一种共生菌组合发酵物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品技术领域，涉及一种共生菌组合发酵物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物发酵原料在皮肤护理制剂包括化妆品领域的应用越来越多，近两年酵素化妆品受到了消费者的追捧。发酵是纯生物的过程，中间没有任何化工成分的添加。发酵让活性物质更加容易溶出，通过发酵将全部活性成分提取出来，会产生新的营养素，让营养成分更加均衡，使营养成分小分子化，活性更强，可被皮肤快速吸收。发酵微生物中本身含有很多酶类和微量元素，有补充增效作用。符合消费者对于“天然、健康、高效”护肤品的期待。
3.酵母菌是目前应用在化妆品发酵原料领域最多的菌株，酵母提取物具有天然、安全、强效的保湿功效。酵母细胞中含有丰富的天然保湿因子(nmf)，如氨基酸、肽类、钠、钾、镁等矿物元素。嗜热栖热菌(thermusthermophilus)是一种耐热菌，能产生热稳定性的超氧化物歧化酶(sod)和b族维生素。超氧化物歧化酶可以将o2氧化成h2o2，避免生物体被氧化损伤，起到皮肤抵抗自由基侵害，延缓衰老的功效。b族维生素可以减轻皮肤炎症反应，抵抗日光的损害，促进细胞再生，b族维生素还是很多酶和辅助酶分子结构的一部分，可促进氨基酸的代谢以保持皮肤健康。
4.cn109276486a公开了一种保湿抗衰老的酵母发酵提取物的复合物及其制备方法，该发酵复合物由以下成分组成：酵母发酵产物提取物、酵母菌川谷籽发酵产物滤液、余量为酵母菌昆布糖发酵产物，其中酵母发酵产物提取物占组合物总重量配比为20-30％，酵母菌川谷籽发酵产物滤液占组合物总重量配比为20-30％，余量为酵母菌昆布糖发酵产物，该专利申请虽然提取了川谷籽和昆布的部分活性，但是提取效率不高。cn104586735a公开了一种干酪乳杆菌发酵大米制备发酵产物滤液的方法及其应用，该方法首先对培养基加热灭菌，而后将干酪乳杆菌接种到培养基中，再发酵，过滤，得到发酵产物滤液，随后调节发酵产物滤液的ph值，灭菌，得到发酵产物滤液；该专利申请提供的发酵方法同样存在着提取效率较低，大部分活性物质并不能发挥其作用。
5.因此，需要开发一种发酵滤液具有较高的活性，可以发挥有益的功效。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种共生菌组合发酵物及其制备方法和应用。本发明提供的共生菌组合发酵物具有较高的生物活性，更易被皮肤吸收，对皮肤的改善效果更优异。本发明的共生菌组合发酵物用于护肤品中，可以修复皮肤屏障，改善皮肤细纹、干纹，提升皮肤弹性，并且还具有保湿、舒缓、消炎、抗氧化抗皱和美白提亮等功效。
7.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种共生菌组合发酵物，所述共生菌包括如下组分：裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌；
9.所述发酵的原料包括大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻。
10.本发明通过利用共生菌组合发酵大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻五种物质，相比于单一菌种进行单一物质的发酵，本发明的共生菌组合发酵，各菌种之间协同增效，可以起到互相诱导活化的作用，可以显著提高发酵产物的活性。
11.在本发明中，人参发酵物具有增强皮肤免疫力，可以激发皮肤防御、抗光老化、舒缓止痒，促进皮肤生态修复，可以消炎、调节皮肤炎症因子；加快皮肤表皮修复与重建；促进皮肤真皮组织再生，而覆盆子具有抗菌，抗敏修复皮肤红斑过敏的功效；巨藻也具有舒缓抗刺激的特点，三者协同增效，可以修复皮肤屏障提高皮肤的免疫力和耐受力；同时，大米发酵物具有保湿美白去皱的功效，川谷籽发酵物具有抗氧化，美白，抑制黑色素合成，美白淡斑的功效；同时可以促进肌肤新陈代谢、抵抗衰老，保湿润肤；并且巨藻也具有抑制金属蛋白酶表达的特点，因此大米、川谷籽、人参和巨藻协同增效，可以使本发明提供的发酵物具有美白提亮、抗氧化抗皱、保湿、舒缓消炎等功效。
12.本发明所述的发酵的原料指的是在已经具有足够数量和活性的菌种中加入的待发酵的原料，至于对于菌种的培养增菌活化等过程所采用的培养基，可选用现有技术中常用的培养基。
13.在本发明中，所述大米、川谷籽和人参的质量比为(40-60):(40-60):1。
14.所述40-60可以是42、44、45、46、48、50、52、54、55、56、58等。
15.所述40-60可以是42、44、45、46、48、50、52、54、55、56、58等。
16.优选地，所述覆盆子、巨藻和人参的质量比为(20-30):(20-30):1。
17.所述20-30可以是22、24、25、26、28等。
18.所述20-30可以是22、24、25、26、28等。
19.优选地，所述嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌的质量比为(3-9):(2-5):(1-3)，进一步优选3:2:1。
20.所述3-9可以是3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5等。
21.所述2-5可以是2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8等。
22.所述1-3可以是1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8等。
23.当本发明的菌种质量比在上述范围内时，最后发酵产物的活性最佳，任何一种菌种的含量不在本发明限定范围内时，最后发酵物的活性会稍有降低。
24.优选地，所述嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌的质量和为所述大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻的质量和的10-15％，例如10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％等。
25.当菌种添加量过低时，无法达到较好的发酵效果，当菌种添加过量是，在一定的发酵时间内，可能会由于菌种量过高，培养液无法满足菌种代谢，而导致菌种之间的相互竞争，反而会导致发酵物活性较低。
26.优选地，所述裂褶菌的质量为所述大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻的质量和的10-15％，例如10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％等。
27.对于裂裥菌而言，其有效成分主要为裂裥菌素，其具有较好的保湿效果，其添加量若过高，同样会导致菌群之间的相互竞争，进而导致裂褶菌素的含量较少，而其添加量过少也同样会导致裂褶菌素的含量较少，使共生菌组合发酵物的保湿效果降低。
28.本发明的大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻可以是现有技术中对于护肤化妆品中
常用的原材料，大米分为籼米、粳米、粘米几种，也可以是糙米、精米、加工米等，均可以应用于本发明，川谷籽，也称为薏苡仁、薏仁等，人参可以选择长白山人参等，也可以选择白参。本发明的覆盆子可以为安徽、江苏、浙江等地的覆盆子，所述巨藻可以为山东长岛县提供的巨藻。
29.优选地，所述大米选自籼米、粳米或粘米中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选籼米。
30.本发明优选籼米，可以是长粒香米、泰国香米等，其具有较高的蛋白质含量，利用共生菌发酵得到的发酵物具有较高的活性，进而有较好的应用效果。
31.优选地，所述人参选自野山参、林下参、移山参、池底参、园参、高丽参、花旗参或西洋参中的任意一种或至少两种的组合。
32.优选地，所述人参选自白参。
33.优选地，所述酵母菌选自啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤氏酵母或红酵母中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选啤酒酵母。
34.优选地，所述乳酸杆菌选自干酪乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌或嗜热乳酸杆菌中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选嗜酸乳酸杆菌。
35.当本发明优选啤酒酵母和嗜酸乳酸杆菌时，二者的发酵环境以及二者活性较高，更有利于得到发酵物。
36.第二方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的共生菌组合发酵物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
37.(1)将大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻粉碎并加水，得到待发酵液，并进行灭菌处理；
38.(2)灭菌后的待发酵液接种酵母菌和乳酸杆菌进行第一次发酵，然后加入裂裥菌进行第二次发酵，最后加入嗜热栖热菌进行第三次发酵，得到所述共生菌组合发酵物。
39.本发明虽然为共生菌组合发酵，但是考虑到不同菌种的不同生活环境，因此，本发明的发酵过程分步进行，首先使酵母菌和乳酸杆菌增菌发酵，然后加入裂裥菌进行发酵，酵母菌和乳酸杆菌对裂裥菌有诱导活化作用，可以增加裂裥菌素的产生，而产生的裂裥菌素又对酵母菌和乳酸杆菌有进一步促进作用，促进二者对原料的发酵，最后加入嗜热栖热菌，酵母菌对嗜热栖热菌同样具有诱导活化的作用，因此，最后得到的发酵物活性极高。
40.本发明的大米、川谷籽和人参可以是现有技术中对于护肤化妆品中常用的原材料，大米分为籼米、粳米、粘米几种，也可以是糙米、精米、加工米等，均可以应用于本发明，川谷籽，也称为薏苡仁、薏仁等，人参可以选择长白山人参等，也可以选择人参的熟用品红参。
41.对于待发酵液的制备，可以将大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻分别粉碎，然后混合并加水过滤，进行灭菌处理，得到待发酵液。
42.在本发明中，对于酵母菌、乳酸杆菌、嗜热栖热菌和裂裥菌的培养使其数量和活性满足接种要求的方式并不做具体限定，现有技术中的常用的方式均可以采用，示例性的列举几种常见方式：
43.酵母菌的培养：将保藏的酵母菌取斜面菌种于dyp培养基中，25℃培养24h后，然后将菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基(马铃薯20.0g、葡萄糖2.0g，琼脂2.0g，蒸馏水100ml，自
然ph，可按比例放大)上，在30℃下培养24h，得到具有足够多的数量和活性的酵母菌。
44.乳酸杆菌的培养：将菌种接种于mrs培养基(蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，吐温-80 1.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，自然ph，可按比例放大)上，在30℃下培养24h，得到具有足够多的数量和活性的乳酸杆菌。
45.嗜热栖热菌的培养：取嗜热栖热菌hb27冻存液2ml接入装有2l培养液(20l培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸镁、1g无水氯化铁、5g氯化钠，ph值用酸或碱进行调节控制，水补足到20l，不同量的培养液按比例进行缩小或方法，ph为7.8
±
0.2)的2.5l三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50l，150rpm，65℃培养12h左右，得到嗜热栖热菌活化液。
46.裂裥菌的培养：马铃薯200g/l、葡萄糖20-30g/l、氯化钠10-20g/l、琼脂15-20g/l制成平板培养基，把裂褶菌菌种接种到该平板培养基上，于20-30℃恒温培养箱内培养4-10天得到平板菌丝体；然后将马铃薯淀粉50-200g/l、葡萄糖20-60g/l、酵母浸膏1-10g/l、酵母浸粉1-10g/l、水制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/5-1/3，上述得到的平板菌丝体接种该摇瓶，于20-30℃恒温摇床内100-220rpm震荡培养4-10天，得到具有足够多的数量和活性的裂裥菌。
47.在本发明中，菌种的选择可以为任意选择，例如嗜热栖热菌可以利用美国模式菌种收集中心(atcc)的保藏号为baa-163的嗜热栖热菌hb27。
48.优选地，在所述待发酵物中，水的加入量为所述大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻质量和的1.5-2倍，例如1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍等。
49.优选地，所述酵母菌的接种量为所述大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻质量和的2-5％，例如2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％等。
50.优选地，所述乳酸杆菌的接种量为所述大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻质量和的1-3％，例如1.5％、2％、2.5％等。
51.优选地，所述嗜热栖热菌的接种量为所述大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻质量和的3-9％，例如3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％等。
52.优选地，所述第一次发酵的ph值为4.0-5.0，例如4.2、4.5、4.7。
53.优选地，所述第一次发酵的温度为25-35℃，例如27℃、29℃、30℃、32℃、34℃等，时间为20-25h，例如22h、23h、24h等。
54.优选地，在所述第二次发酵前，利用精氨酸调节ph。
55.优选地，所述第二次发酵的ph值为6.0-7.0，例如6.2、6.5、6.8等。
56.优选地，所述第二次发酵的温度为25-35℃，例如27℃、29℃、30℃、32℃、34℃等，时间为20-25h，例如21h、23h、24h等。
57.优选地，在所述第三次发酵前，利用精氨酸调节ph为碱性。
58.优选地，所述第三次发酵的ph值为7.5-8.5，例如7.8、8、8.2等。
59.优选地，所述第三次发酵的方式为先在30-40℃(例如32℃、35℃、37℃等)下发酵20-25h(例如22h、23h、24h等)，然后在55-60℃(例如57℃、58℃、59℃等)下发酵15-20h(例如16h、18h、19h等)。
60.乳酸杆菌和酵母菌在酸性条件下活性最高，先令二者进行发酵，然后调节ph为
6.0-7.0，此时裂裥菌活性最高，最后调节ph为碱性时，嗜热栖热菌活性最高，通过这样梯度调节ph，可以确保各组分菌种均能发挥其最大作用，并且还可以相互促进，诱导活化，使最后的发酵物活性最高。
61.在实际操作过程中，可将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为4.0-5.0，然后转移至种子罐中，并接种酵母菌和乳酸杆菌，维持一定通气量，以100-200rpm搅拌转动，25-35℃培养20-25h；然后再次利用精氨酸调节ph为6.0-7.0，加入裂裥菌，维持一定通气量，以100-200rpm搅拌转动，25-35℃培养20-25h；最后调节ph为7.5-8.5，加入嗜热栖热菌，维持一定通气量，以100-200rpm搅拌转动，30-40℃培养20-25h后55-60℃下发酵15-20h，得到发酵液，进行后续常规的提纯、灭菌等工序，得到共生菌组合发酵物。
62.优选地，所述制备方法还包括第三次发酵后冷却至室温，然后进行过滤、纯化、灭菌，得到所述共生菌组合发酵物。
63.在本发明中，将经过第三次发酵后的发酵物，先进行过滤，取上层清液，然后加入活性炭，进行吸附纯化处理，完成过后进行固液分离(可以过滤)，取清液，最后经过灭菌，得到所述共生菌组合发酵物。
64.第三方面，本发明提供了根据第一方面所述的共生菌组合发酵物在护肤品中的应用。
65.本发明具有的共生菌组合发酵物具有优异的修复皮肤屏障，改善皮肤细纹、干纹的特点，同时提升皮肤弹性，还具有保湿、舒缓、消炎、抗氧化抗皱和美白提亮等功效，因此，可以应用于护肤品中。
66.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
67.(1)本发明通过利用共生菌共同发酵大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻五种物质，相比于单一菌种进行单一物质的发酵，本发明的共生菌组合发酵，各菌种之间协同增效，可以起到互相诱导活化的作用，可以显著提高发酵产物的活性；
68.(2)在本发明中，人参发酵物具有增强皮肤免疫力，可以激发皮肤防御、抗光老化、舒缓止痒，促进皮肤生态修复，可以消炎、调节皮肤炎症因子；加快皮肤表皮修复与重建；促进皮肤真皮组织再生，而覆盆子具有抗菌，抗敏修复皮肤红斑过敏的功效；巨藻也具有舒缓抗刺激的特点，三者协同增效，可以修复皮肤屏障提高皮肤的免疫力和耐受力；同时，大米发酵物具有保湿美白去皱的功效，川谷籽发酵物具有抗氧化，美白，抑制黑色素合成，美白淡斑的功效；同时可以促进肌肤新陈代谢、抵抗衰老，保湿润肤；并且巨藻也具有抑制金属蛋白酶表达的特点，因此大米、川谷籽、人参和巨藻协同增效，可以使本发明提供的发酵物具有美白提亮、抗氧化抗皱、保湿、舒缓消炎等功效；
69.(3)乳酸杆菌和酵母菌在酸性条件下活性最高，先令二者进行发酵，然后调节ph为6.0-7.0，此时裂裥菌活性最高，最后调节ph为碱性时，嗜热栖热菌活性最高，通过这样梯度调节ph，可以确保各组分菌种均能发挥其最大作用，并且还可以相互促进，诱导活化，使最后的发酵物活性最高；
70.(4)本发明提供的护肤组合物具有修复皮肤屏障，刺激细胞再生，促进细胞生长的效果，同时，还具有保湿、美白提亮、提高皮肤弹性、消炎舒缓、抗氧化防皱的功效；其中，经皮失水变化率在100％以下(测试前为100％)，说明本发明提供的共生菌组合发酵物正在缓慢修复皮肤屏障；弹性蛋白表达量在5.8以上，表明本发明提供的共生菌组合发酵物促进了
细胞生长，正在修复皮肤屏障，增加皮肤弹性；且水分保持率较高，在83.3％以上，超氧阴离子自由基清除率在91％以上；黑色素生成抑制率在51％以上，提亮功效在114％以上，同时，消炎因子明显降低。
具体实施方式
71.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
72.制备例1
73.一种共生菌组合发酵物，制备方法如下：
74.(1)将33.11g大米、33.11g川谷籽、0.66g人参、16.56g覆盆子和16.56g巨藻粉碎并加入180g水，然后利用80目滤布过滤，得到待发酵液，并在100℃下加热20min进行灭菌处理；
75.(2)将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为4.5，置于种子罐中，接种4g酵母菌和2g乳酸杆菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h；
76.(3)然后加入精氨酸调节ph为6.5，加入12g裂裥菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h；
77.(4)最后利用精氨酸调节ph为8.0，加入6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动，35℃培养22h后升温至58℃培养18h，得到初步产物；
78.(5)将初步产物进行过滤，取清液，在其中加入活性炭搅拌5min，进行吸附纯化处理，然后利用过滤的方式再次取清液，灭菌，得到共生菌组合发酵物。
79.其中，大米为泰国香米，川谷籽购自贵州，人参为长白山白参，覆盆子购自安徽，巨藻购自山东长岛县。酵母菌选自啤酒酵母，乳酸杆菌选自嗜热乳酸杆菌。
80.制备例2-5
81.与制备例1的区别在于，在本制备例中，嗜热栖热菌的添加量为3g(制备例2)、9g(制备例3)、1g(制备例4)、11g(制备例5)。
82.制备例6-7
83.与制备例1的区别在于，在本制备例中，酵母菌的添加量为0.5g(制备例6)、8g(制备例7)。
84.制备例8-9
85.与制备例1的区别在于，在本制备例中，乳酸杆菌的添加量为0.1g(制备例2)、5g(制备例3)。
86.制备例10-13
87.与制备例1的区别在于，在本制备例中，裂裥菌的添加量为10g(制备例10)、15g(制备例11)、7g(制备例12)、20g(制备例13)。
88.制备例14
89.一种共生菌组合发酵物，制备方法如下：
90.(1)将26.49g大米、39.74g川谷籽、0.66g人参、19.87g覆盆子和13.24g巨藻粉碎并加入150g水，然后利用80目滤布过滤，得到待发酵液，并在100℃下加热20min进行灭菌处理；
91.(2)将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为4.0，置于种子罐中，接种2g酵母菌和3g乳酸杆菌，在5m3/h/50l的通气量，以100rpm搅拌转动下，25℃培养25h；
92.(3)然后加入精氨酸调节ph为7.0，加入12g裂裥菌，在5m3/h/50l的通气量，以100rpm搅拌转动下，25℃培养25h；
93.(4)最后利用精氨酸调节ph为8.5，加入6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以100rpm搅拌转动，30℃培养25h后升温至55℃培养20h，得到初步产物；
94.(5)将初步产物进行过滤，取清液，在其中加入活性炭搅拌5min，进行吸附纯化处理，然后利用过滤的方式再次取清液，灭菌，得到共生菌组合发酵物。
95.制备例15
96.一种共生菌组合发酵物，制备方法如下：
97.(1)将39.74g大米、26.49g川谷籽、0.66g人参、13.24g覆盆子和19.87g巨藻粉碎并加入200g水，然后利用80目滤布过滤，得到待发酵液，并在100℃下加热20min进行灭菌处理；
98.(2)将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为5.0，置于种子罐中，接种5g酵母菌和1g乳酸杆菌，在5m3/h/50l的通气量，以200rpm搅拌转动下，35℃培养20h；
99.(3)然后加入精氨酸调节ph为6.0，加入12g裂裥菌，在5m3/h/50l的通气量，以200rpm搅拌转动下，35℃培养20h；
100.(4)最后利用精氨酸调节ph为8.0，加入6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以200rpm搅拌转动，40℃培养20h后升温至60℃培养15h，得到初步产物；
101.(5)将初步产物进行过滤，取清液，在其中加入活性炭搅拌5min，进行吸附纯化处理，然后利用过滤的方式再次取清液，灭菌，得到共生菌组合发酵物。
102.制备例16
103.与制备例1的区别在于，将泰国香米替换为东北米，将人参替换为白参。
104.制备例17
105.与制备例1的区别在于，在本制备例中，酵母菌选自红酵母，乳酸杆菌选自保加利亚乳酸杆菌。
106.对比制备例1
107.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，不添加乳酸杆菌，而酵母菌、裂裥菌和嗜热栖热菌的添加量为制备例1中裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌添加量的和，然后按比例分配，即在本对比制备例中，酵母菌的添加量为4.4g，裂裥菌的添加量为13.1g，嗜热栖热菌的添加量为6.5g。
108.对比制备例2
109.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，不添加嗜热栖热菌，而酵母菌、裂裥菌和乳酸杆菌的添加量为制备例1中裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌添加量的和，然后按比例分配。
110.对比制备例3
111.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，不添加嗜热栖热菌和酵母菌，而裂裥菌和乳酸杆菌的添加量为制备例1中裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌添加量的和，然后按比例分配。
112.对比制备例4
113.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，不添加裂裥菌和乳酸杆菌，而嗜热栖热菌和酵母菌的添加量为制备例1中裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌添加量的和，然后按比例分配。
114.对比制备例5
115.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，不添加裂裥菌、乳酸杆菌和酵母菌，而嗜热栖热菌的添加量为制备例1中裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌添加量的和。
116.对比制备例6
117.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，不添加嗜热栖热菌、乳酸杆菌和酵母菌，而裂裥菌的添加量为制备例1中裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌添加量的和。
118.对比制备例7
119.与制备例1的区别在于，本对比制备例的制备方法不同，制备方法如下：
120.(1)与制备例1相同；
121.(2)将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为4.5，置于种子罐中，接种4g酵母菌、2g乳酸杆菌、12g裂裥菌和6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h；
122.(3)然后加入精氨酸调节ph为6.5，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h；
123.(4)最后利用精氨酸调节ph为8.0，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动，35℃培养22h后升温至58℃培养18h，得到共生菌组合发酵物。
124.对比制备例8
125.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，调换酵母菌和裂裥菌的加入顺序。
126.对比制备例9
127.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，调换酵母菌和嗜热栖热菌的加入顺序。
128.对比制备例10
129.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，调换乳酸杆菌和裂裥菌的加入顺序。
130.对比制备例11
131.与制备例1的区别在于，在本对比制备例中，调换裂裥菌和嗜热栖热菌的加入顺序。
132.对比制备例12
133.与制备例1的区别在于，本对比制备例的制备方法不同，制备方法如下：
134.(1)与制备例1相同；
135.(2)将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为4.5，置于种子罐中，接种4g酵母菌、2g乳酸杆菌、12g裂裥菌和6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h，30℃培养22h，35℃培养22h后升温至58℃培养18h，得到共生菌组合发酵物。
136.对比制备例13
137.与制备例1的区别在于，本对比制备例的制备方法不同，制备方法如下：
138.(1)与制备例1相同；
139.(2)将灭菌后的待发酵液利用精氨酸调节ph为6.5，置于种子罐中，接种4g酵母菌、2g乳酸杆菌、12g裂裥菌和6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h，30℃培养22h，35℃培养22h后升温至58℃培养18h，得到共生菌组合发酵物。
140.对比制备例14
141.与制备例1的区别在于，本对比制备例的制备方法不同，制备方法如下：
142.(1)与制备例1相同；
143.(2)将灭菌后的待发酵液调节ph为8.0，置于种子罐中，接种4g酵母菌、2g乳酸杆菌、12g裂裥菌和6g嗜热栖热菌，在5m3/h/50l的通气量，以150rpm搅拌转动下，30℃培养22h，30℃培养22h，35℃培养22h后升温至58℃培养18h，得到共生菌组合发酵物。
144.实施例1-17
145.一种护肤组合物，由制备例1-17提供的共生菌组合发酵物30wt％、去离子水55wt％、透明质酸钠5wt％、丁二醇9.5wt％和对羟基苯乙酮0.5wt％混合均匀，得到护肤组合物。
146.对比例1-14
147.对实施例1的区别在于，将制备例1提供的共生菌组合发酵物替换为对比制备例1-14提供的共生菌组合发酵物。
148.对比例15
149.对实施例1的区别在于，去除共生菌组合发酵物，以水补足。
150.性能测试1
151.对实施例1-17提供的护肤组合物进行安全性能测试，方法如下：
152.(1)红细胞溶血实验
153.红细胞悬液的制备：选择健康家兔，心脏取血9ml，加入2％的草酸钾溶液1ml，离心，弃去上清液，用20mmol/l的pbs溶液将沉淀物稀释至20ml，4℃保存备用。选择样品用pbs溶液稀释至不同浓度，每个样品设置5个浓度梯度。取10ml待测样品的稀释液，加入200μl上述红细胞悬液(控制样品终浓度分别为5、10、20、50、100mg/ml)，以蒸馏水作为全溶血对照，pbs溶液作为阴性对照，轻轻混匀，37℃下孵育30min，在2000r/min的转速下离心10min，取上清液，用分光光度计测试其在560nm处的吸光度(a
560
)，按如下公式计算溶血率；
[0154][0155]
绘制溶血率-样品浓度标准曲线，计算50％红细胞发生溶血时的样品浓度(hd
50
)。
[0156]
(2)蛋白变性实验：
[0157]
将样品用pbs溶液稀释至10g/l，取10ml待测样品的稀释液，加入200μl上述红细胞悬液，以蒸馏水作为空白对照，1mg/ml十二烷基硫酸钠(sds)溶液作为阳性对照，轻轻混匀，37℃下孵育30min，在2000r/min的转速下离心10min，取上清液，用分光光度计分别测试其在540nm和575nm处的吸光度a
540
和a
575
，按照如下公式计算蛋白变性指数(di)；
[0158][0159]
其中，r1＝空白对照组a
575
/空白对照组a
540
，r2＝实验组a
575
/实验组a
540
，r3＝阳性
对照组a
575
/阳性对照组a
540
。
[0160]
根据l/d值对待测样品的刺激性进行评价，其中l/d值为hd
50
/di，红细胞溶血实验刺激性分级标准如下表1所示：
[0161]
表1
[0162]
l/d分级》100无刺激性10《l/d≤100微刺激性1《l/d≤10轻度刺激性0.1《l/d≤1中度刺激性
[0163]
上述红细胞溶血实验和蛋白变性实验的测试结果如下表2所示：
[0164]
表2
[0165]
[0166][0167]
由实施例和性能测试可知，本发明提供的护肤组合物刺激性分级为无刺激性，说明本发明提供的护肤组合物具有温和无刺激的特点。
[0168]
性能测试2
[0169]
对实施例1-17和对比例1-15提供的护肤组合物进行性能测试，方法如下：
[0170]
(1)经皮失水变化率：仪器为德国ck公司的tewameter tm300，测试外部环境：室温25℃，湿度60％。
[0171]
选取320名皮肤健康的18-40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成37组，每组5名男性、5名女性，分别使用实施例1-17和对比例1-15提供的护肤组合物。
[0172]
在使用前皮肤组合物前，以及连续使用4天后，分别测试各位受试者的经皮失水变化率(以使用前为100％计)，每个数据测试三次，取平均值后，计算每组平均值，保留小数点后一位。
[0173]
(2)促进弹性蛋白生成实验：将人成纤维细胞按照2
×
104个/孔的密度接种在96孔板上，加入新鲜培养基在37℃培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，更换新的培养基，并分别加入实施例1-17和对比例1-15提供的护肤组合物(控制样品终浓度为50mg/ml)，以20mmol/l的pbs溶液作为空白对照，然后在37℃培养箱中培养2天。
[0174]
培养结束后，利用细胞裂解液将细胞洗脱下来，并超声破碎。采用biocolor弹性蛋白检测试剂盒对弹性蛋白的含量进行检测：用弹性蛋白沉淀剂处理样本，使弹性蛋白沉淀下来，离心分离，去除上清液，向沉淀中加入染料和反应液，反应形成弹性蛋白-染料复合物，离心分离并用pbs溶液洗涤三次，去除未结合的染料，添加染料释放剂，使弹性蛋白-染料复合物中的染料释放出来，采用分光光度计测定样品在513nm处的吸光度。根据吸光度-染料浓度标准曲线计算弹性蛋白的表达量(实施例和对比例中弹性蛋白表达量是相对于空白组的相对表达量，空白组的表达量计为1)。
[0175]
(3)水分保持率：仪器为德国courage+khazaka electronic型号：derma unit ssc，测试温度25℃，湿度60％。
[0176]
选取320名皮肤健康的18-40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成37组，每组5名男性、5名女性，分别使用实施例1-17和对比例1-15提供的护肤组合物。
[0177]
在使用前以及使用4h后分别测试各位受试者的皮肤水分含水量(以使用前为100％计)，每个数据测试三次，取平均值后，计算每组平均值，保留小数点后一位。
[0178]
(4)体外称重法保湿性能测试：称取样品0.2g，分别均匀涂敷在贴有微孔通气胶带的5cm
×
5cm的玻璃板上，并将玻璃板放入恒温恒湿的干燥器中，分别称量玻璃板放置4h后的质量，计算其保湿率。保湿率计算公式为：保湿率/％＝(m
2-m0)/(m
1-m0)
×
100％。
[0179]
其中，m0为玻璃板板质量/g，m1为加样后玻璃板质量/g，m2为干燥器中放置若干小时后玻璃板质量/g。
[0180]
(5)抗氧化性能：将样品配成浓度为1％的样品溶液(溶剂乙醇)，进行超氧阴离子自由基清除能力评价试验：
[0181]
取0.05mol/l ph＝8.2的tris-hcl缓冲溶液4.5ml，于25℃水浴锅中预热30min。再加入1ml样品溶液和0.4ml 25mol/l的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入1ml 8mol/l的hcl终止反应。以tris-hcl缓冲溶液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照组用1ml样品溶液的溶剂来替代样品溶液；
[0182]
其中，超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(ay/ak)]
×
100％；
[0183]ak
为空白对照组的吸光度值，ay为样品组的吸光度值。
[0184]
(6)消炎功效：收集对数期人皮肤角质细胞，用培养液制成单个细胞悬液，调节细胞终浓度为40000cell/ml，96孔板中加入100μl细胞悬液，5％co2，37℃孵育24h，吸出培养液，用pbs洗一次，吸出，再加入20μl的pbs，进行uvb照射，辐射剂量控制为60mj/cm2，换入检测物(实施例和对比例提供的样品，用高糖型dmem细胞培养液稀释，浓度为10％)，培养24h后，收集培养液上清；其中，检测炎症因子(il-1a，il-6，il-8，tnf-a)的含量按照成品试剂盒的说明书进行检测，实验重复5次，求平均值。
[0185]
(7)美白效果：选择对数生长期的同一代b16黑色素细胞，常规胰酶消化处理后吹打成单细胞悬液细胞计数定量接种于96孔板，24小时后，弃去上清液，分别加入含有10％样品的rpmi1640培养液，在37℃，体积分数5％的co2饱和湿性条件下培养，对照孔加rpmi1640培养液(含水％)，培育三天，中间更换一次培育液；弃去上清液，常规胰酶消化处理后，计数细胞密度，离心得到细胞沉淀，；用pbs冲洗两次，离心弃去上清液，定量加含10％的dmso的1mol/l的naoh液，80℃水浴50min，然后在酶标仪450nm处测定吸光值；
[0186]
黑色素生成抑制率(％)＝(各试验材料的吸光度/对照组的吸光度)
×
100％。
[0187]
(8)提亮功效：利用皮肤色差测试仪(探头cl400及多探头皮肤测试系统mpa10)进行测试，恒温恒湿，温度为22℃，湿度为50％，并计算ita
°
：
[0188]
选取320名皮肤健康的18-40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成37组，每组5名男性、5名女性，分别使用实施例1-17和对比例1-15提供的护肤组合物。
[0189]
在使用前皮肤组合物前，以及连续使用7天后，分别测试各位受试者，(以使用前为100％计)，每个数据测试三次，取平均值后，计算每组平均值，保留到个位。
[0190]
测试结果见表3和表4：
[0191]
表3
[0192]
[0193][0194][0195]
表4
[0196]
[0197][0198]
经皮失水率是一种反映皮肤屏障功能的重要指标，经皮失水率的增加可以认为与皮肤屏障功能下降有关，在本发明中，通过对比使用样品前和使用样品后的经皮失水变化率，来确定本发明的护肤组合物对皮肤屏障的修复效果；而细胞的相对生长率则可说明是否可以对皮肤进行修复，刺激细胞的再生力。
[0199]
由实施例和性能测试可知，利用本发明提供的共生菌组合发酵物制备得到的护肤组合物具有修复皮肤屏障，刺激细胞再生，促进细胞生长的效果，同时，还具有保湿、美白提亮、提高皮肤弹性、消炎舒缓、抗氧化防皱的功效；其中，经皮失水变化率在100％以下(测试前为100％)，说明本发明提供的共生菌组合发酵物正在缓慢修复皮肤屏障；弹性蛋白表达量在5.8以上，表明本发明提供的共生菌组合发酵物促进了细胞生长，正在修复皮肤屏障，增加皮肤弹性；且水分保持率较高，在83.3％以上，超氧阴离子自由基清除率在91％以上；黑色素生成抑制率在51％以上，提亮功效在114％以上，同时，消炎因子明显降低。
[0200]
由实施例1和实施例2-5的对比可知，嗜热栖热菌为发酵原料总重量的3-9％范围内效果最好；由实施例1和实施例6-7的对比可知，酵母菌为发酵原料总重量的2-5％范围内效果最好；由实施例1和实施例8-9的对比可知，乳酸杆菌为发酵原料总重量的1-3％范围内效果最好；由实施例1和实施例10-13的对比可知，裂裥菌为发酵原料总重量的10-15％范围
内效果最好。由实施例1和实施例4-5、6-7的对比可知，嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌的质量和为大米、川谷籽、人参、覆盆子和巨藻的质量和的10-15％时，所得的发酵物活性最高，进而最后的护肤组合物效果最佳。由实施例1和实施例16-17的对比可知，本发明的人参优选白参，大米优选籼米，酵母菌优选啤酒酵母，以及乳酸杆菌优选嗜酸乳酸杆菌，具有更好的应用效果。
[0201]
由实施例1和对比例1-6的对比可知，本发明的裂裥菌、嗜热栖热菌、酵母菌和乳酸杆菌可以在发酵过程中相互促进，相互诱导活化，极大增加发酵物的活性，进而增加共生菌组合发酵物的有益效果。由实施例1和对比例7-14的对比可知，只有采用本发明的发酵方法才可以得到本发明的有益效果。由实施例1和对比例15的对比可知，本发明的共生菌组合发酵物具有修复皮肤屏障并且保湿、抗氧化等有益效果。
[0202]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的共生菌组合发酵物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。