水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用。
背景技术：
：近几十年，我国渔业发展迅速，水产品总产量位居世界前列，我国已成为世界上水产品生产、消费和进出口大国。由于市场需求增大，集约化养殖程度的提高成了必然发展，同时越来越多的人认识到微生物疾病不仅仅局限于一种病原体，如病毒、细菌、真菌和寄生虫等的各种组合方式，其中一种微生物的存在会为其他病原性微生物的感染提供便利，从而共同导致疾病，这种引发疾病的方式是多病原微生物感染。同样，多病原感染方式在水产养殖中也是普遍存在的，这就加剧了鱼类病害的严重性，给我国的水产养殖业带来了巨大的损失。我国的水产养殖中也存在一些问题，如各种化学药物的滥用则会导致水产品的药物残留超标，不仅仅对环境造成了污染，而且影响水产品的食品安全，限制了我国水产品的出口。针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已经被禁用。于是，我国对水产疫苗的关注越来越高。疫苗不仅能够增强动物的免疫力，预防相关疾病的发生，还能减少各类药物的使用，降低养殖成本，解决各种药物残留带来的食品安全问题、环境污染问题，使水产养殖业向着绿色的、可持续发展的方向前进。细菌是水产养殖中最常见的病原菌，给水产养殖造成了巨大损失，如鳗弧菌、哈维弧菌、迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、柱状纤维菌、溶藻弧菌等。在强致病性细菌中，运动性气单胞菌和爱德华氏菌属是最主要的。迟钝爱德华氏菌(edwaedsiellatarda)的传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危害的种类多，有鲶鱼、鲤鱼、罗非鱼、鳗鱼、鲻鱼和大菱鲆等大多数具有较高经济价值的鱼种，并引起大面积死亡。迟钝爱德华氏菌感染大菱鲆后，发病症状表现为鱼体后部的背侧皮肤发黑、腹部出现红肿和肾脏肿大。病理学分析发现迟钝爱德华氏菌对大菱鲆的感染是系统性的，尤其是肾脏病变明显，而巨噬细胞在多个器官中增值聚集并产生肉芽肿瘤。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前，在我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原体向人体转移的巨大威胁。目前在我国尚无该病害的有效防治措施。目前，爱德华氏菌的控制主要依靠抗生素的使用，以化学治疗为主。由于抗生素能被不断的耐受，它们在水产养殖中的应用越来越受到限制。此外，致病的迟钝爱德华氏菌常常被发现对多重抗菌素复合物有自然抗性，增加了以抗生素为基础的治疗的难度。相比之下，从一个长期的观点来看，疫苗是疾病控制更安全更有效的方法。由于灭活疫苗的抗原性较弱，而减毒疫苗的安全性不稳定，为此，研制使用方便、高效、易商品化大规模生产、切实有效的亚单位疫苗，对水产业尤为必要。糖酵解持家酶普遍存在于生物体内，参与基础代谢，不同物种间同源度高。这些糖酵解持家酶的免疫原性也被日益关注，正逐渐成为疫苗设计的新靶点。鉴于此，开发新型的效果较好的疫苗成为迫切需要，优选迟钝爱德华氏菌糖酵解持家酶蛋白作为优选抗原蛋白，为后续设计多病原免疫防治的疫苗奠定基础。技术实现要素：本发明人研究发现将糖酵解途径(emp途径)中的酶作为候选疫苗蛋白，进而优选抗原蛋白双组分和三组分等进行联合免疫，筛选协同免疫的抗原组合；同时进行优选抗原蛋白关键表位肽的筛选，对获得的关键表位肽进行串联表达、纯化及免疫保护力评价，免疫斑马鱼所获得的实验结果进一步发现不同关键表位的组合方式产生不同免疫效果，为后续微藻中抗原蛋白的联合表达提供基础。因此本发明文对获得的抗原蛋白开展多组分联合免疫效力评价、关键表位肽的鉴定和串联重组表达，以期获得优选高效抗原。为此，本发明的第一个目的在于提供一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，用于防治多种水产病原菌对鱼类的感染。本发明的第二个目的是提供所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗的应用。为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：作为本发明的第一个方面，一种水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其是以至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而形成的重组蛋白作为抗原成分。根据本发明，糖酵解途径来源的持家酶为pgm、pgk、eno、hk，所述pgm、pgk、eno、hk的关键表位分别为多肽pgm1、pgk2与pgk3、eno1以及hk3，所述pgm1是具有蛋白pgm相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述pgk2是具有蛋白pgk相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述pgk3是具有蛋白pgk相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述eno1是具有蛋白eno相对应的第1-108位氨基酸的多肽片段，所述hk3是具有蛋白hk相对应的第161-240位氨基酸的多肽片段，所述蛋白pgk、pgm、eno、hk的氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示。根据本发明，所述蛋白pgk、pgm、eno、hk的编码基因分别具有如seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8所示的核苷酸序列。较佳的，所述水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗，其是以糖酵解途径来源的持家酶pgm和pgk的关键表位相连接而成的重组蛋白作为抗原成分。根据本发明，所述pgm、pgk关键表位分别为pgm1、pgk2与pgk3,所述pgm1是具有蛋白pgm相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述pgk2是具有蛋白pgk相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述pgk3是具有蛋白pgk相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述蛋白pgk、pgm的氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2所示，其对应的编码基因分别具有如seqidno:5、seqidno:6所示的核苷酸序列。根据本发明，所述重组蛋白在大肠杆菌中表达。根据本发明，所述的水产病原菌包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、美人鱼发光杆菌、鲁氏耶尔森菌。作为本发明的第二个方面，一种如上述所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在防治水产养殖中的细菌性病害中的应用。进一步的，所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在防治鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌等引起的水产养殖中的细菌性病害中的应用。根据本发明，所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗用于防治鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌等水产病原菌对鱼类的共感染，所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗对鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌等水产病原菌具有交叉免疫保护作用。根据本发明，所述爱德华氏菌为迟钝爱德华氏菌e.tardaeib202，保藏号为：cctcc-m208068。根据本发明，所述鳗弧菌为鳗弧菌mvm425。根据本发明，所述哈维氏弧菌为哈维氏弧菌vib647。根据本发明，所述嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌lsa34。根据本发明，所述溶藻弧菌为溶藻弧菌epgs020401。作为本发明的第三个方面，一种重组蛋白，其是通过将至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而成，所述糖酵解途径来源的持家酶为pgm、pgk、eno、hk，所述pgm、pgk、eno、hk的关键表位分别为pgm1、pgk2与pgk3、eno1以及hk3，所述pgm1是具有蛋白pgm相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述pgk2是具有蛋白pgk相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述pgk3是具有蛋白pgk相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述eno1是具有蛋白eno相对应的第1-108位氨基酸的多肽片段，所述hk3是具有蛋白hk相对应的第161-240位氨基酸的多肽片段，所述蛋白pgk、pgm、eno、hk相对应的氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示。根据本发明，所述蛋白pgk、pgm、eno、hk相对应的编码基因分别具有如seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8所示的核苷酸序列。较佳的，所述重组蛋白，其是通过将糖酵解途径来源的持家酶pgm和pgk的关键表位相连接而成，所述pgm、pgk关键表位分别为pgm1、pgk2与pgk3,所述pgm1是具有蛋白pgm相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述pgk2是具有蛋白pgk相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述pgk3是具有蛋白pgk相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述蛋白pgk、pgm的氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2所示，其对应的基因编码序列分别具有如seqidno:5、seqidno:6所示的核苷酸序列。作为本发明的第四个方面，编码上述所述的重组蛋白的核苷酸。作为本发明的第五个方面，一种重组载体，含有编码上述所述的重组蛋白的核苷酸序列的表达载体。根据本发明，所述表达载体是pet28a(+)。作为本发明的第六个方面，一种宿主细胞，包括上述所述的重组载体的宿主细胞。根据本发明，所述宿主细胞为大肠杆菌。进一步的，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。作为本发明的六个方面，一种抑菌组合物，包括由至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而成的重组蛋白，含有所述重组蛋白的表达载体，以及含有所述重组蛋白的宿主细胞中的至少一种。根据本发明，糖酵解途径来源的持家酶为pgm、pgk、eno、hk，所述pgm、pgk、eno、hk的关键表位分别为pgm1、pgk2与pgk3、eno1以及hk3，所述pgm1是具有蛋白pgm相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述pgk2是具有蛋白pgk相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述pgk3是具有蛋白pgk相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述eno1是具有蛋白eno相对应的第1-108位氨基酸的多肽片段，所述hk3是具有蛋白hk相对应的第161-240位氨基酸的多肽片段，所述蛋白pgk、pgm、eno、hk的氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示。作为本发明的第七个方面，一种抑菌剂，其主要活性成分为由至少两种糖酵解途径来源的持家酶的关键表位相连接而成的重组蛋白，含有所述重组蛋白的表达载体，以及含有所述重组蛋白的宿主细胞中的至少一种。根据本发明，糖酵解途径来源的持家酶为pgm、pgk、eno、hk，所述pgm、pgk、eno、hk的关键表位分别为pgm1、pgk2与pgk3、eno1以及hk3，所述pgm1是具有蛋白pgm相对应的第1-54位氨基酸的多肽片段，所述pgk2是具有蛋白pgk相对应的第98-194位氨基酸的多肽片段，所述pgk3是具有蛋白pgk相对应的第195-291位氨基酸的多肽片段，所述eno1是具有蛋白eno相对应的第1-108位氨基酸的多肽片段，所述hk3是具有蛋白hk相对应的第161-240位氨基酸的多肽片段，所述蛋白pgk、pgm、eno、hk的氨基酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示。根据本发明，所述抑菌剂的抑菌谱为：鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、爱德华氏菌。根据本发明，所述爱德华氏菌为迟钝爱德华氏菌e.tardaeib202，保藏号为：cctcc-m208068。根据本发明，所述鳗弧菌为鳗弧菌mvm425。根据本发明，所述哈维氏弧菌为哈维氏弧菌vib647。根据本发明，所述嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌lsa34。根据本发明，所述溶藻弧菌为溶藻弧菌epgs020401。作为本发明的第七个方面，一种上述所述的水产病原菌糖酵解途径中的持家酶的广谱组合型疫苗在制备饲料添加剂、饲料或饵料中的应用。根据本发明，所述饲料为水产养殖用的饲料，所述饲料添加剂为水产养殖用的饲料添加剂；所述饵料为轮虫、枝角类、桡足类等浮游动物。优选的，所述饲料为鱼饲料；所述饲料添加剂为鱼饲料添加剂。本发明的有益效果：本发明将具有免疫活性的多肽片段pgk2、pgk3和pgm1组合免疫、将pgk2、pgk3和eno1组合免疫、将pgm1与hk3组合免疫、以及将pgm1与eno1组合免疫，均具有良好的免疫作用，可以用于研制使用方便、高效、易商品化大规模生产、切实有效的亚单位疫苗，用于水产养殖多病原共感染的免疫防治，具有良好的应用前景。附图说明图1--图4为本发明的迟钝爱德华氏菌糖酵解持家酶关键表位筛选重组蛋白免疫斑马鱼后的相对免疫保护分析。图5为本发明的迟钝爱德华氏菌关键表位多种组合的重组抗原免疫斑马鱼后的相对免疫保护分析。图6为本发明的迟钝爱德华氏菌关键表位多种组合的重组抗原免疫斑马鱼后的血清中特异性抗体效价分析。图7为本发明的关键区段重组抗原免疫斑马鱼后的血清中抗体与多病原菌的交叉反应效价分析。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不限制于本发明的范围。另外以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。可参考文献，1、“迟缓爱德华氏菌抗原蛋白fba在毕赤酵母中的重组表达及抗原表位筛选”，鲍盼，上海，华东理工大学，2015(以下简称“文献1”)；2、“迟缓爱德华氏菌糖酵解途径中持家酶的免疫原性分析”，孙佳敏，上海，华东理工大学，2016(以下简称“文献2”)。本发明优先考虑爱德华氏菌糖酵解途径中涉及的蛋白质以及其他潜在的疫苗靶标，如糖酵解途径中持家酶蛋白磷酸甘油酸激酶(pgk)、磷酸甘油酸变位酶(pgm)、烯醇化酶(eno)、己糖激酶(hk)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、磷酸果糖激酶(pfk)和丙酮酸激酶(pk)等，将其视为疫苗候选蛋白。糖酵解持家酶普遍存在于生物体内，参与基础代谢，不同物种间同源度高。这些糖酵解持家酶的免疫原性也被日益关注，正逐渐成为疫苗设计的新靶点。以上所述蛋白(包括但不限于)的生物活性片段为一种多肽，本发明人通过将编码蛋白的氨基酸序列经过部分缺失的方式，在保持其蛋白的全部或部分功能的情况下进行表位筛选，抗原表位和相应抗体具有较好的结合性，抗原表位能激发宿主相应的免疫反应。上述蛋白中包括一部分氨基酸的保守序列，一般来说在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸不会改变其生物活性。并通过斑马鱼实验的效力与抗血清的反应性分析，初步确定抗原表位关键所在区域，为后续的应用开发提供基础。1、本发明涉及的菌株和质粒来源如下：(1)大肠杆菌e.colibl21(de3)：购自天根生化科技(北京)有限公司；(2)迟钝爱德华氏菌e.tardaeib202，保藏号为：cctcc-m208068(edwardsiellatardaeib202)；(3)pet28a(+)载体：购自宝生物工程(大连)有限公司。(4)鳗弧菌v.anguillarummvm425(分离于花鲈，wu,h.z.,ma,y.,zhang,h.z.andzhang,y.x.(2004)completesequenceofvirulenceplasmidfromthemarinefishpathogenvibrioanguillarumstrainmvm425andlocationofitsreplicationregion.japplmicrobio97,1021-1028)；(5)嗜水气单胞菌a.hydrophilalsa34(分离于淡水鱼，zhou,l.y.,wang,x.h.，liu,q，wang,q.y.,zhao,y.andzhang,y.x.(2010)anovelmultivalentvaccinebasedonsecretaryantigen-deliveryinducesprotectiveimmunityagainstvibrioanguillarumandaeromonashydrophila.jbiotechnol146,25-30)；(6)哈维氏弧菌v.harveyivib647(分离于海狸，zhang,x.h，meaden,p.g.andaustion,b.(2001)duplicationofhemolysingenesinavirulentisolateofvibrioharveyi.applenvironmicrobiol67,3161-3167.)；(7)溶藻弧菌v.alginolyticusepgs020401(分离于点带石斑鱼，rui,h.p.,liu,q，wang,q.y.,ma,y.,liu,h.,shi,c.b.andzhang,y.x.(2009)roleofalkalineserineproteaseaspinvibrioalginolyticusvirulenceandregulationofitsexpressionbyluxo-luxrregulatorysystem.jmicrobiolbiotechnol19,431-438)。2、本发明涉及的培养基及培养条件(1)lb培养基：1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)nacl。固体培养基加入2％(w/v)琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。用于大肠杆菌和爱德华氏菌的培养。(2)dhl培养基：60g胆硫乳琼脂培养基溶于1l去离子水中，反复煮沸溶解至澄清，冷却后制作平板。(3)培养条件：大肠杆菌在37℃lb液体培养基中摇床振荡培养或lb固体培养基中平板静置培养。迟钝爱德华氏菌接种于lb液体培养基，30℃、200r/min过夜振荡摇床培养。迟钝爱德华氏菌液涂布或划线于dhl固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养，在dhl固体培养基上形成边缘半透明的黑心菌落。3、实验试剂及名词解释(1)常规分子生物学试剂及试剂盒购自天根生化科技(背景)有限公司；其中，1)iptg：异丙基硫代半乳糖苷2)ni-sepharose：镍-琼脂糖凝胶3)pbs：称取nacl8.00g，na2hpo41.42g，kcl0.20g，kh2po40.27g溶于1l超纯水中溶解。4)pbst：按0.05％比例加吐温溶于pbs中。5)bsa：牛血清白蛋白。(2)限制性内切酶bamhⅰ、xhoⅰ购自宝生物工程(大连)有限公司。(3)蛋白表达及纯化常规试剂，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。(4)亲和层析介质ni-sepharoseff购自gehealthcare。(5)羊抗鼠单克隆抗体购自tiangen。4、抗原蛋白基因序列根据e.tardaeib202全基因组序列，得到相应迟钝爱德华氏菌糖酵解途径相关蛋白pgk、pgm、eno、hk等基因的蛋白序列，如序列表的seqidno:1-seqidno:4所示。pgk、pgm、eno、hk等基因的核苷酸序列，如序列表的seqidno:5-seqidno:8所示。5、抗原蛋白引物用primerprimer5软件设计迟钝爱德华氏菌糖酵解持家酶的基因的特异性引物如表1所示，引物经上海生物工程公司合成，为page纯化产物。根据引物设计原则，设计特异性引物，如表2和表3所示，引物经上海生物工程公司合成，为page纯化产物。表1糖酵解相关蛋白基因克隆的引物序列引物名称引物序列(5’-3’)限制位点seqidpgm-fcgcggatccatgagacaggtatatcttatbamhino:9pgm-rccgctcgagctaacgtaacacttcatccxhoino:10pgk-fcgcggatccttactgcttggcgcgctcttcbamhino:11pgk-rccgctcgagatgtctgtaattaagatgacxhoino:12eno-fcgcggatccttaatgctggcctttcacttcttbamhino:13eno-rccgctcgagatgtccaaaatcgttaaagtcxhoino:14hk-fcgcggatccatgagccgttttgcgttgbamhino:15hk-rccgctcgagttaaagacgagtgcccagxhoino:16表2糖酵解持家酶关键区段克隆的引物序列引物名称引物序列(5’-3’)限制位点seqidpgm1-fcgcggatccatgagacaggtatatcbamhino:17pgm1-rccgctcgaggctggcgatcacgtgxhoino:18pgk2-fcgcggatccggcgttgacgttgccbamhino:19pgk2-rggtcagcttggtggagactttggagccgcc/no:20pgk3-fggcggctccaaagtctccaccaagctgacc/no:21pgk3-rccgctcgagggcagaggcatcgccxhoino:22eno1-fcgcggatccatgtccaaaatcgttbamhino:23eno1-rccgctcgagagcaccgaacttggaxhoino:24hk3-fcgcggatccgtggatttcgcgaccbamhino:25hk3-rccgctcgagcatcacacagaacagxhoino:26表3扩增持家酶中各多肽相应核苷酸的引物序列6、实验动物及免疫试剂(1)斑马鱼，购于上海养殖场，体长4cm，体重约0.4g。实验前先置于水族箱内适应驯养2周，后移至鱼饲养系统适应2周。鱼饲养系统每天流动更换水体，养殖温度22℃左右。每天喂养2次并及时清除粪便残渣。(2)鱼用麻醉剂tricainemethanesulphonate(ms-222)购于sigma公司。(3)鱼用佐剂montanidetmisa763a，购买于法国seppic公司。实施例1糖酵解途径持家酶pgk、pgm、eno、hk关键表位的初筛1、重组抗原蛋白的制备以emp途径中持家酶蛋白pgk关键表位筛选为例。载体质粒pet28a(+)的抽提根据tianprepminiplasmidkit的操作说明进行。选用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切，酶切后的线性化载体经琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。根据基因组抽提试剂盒(tianampbacteriadnakit)的操作说明进行迟钝爱德华氏菌eib202基因组的提取。以迟钝爱德华氏菌eib202基因组为模板，设计特异性引物，引物序列如seqidno:11和seqidno:12所示。对蛋白pgk的编码序列进行pcr扩增获得基因片段，经限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后获得目的基因，通过dna连接酶与线性化载体一起构建重组质粒作为阳性对照组。其中，编码pgk的核苷酸序列如seqidno:5所示；其蛋白pgk所对应的氨基酸序列如seqidno:1所示。将蛋白pgk分为4个多肽片段：pgk1(1-97aa)、pgk2(98-194aa)、pgk3(195-291aa)、pgk4(292-387aa)。以蛋白pgk所对应的基因为模板，根据引物设计原则，设计特异性引物，引物序列如seqidno:27-seqidno:34所示，扩增多肽相对应的每段基因片段。每次通过缺失其中一个基因片段，将其余片段通过overlap方法依次拼接分别得到新的目的基因片段，其序列所编码的蛋白变体分别为：δpgk1(98-387aa)、δpgk2(1-97aa，195-387aa)、δpgk3(1-194aa，292-387aa)、δpgk4(1-291aa)。再经限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ双酶切，带有粘性末端的目的基因和线性化质粒载体在dna连接酶的作用下将两者连接起来，形成含有目的基因的重组质粒。重组质粒即可以用于转克隆大肠杆菌dh5α宿主菌。平板上的克隆经测序验证确定为阳性，再抽提阳性宿主菌中的重组质粒，将重组质粒转化进入大肠杆菌bl21(dh3)宿主菌，再次验证为阳性，即为迟钝爱德华氏菌pgk蛋白的重组大肠杆菌bl21/pet-28a-δpgk1、bl21/pet-28a-δpgk2、bl21/pet-28a-δpgk3、bl21/pet-28a-δpgk4。其中，pcr扩增条件为：95℃，5分钟；95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，时间按照1kb/分钟进行换算，34个循环；72℃，5分钟；12℃保温。对测序成功的表达菌株接种，生长到一定阶段加入iptg进行诱导表达。收集菌液离心后用超声波法破壁，离心后收集上清与沉淀。蛋白电泳检测蛋白诱导表达，重组质粒带有6×his标签，可以采用westernblot进一步验证蛋白成功表达。4个重组蛋白两端各带一个his标记，能特异性地与镍结合。因此可以用镍柱来专一地纯化目标蛋白。洗脱获得δpgk蛋白变体，分别为δpgk1(98-387aa)、δpgk2(1-97aa，195-387aa)、δpgk3(1-194aa，292-387aa)、δpgk4(1-291aa)。然后将δpgk蛋白变体装入截留分子量的透析袋内，在pbs溶液中透析，-70℃保存。利用核酸定量仪nanodropnd-1000spectrophotomeoter检测其od，确定重组蛋白的浓度，用pbs缓冲液将蛋白稀释至预定的浓度。2、斑马鱼的免疫注射将纯化得到的几组δpgk蛋白变体与佐剂isa763a按7:3混合后，其中几组δpgk蛋白变体与佐剂混合液为实验组，pgk全长蛋白与佐剂混合液为阳性对照组，将pbs与佐剂混合液作为阴性对照组。充分振荡混匀，使最终蛋白浓度为0.3μg/μl，最终剂量为1.5μg/尾。将饲养的斑马鱼随机分为十组，每组30尾，进行尾肌肉注射免疫。免疫完毕后进行正常饲养，观察鱼的活动及死亡情况。免疫时间为4周。注射前，先将斑马鱼浸泡于100ng/mlms-222中进行麻醉。实验周期结束后，将剩余斑马鱼进行安乐死，即浸泡于200ng/mlms-222中10min以上。3、斑马鱼的攻毒注射收集迟钝爱德华氏菌eib202菌体，用灭菌pbs洗涤三次，用分光光度计测定重悬后的菌体密度，定量od600为1，并用pbs将菌液稀释至所需梯度浓度，每尾试验斑马鱼按照5μl/尾的剂量进行尾部肌肉注射免疫；观察并记录各组斑马鱼发病及死亡情况。4、重组蛋白免疫保护力测定(rps)4.1斑马鱼免疫养殖4周后，根据野生株半数致死量ld50值，选择合适的剂量对免疫过的斑马鱼进行攻毒实验。观察并记录各组斑马鱼发病及死亡情况。按照公式计算相对保护率(relativepercentsurvival，rps)：rps＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％斑马鱼攻毒后两周内的存活率如图1所示。图1结果显示：(1)pgk所表达的全长蛋白免疫后的斑马鱼在eib202攻毒后两周内的累计存活率较高达到了78％。(2)蛋白变体δpgk2和δpgk3对应的实验组的最终存活率均低于pbs对照组。缺少了关键多肽区段pgk2和pgk3导致攻毒后的斑马鱼存活率下降了41％和50％。(3)蛋白变体δpgk1和δpgk4对应的实验组的最终存活率均高于pbs对照组。结论：蛋白pgk具有免疫保护力的关键区域为多肽pgk2和pgk3片段。4.2将病鱼解剖后发现鱼体脾脏肿大，失血呈粉红色，肝脏出现弥散性出血。将病鱼组织适当处理稀释后图dhl板，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养，板上有大量黑心菌落的存在，说明斑马鱼致病原因确实是感染了迟钝爱德华氏菌。实施例2pgm、eno、hk关键表位初筛具体实验步骤及方法参考实施例1以及参考文献1，以迟钝爱德华氏菌eib202基因组为模板，设计特异性引物，所用引物分别为seqidno:9和seqidno:10所示、seqidno:13和seqidno:14所示、seqidno:15和seqidno:16所示的特异性引物，扩增获得糖酵解途径持家酶pgm、eno、hk蛋白的相关基因片段，pgm、eno、hk蛋白的编码序列分别如seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8所示；其所对应的氨基酸序列分别如seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示。经限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后获得的目的基因，通过dna连接酶与线性化载体一起构建重组质粒作为阴性对照组。将迟钝爱德华氏菌中的持家酶pgm、eno、hk分别分为四段：pgm1(1-54aa)、pgm2(55-108aa)、pgm3(109-162aa)、pgm4(163-215aa)；eno1(1-108aa)、eno2(109-215aa)、eno3(217-324aa)、eno4(325-433aa)；hk1(1-80aa)、hk2(81-160aa)、hk3(161-240aa)、hk4(241-321aa)。以各个蛋白所对应的基因为模板，根据引物设计原则，设计特异性引物，引物序列如seqidno:35-seqidno:58所示，扩增多肽相对应的每段基因片段。每次通过缺失其中一个基因片段，将其余片段通过overlap方法依次拼接分别得到新的目的基因片段，其序列所编码的蛋白变体分别为：δpgm1(55-215aa)、δpgm2(1-54aa，109-215aa)、δpgm3(1-108aa，163-215aa)、δpgm4(1-162aa)；δeno1(109-433aa)、δeno2(1-108aa，217-433aa)、δeno3(1-215aa，325-433aa)、δeno4(1-324aa)；δhk1(81-321aa)、δhk2(1-80aa，161-321aa)、δhk3(1-160aa，241-321aa)、δhk4(1-240aa)。各个目的基因经bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后，与线性化质粒pet28a(+)分别构建重组质粒，经验证为阳性重组质粒分别用于构建重组大肠杆菌bl21/pet-28a-δpgm1、bl21/pet-28a-δpgm2、bl21/pet-28a-δpgm3、bl21/pet-28a-δpgm4；bl21/pet-28a-δeno1、bl21/pet-28a-δeno2、bl21/pet-28a-δeno3、bl21/pet-28a-δeno4；bl21/pet-28a-δhk1、bl21/pet-28a-δhk2、bl21/pet-28a-δhk3、bl21/pet-28a-δhk4。诱导表达纯化得到重组蛋白后进行斑马鱼注射实验，再进行迟钝爱德华氏菌攻毒实验后测定重组蛋白免疫保护力(rps)。如图2-4所示，蛋白变体δpgm1免疫后的斑马鱼存活率下降了37％；蛋白变体δeno1免疫后的斑马鱼存活率下降了28％；蛋白变体δhk3免疫后的斑马鱼存活率下降了14％。结论：蛋白pgm具有免疫保护力的关键区域在pgm1多肽片段中；蛋白eno具有免疫保护力的关键区域在eno1多肽片段中；蛋白hk具有免疫保护力的关键区域在hk3多肽片段中。实施例3持家酶关键表位的多组合串联表达1、关键表位多组合重组抗原蛋白的制备载体质粒pet28a(+)的抽提根据tianprepminiplasmidkit的操作说明进行。选用限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收。选用爱德华氏菌糖酵解途径中的一至多个持家酶pgm、pgk、eno、hk等的初步关键表位肽中的一至多个进行串联表达，分别设计如seqidno:17和seqidno:18、seqidno:19和seqidno：20、seqidno:21和seqidno22、seqidno:23和seqidno:24、seqidno:25和seqidno:26所示的特异性引物得到目的基因条带。优选实施例采用其中两种持家酶的关键表位肽进行串联表达。其中，pgm的关键表位为多肽片段pgm1,pgk的关键表位为多肽片段pgk2与多肽片段pgk3融合表达后组成的一段多肽(pgk2-3)，eno的关键表位为多肽片段eno1，hk的关键表位为多肽片段hk3。构建重组质粒，重组质粒可以用于转克隆大肠杆菌bl21(de3)宿主菌。诱导蛋白表达后，蛋白电泳检测蛋白诱导表达，重组质粒带有6×his标签，可以采用westernblot进一步验证蛋白成功表达。镍柱纯化后得到重组蛋白并测定浓度。2、以斑马鱼为实验动物的注射给药免疫保护实验获得的纯化后的重组蛋白与佐剂isa763a按照7:3的比例混合至蛋白浓度达0.3μg/μl，最终剂量为1.5μg/尾。采用鱼尾肌肉注射免疫。pbs和佐剂isa763a为阴性对照组。pgm、pgk、eno、hk全长蛋白和佐剂isa763a混合为阳性对照组。然后正常饲养，观察鱼的活动及有无死亡。免疫时间为一个月。斑马鱼免疫养殖4周后，根据野生株半数致死量ld50值，选择合适的剂量对免疫过的斑马鱼进行攻毒实验。观察并记录各组斑马鱼发病及死亡情况，计算rps。糖酵解途径中蛋白酶的关键区段重组蛋白免疫斑马鱼后的相对保护率(rps)如图5所示。图5结果显示：pgm与pgk的关键区段组合免疫后相对保护率达到了67.7％，pgm与eno的关键区段组合免疫后相对保护率达到了46.7％。pgm与hk的关键区段组合免疫后相对保护率达到了44.3％。pgk与eno的关键区段组合免疫后相对保护率达到了51.7％。pgk与hk的关键区段组合免疫后相对保护率达到了39.7％。eno与hk的关键区段组合最低也有27.3％。结论：说明关键区段组合免疫有较好的免疫作用。3、血清抗体水平分析血清取样的时间点为免疫4周后。在该时间点上，免疫组和对照组各随机取25尾斑马鱼。麻醉后的斑马鱼，用手术剪将每尾鱼的尾鳍剪断，将毛细管放置于出血点上，待血液进入毛细管约3μl时，将毛细管中的血液转移至小薄壁管中，将薄壁管放置于4℃，16h后以750g离心5min。取上层血清10μl，转移至-20℃待用。蛋白包板：将纯化后的重组蛋白用包被缓冲液稀释到20ng/ml，加入96孔elisa板，100μl/孔，每个样品设3个重复，4℃过夜；菌包板：菌液用pbs稀释至1×108cfu/ml，加入96孔elisa板，100μl/孔，每个样品设3个重复，4℃过夜。第二天倒去包被液，每孔加入200μlpbst洗涤液洗板3次，加入封闭液(pbst+2％(w/v)bsa)200μl，于22℃孵育2h。移除封闭液，用洗板液300μl洗板3次，拍干。加入鱼免疫血清，用pbst以1:40稀释待测血清，100μl/孔，将空白血清为对照做相同处理。于22℃孵育3h，用洗板液300μl洗板5次，拍干。用pbst以1:30稀释小鼠抗斑马鱼igm单克隆抗体，以100μl/孔加入待测孔22℃孵育1h，洗板5次，拍干。用pbst以1:2000稀释羊抗小鼠igg(hrp标记)，每孔加100μl，22℃孵育1h，洗板5次，拍干。加入tmb显色底物，室温避光显色5min，加入反应终止剂后于450nm下检测吸光度。血清抗体水平效价分析如图6所示。结果显示：关键区段重组疫苗免疫斑马鱼后的血清可发生特异性免疫效果。pgk2-3与pgm1的组合比其全蛋白组合血清抗体水平提高了75％，pgm1与eno1、pgm1与hk3、pgk2-3与eno1组合比全蛋白组合血清抗体水平也分别提高了15.6％、18.9％、14.0％；但eno1与hk3组合免疫效果不佳，相比较他们的全长蛋白在血清抗体水平却降低了54.5％。结论：pgk2-3与pgm1的组合免疫有较好的免疫作用。不同持家酶的关键区段组合方式产生不同效果，关键区段的组合相比较全长蛋白的组合方式在血清抗体水平部分存在协同作用，部分组合如eno1与hk3组合也存在拮抗作用。4、交叉免疫效果糖酵解途径中的酶在各海洋病原菌中氨基酸序列具有高度保守性，因此用间接elisa的方法考察重组蛋白免疫斑马鱼后的血清对其他四种主要海洋病原菌的交叉反应。这四种海洋病原菌为：鳗弧菌(v.anguillarummvm425)、嗜水气单胞菌(a.hydrophilalsa34)、哈维氏弧菌(v.harveyivib647)、溶藻弧菌(v.alginolyticusepgs020401)。以pgk2-3与pgm1的组合为优选实施例。用不同病原菌包板，血清稀释100倍作为一抗进行抗体交叉反应的检测。具体实验方法及步骤参考实施例3及参考文献2，血清抗体水平效价分析如图7所示，可见，对于这些病原菌免疫pgk2-3与pgm1组合的斑马鱼血清中抗体水平明显高于对照组pbs。表明血清中这些蛋白的特异性抗体能够识别这些病原菌的表面抗原，说明pgk2-3与pgm1组合可以作为广谱型抗原，对多种病原菌具有交叉保护作用。综上所述，本发明文针对优选抗原构建并筛选优选疫苗，用于水产养殖多病原共感染的免疫防治，为实现水产动物高产优质和构建生态健康的可持续养殖环境提供技术支撑。而且，本发明的疫苗，可以采用现有已知方法制备成药盒或试剂盒的形式，以便于本领域技术人员使用；可选地在其中还包括使用说明书。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>华东理工大学<120>水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用<141>2020-03-09<160>58<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>387<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metservalilelysmetthraspleuaspleualaglylysargval151015leuileargalaaspleuasnvalprovallysaspglylysvalthr202530seraspalaargileargalaserleuprothrilegluleualaleu354045lysglnglyalaargvalmetvalthrserhisleuglyargprothr505560gluglyglutyrasnaspalapheserleuleuprovalvalasntyr65707580leulysasphisleulysserprovalargleualalysasptyrleu859095aspglyvalaspvalalaglnglygluleuvalvalleugluasnval100105110argpheasnlysglyglulyslysaspaspgluthrleuserlyslys115120125tyralaalaleucysaspvalphevalmetaspalapheglythrala130135140hisargalaglnalaserthrhisglyvalglylysphealaproile145150155160alacysalaglyproleuleuserglygluleuglualaleuglylys165170175alaleuserasnproalaargprometvalalailevalglyglyser180185190lysvalserthrlysleuthrvalleuaspserleuserlysileala195200205aspglnleuilevalglyglyglyilealaasnthrpheilealaala210215220gluglyhisasnvalglylysserleutyrglualaaspleuilepro225230235240glualalyslysleuleuglythrcysaspileprovalprothrasp245250255valargvalalathrgluphesergluthralaproalathrmetlys260265270servalseraspilelysaspaspgluglnvalleuaspleuglyasp275280285alaseralagluglnleualaalaileleulysasnalalysthrile290295300leutrpasnglyprovalglyvalpheglupheproasnphecyslys305310315320glythrgluilevalalaasnalailealaasnseraspalapheser325330335ilealaglyglyglyaspthrleualaalaileaspleupheglyile340345350alaasplysilesertyrileserthrglyglyglyalapheleuglu355360365phevalgluglylyslysleuproalavalvalmetleuglugluarg370375380alalysgln385<210>2<211>215<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metargglnvaltyrleuilearghisglygluthrglutrpasnval151015glnargargileglnglyglnserasnserproleuthrvalmetgly202530gluglnglnalaargglnvalglyalaargleuglyglnmetglyile354045thrhisvalilealaseraspleuglyargthrglnglnthrglyglu505560ileilealaalaalacysargcysproleuthrleuaspalaargleu65707580arggluleusermetglyvalleugluserargleuleualaserleu859095serproglnglugluglntrpargleusermetleuaspglyserpro100105110glnglycysileproglnglygluthrmetalaglnleualagluarg115120125metglnglnalaleuasnaspcysleualaleuproglnglyserarg130135140provalleuvalserhisglyilealaleuglycysleuleuserthr145150155160valleuglyleuproprotyralagluargargleuargleuargasn165170175cysserleuserargvalasptyrglnglnseralatrpleualaser180185190glytrpvalvalgluthralaglyaspvalglnhisleualaglnpro195200205sermetaspgluvalleuarg210215<210>3<211>433<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metserlysilevallysvalileglyarggluileileaspserarg151015glyasnprothrvalglualagluvalhisleugluglyglypheval202530glymetalaalaalaproserglyalaserthrglyserarggluala354045leugluleuargaspglyasplysserargpheleuglylysglyval505560leulysalavalalaalavalasnglyproilealaglualaileile65707580glylysaspalalysaspglnalaasnileaspglnilemetileglu859095leuaspglythrgluasnlysserlyspheglyalaasnalaileleu100105110alavalserleualaasnalalysalaalaalaalaalalysglyleu115120125proleutyralahisilealagluleuasnglythrproglylystyr130135140sermetproleuprometmetasnileileasnglyglygluhisala145150155160aspasnasnvalaspileglngluphemetileglnprovalglyala165170175lysthrleulysglualavalargileglysergluvalphehisasn180185190leualalysvalleulysserlysglymetasnthralavalglyasp195200205gluglyglytyralaproasnleugluserasnalaalaalaleuala210215220alailelysglualavalglulysalaglytyrvalleuglylysasp225230235240valthrleualametaspcysalaalasergluphetyrasnlysglu245250255thrglymettyrgluleulysglygluglylysserphethrserasn260265270gluphethrhistyrleugluglyleuthrlysglutyrproileval275280285serilegluaspglyleuaspgluserasptrpaspglyphealatyr290295300glnthrlysvalmetglyasplysleuglnleuvalglyaspaspleu305310315320phevalthrasnthrlysileleulysgluglyileglulysglyile325330335alaasnserileleuilelyspheasnglnileglyserleuthrglu340345350thrleualaalailelysmetalalysaspalaglytyrthralaval355360365ileserhisargserglygluthrgluaspalathrilealaaspleu370375380alavalglythralaalaglyglnilelysthrglysermetserarg385390395400seraspargvalalalystyrasnglnleuileargileglugluala405410415leuglyalaalaalapropheasnglyleulysgluvallysglygln420425430his<210>4<211>321<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4metserargphealaleuvalglyaspvalglyglythrasnalaarg151015leualaleucyscysleuaspthrglycysleuglnalavalglnser202530tyrproglyglnglnpheaspserleugluservalileargthrtyr354045leuglnalaglnalavalservalthrseralacysilealaileala505560cysproilethrglyaspargvalalametthrasnhissertrpala65707580pheserileseralametglnargserleuglyleualahisleuser859095valileasnaspphethralavalsermetalavalprovalleupro100105110alagluserleuleuglnleuglyglyglnthralaglnproasparg115120125proilealailetyrglyalaglythrglyleuglyvalalahisleu130135140ileargalaglyaspargtrpileserleuproglygluglyglyhis145150155160valaspphealathrglyseraspglugluaspalaleuleuthrala165170175leuargalaaspleuglyargvalseralagluargvalleusergly180185190proglyleuvalasnleutyrargalavalalaargvalalaglyarg195200205thrproglnserleuthrproglngluvalsergluargalaleuala210215220aspargcysproaspcysargargalaleuserleuphecysvalmet225230235240metglyargpheglyglyasnleualaleuasnmetglythrphegly245250255glyvaltyrilealaglyglyilevalproargpheleualaphephe26026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