱进行纯化。上清液过后，wash buffer(buffera)
洗杂10ml(20mmtris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl,10mm咪唑)，用wash buffer(buffera)将ni
‑
nta重悬起来，加入3c酶后定容至10ml，进行柱上酶切过夜。酶切后的上清溶液通过ni
‑
nta琼脂糖亲和色谱法继续纯化。wash buffer(buffera)洗脱10ml(20mmtris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl,10mm咪唑)，elution buffer(bufferb)洗脱10ml(20mmtris
‑
hcl ph8.0，300mm nacl，150mm咪唑)，将流穿液和wash buffer(buffera)收集起来进行浓缩，然后进行分子筛纯化(50mmtris
‑
hcl ph7.3,1mm edta)分离得到冠状病毒主蛋白酶3clpro。经过上述分离纯化过程，最终得到了均一性好、纯度高的3clpro蛋白。
[0078]
二、酶活性体系评价天然产物靶向抑制冠状病毒蛋白酶3clpro
[0079]
酶抑制活性是通过连续动力学分析来测定天然产物对冠状病毒蛋白酶3clpro的抑制活性。底物mca
‑
avlqsgfr
‑
lys(dnp)
‑
lys
‑
nh2(gl biochem)，分别使用320nm和405nm的激发和发射波长进行测定。将所得3clpro蛋白用50mmtris
‑
hcl ph7.3,1mm edta稀释至148nm，同时对所筛选天然产物设置不同浓度梯度，设有浓度10个，数值依次为100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.563μm、0.7810μm、0、3906μm、0.1953μm，而后将蛋白与上述设置不同浓度的各天然产物分别于20℃孵育1小时。孵育完成后立即与底物(22μm)混合，进行酶活性测定，其测定结果如表3所示。
[0080]
使用biotek synergy h1酶标仪在室温下，检测0
‑
100μm不同浓度下mca
‑
avlqsgfr
‑
lys(dnp)
‑
lys
‑
nh2释放的荧光团的量及随时间增加的相对荧光强度升高速率(rfu/min)(图3a和3b)。
[0081]
由图3a具体体现初始速率vi(δrfu/min中)与不同浓度的荧光底物mca
‑
avlqsgfr
‑
lys(dnp)
‑
lys
‑
nh2的关系，通过将实验数据拟合到伪一阶速率曲线来确定vmax和km，从而得出计算值和最佳拟合曲线，即km＝27.24μm，vmax＝23.55fru/min，相应的最佳拟合曲线如图1
‑
a所示。图1b通过曲线来确定冠状病毒主蛋白酶3clpro最适反应浓度。将数据导入graphpad prism 5.01拟合回归方程计算ic
50
值，所述回归方程为ic
50
＝ki*(1+[s]/km)，其中ki代表初始反应速率，[s]代表底物浓度。
[0082]
由上述获得回归方程计算获得各待测药物的酶活性，如表3和图3c所示。。
[0083]
表3天然产物对3clpro蛋白的ic
50
值
[0084][0085]
由图3c中各药物抑制活性的量效曲线以及计算获得ic
50
值，通过数值表明这几种天然产物可以显著抑制3clpro重组蛋白的酶活性。
[0086]
实施例4
[0087]
由上述实施例3获得具有显著抑制3clpro重组蛋白的酶活性的天然物质再进一步对其与冠状病毒蛋白酶3clpro的结合亲和力进行检测，以表3中记载天然产物为例，具体为：
[0088]
1、冠状病毒蛋白酶3clpro表达和纯化
[0089]
方法同实施例1冠状病毒蛋白酶3clpro表达和纯化。
[0090]
2、微量热泳动法测定天然产物与冠状病毒蛋白酶3clpro的结合亲和力
[0091]
微型热泳(mst)是一种基于荧光检测和热泳的技术，用于检测蛋白质
‑
蛋白质或蛋白质
‑
小分子的相互作用。为了进一步验证酶活性测定的结果，使用mst方法评估天然产物与冠状病毒蛋白酶3clpro之间的结合亲和力(参见图4和表4)。
[0092]
表4天然产物与3clpro的结合解离常数(k
d
)
[0093][0094]
由图4和表4分析得到了天然产物与冠状病毒蛋白酶3clpro的结合解离常数(k
d
)，表明这几种天然产物与冠状病毒蛋白酶3clpro具有很强的结合亲和力。
[0095]
进而本发明所获得药物以及天然产物能有效地抑制疗冠状病毒蛋白酶3clpro，可以用于制备抗病毒药物，可根据临床需要选择不同的给药方式或者剂型。