本发明涉及疫苗领域，特别涉及一种能够高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途。
背景技术：
：：疫苗是一种非常安全有效的对抗或者清除传染性疾病的方式。开发出一种能够进一步有效的提高抗体应答水平的疫苗载体，是疫苗研究领域中非常重要的目标。b细胞是体液免疫应答中至关重要的一群淋巴细胞，其在适应性免疫应答中的主要功能是分泌抗体，还能作为抗原递呈细胞发挥递呈抗原和分泌细胞因子的功能。b细胞可将抗原提呈给t辅助细胞(th)，若活化的t细胞识别b细胞提呈的肽段，则通过其自身的cd40配体与b细胞表达的cd40受体相结合进而激活b细胞。与此同时，辅助性t淋巴细胞亚群1(th1)分泌il-2,辅助性t淋巴细胞亚群2(th2)分泌il-4，滤泡辅助性t细胞(tfh)分泌il-21,直接刺激b细胞，三者联合诱导b细胞增殖分化并促进抗体类型转换，最终分化成浆细胞和记忆b细胞。浆细胞可分泌大量的抗体并作用于抗原靶标。因此，如能开发一种搭载b细胞活化相关的分子与目标抗原的疫苗载体，有望高效活化体内b细胞，诱导出强劲的体液免疫应答。基于人肿瘤细胞的人工抗原提呈细胞(artificialantigenpresentingcell,aapc)系统，已广泛用于扩增肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocyte,ctl)，其中最常用的aapc是人红白血病k562细胞株。它缺乏内源性表达hla-a、b和dr分子，经基因工程表达外源性hla-a、肿瘤抗原与其他免疫分子，可用于扩增肿瘤免疫治疗所需的抗原非特异性或特异性t细胞。本发明充分利用k562细胞的特性，搭载b细胞活化相关的分子，可在体外维持b细胞的生存与功能；搭载目标抗原后可作为一种有效的疫苗载体，诱导机体产生高效体液免疫应答。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能够高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途。一方面，本发明提供一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体，其特征在于，所述疫苗载体是经由基因工程化的k562细胞。在本发明的实施方式中，所述疫苗载体是经由基因工程化表达b细胞活化相关的分子的k562细胞，所述b细胞活化相关的分子包括cd40l、il-4、il-21、b细胞活化因子(baff)、霍乱毒素b亚单位(choleratoxinbsubunit,ctb),c-x-c趋化因子受体5(c-x-cchemokinereceptortype5,cxcr5)以及上述不同因子的组合。在本发明的实施方式中，所述疫苗载体k562细胞经由基因工程化表达cxcr5、ccr7或cd62l。在本发明的实施方式中，所述高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体，其特征在于，搭载所述b细胞活化相关的分子的蛋白，其中搭载b细胞活化相关的分子的蛋白包括经过修饰的蛋白、蛋白分子或其部分序列与其他分子融合表达形成的融合蛋白、以及蛋白来源的多肽片段；融合表达的方式包括与抗体的fc序列融合、与不同信号肽的融合或与细胞因子融合。在本发明的实施方式中，所述疫苗载体k562细胞基因工程化表达免疫原，免疫原表达部位包括细胞内、细胞膜上或分泌性表达。在本发明的实施方式中，疫苗载体k562细胞基因工程化表达的免疫原来源包括病毒、细菌、肿瘤抗原或人源蛋白分子。在本发明的实施方式中，所述病毒包括流感病毒、冠状病毒、副粘病毒、风疹病毒、艾滋病病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、流行性脑炎病毒、登革病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、黄热病毒、汉坦病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、狂犬病毒、痘病毒或布尼亚病毒。在本发明的实施方式中，所述流感病毒包括人流感病毒、禽流感病毒，所述冠状病毒包括sars、mers、sars-cov-2、蝙蝠冠状病毒(bat-cov),所述副粘病毒包括副流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、人偏肺病毒。在本发明的实施方式中，所述病毒免疫原来自于病毒囊膜蛋白，包括血凝素蛋白(hemagglutinin,ha)、神经氨酸酶(neuraminidase，na)、基质蛋白(matrixprotein,m)、包膜蛋白(envelope)、刺突蛋白(spike)、膜蛋白(membrane,m)、溶血素(haemolysin,hl)、融合蛋白(fusion,f)、黏附蛋白(g)。在本发明的实施方式中，所述肿瘤抗原，包括cd19、bcma、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd47、cd52、cd70、cd117、cd123、cd133、cd138、cd147、cd171、rankl、nkg2dl、her2、muc1、muc16、cea、epcam、il-13rα2、egfr、egfrviii、gd2、dr5、epha2、frα、psca、psma、tarp、pigf、cmet、vegfr2、bcma、ctla-4、pd-l1、afp、gpc3、axl、ror1、ror2、fap、mesothelin、dll3、cld18、pdgf-rα、slamf7和/或ccr4。在本发明的实施方式中，所述人源蛋白分子，包括人的细胞膜上蛋白分子。在本发的实施方式中，所述疫苗载体搭载抗原后，与不同的佐剂组合形成疫苗，所用佐剂包括铝盐佐剂、cpg佐剂、锰佐剂、mf59佐剂、qs21佐剂、tlr配体佐剂、nod通路佐剂、干扰素佐剂、cgas/sting通路佐剂、细胞因子佐剂、pd-1阻断抗体、ctla-4阻断抗体、tigit阻断抗体、αgalcer及其衍生物佐剂，所述细胞因子佐剂包括il-12、gm-csf、il-18、il-21。另一方面，本发明提供了一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)分别构建含有cd40l、il-4、il-21、baff蛋白分子、霍乱毒素b亚单位、cxcr5、ccr7或cd62l的载体；2)将含有cd40l、il-4、il-21、baff蛋白分子、霍乱毒素b亚单位、cxcr5、ccr7或cd62l的载体感染、转染或者电转处理k562细胞，进行优选单克隆整合有cd40l、il-4、il-21、baff、霍乱毒素b亚单位、cxcr5、ccr7或cd62l的细胞系，即得。进一步地，将cd40l、il-4、il-21、baff、霍乱毒素b亚单位、cxcr5、ccr7或cd62l蛋白基因表达于慢病毒载体、质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或cmv载体。进一步地，将cd40l、il-4、il-21、b细胞活化因子、霍乱毒素b亚单位、cxcr5、ccr7或cd62l蛋白基因表达于慢病毒载体。进一步地，cd40l、il-4、il-21、baff、霍乱毒素b亚单位、cxcr5，ccr7或cd62l蛋白基因，可以是单独表达在k562细胞上，也可以是两两组合，或者三三组合，四四组合，五五组合亦或是六六组合，也可以是全部都表达在k562细胞上。再一方面，本发明提供了一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体的使用方法，其特征在于，用活的细胞载体疫苗、灭活的细胞载体疫苗以及细胞载体疫苗分泌的外泌体作为疫苗进行免疫接种；或将表达免疫原以及b细胞激活分子的细胞膜装载到其他纳米颗粒材料上形成纳米颗粒疫苗进行免疫接种。进一步地，采用包括x-射线、热灭活、固定剂、裂解剂对细胞疫苗载体进行灭活。进一步地，利用该k562载体所制备的疫苗给药方式，包括静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、黏膜给药、滴鼻、点眼、或气雾免疫接种。进一步地，利用所述k562细胞载体进行体外b细胞的生存和增殖，利用所述k562细胞载体疫苗搭载抗原免疫动物获得抗体并将抗体用于科研、临床药物以及car-t的识别区、bite的识别区，以及作为疫苗载体诱导体液免疫应答时可单独给药或与其他治疗技术联合应用。进一步地，疫苗载体使用的hiv-1膜蛋白亚型包括hiv-1a、b、c、d、f、g、h、j、k亚型以及不同型别间形成的重组型，包括crf01-ae、crf07-bc、crf08-bc、ag重组型。进一步地，疫苗载体使用的hiv-1膜蛋白来源包括ae2f、rl42、cn54。在本发明的实施方式中，优选地，所述b细胞活化相关分子蛋白包含选自以下的人源氨基酸序列：(i)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:7所示的氨基酸序列；(ii)与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:7所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的序列。优选地，所述b细胞活化相关分子蛋白的编码核苷酸序列如seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6或seqidno:8所示。另外，所述b细胞活化相关分子蛋白可以是将seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:7所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代，缺失或添加而形成的不影响其分子功能。所述b细胞活化相关分子蛋白的编码核苷酸序列可以是将seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6或seqidno:8所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的不影响其编码蛋白质功能。根据本发明所述的用途，其中包括该细胞疫苗载体的可复制与不可复制形式、及其分泌的外泌体作为疫苗进行免疫接种。在本发明的一个具体实施方案中，在上述疫苗组合接种过程中，疫苗接种方式包括但不限于静脉注射、肌肉接种、皮内接种、皮下接种生殖道、直肠等。在本发明的实施方式中，优选地，所述hiv-1膜蛋白包含选自以下的氨基酸序列：(i)seqidno:9所示的氨基酸序列；(ii)与seqidno:9所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与seqidno:9所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。优选地，所述hiv-1膜蛋白的编码核苷酸序列如seqidno:10所示。另外，所述hiv-1膜蛋白可以是将seqidno:9所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的不影响其分子功能。所述hiv-1膜蛋白的编码核苷酸序列可以是将seqidno:10所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的不影响其编码蛋白质功能。在本发明的一个具体实施方案中，疫苗载体使用的流感病毒的血凝素(ha)形式包括但不限于单纯膜蛋白、修饰后的膜蛋白与融合蛋白。优选地，所述ha蛋白包含选自以下的氨基酸序列：(i)seqidno:11所示的氨基酸序列；(ii)与seqidno:11所示的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与seqidno:11所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。优选地，所述ha蛋白的编码核苷酸序列如seqidno:12所示。另外，所述ha蛋白可以是将seqidno:11所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的不影响其分子功能。所述ha蛋白的编码核苷酸序列可以是将seqidno:12所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的不影响其编码蛋白质功能。本发明的有益效果在于，所述疫苗载体能够有效活化b细胞，提升b细胞的生存，并促使b细胞分泌抗体，在体内也可有效的刺激b细胞成熟分化从而诱导有效的抗体应答，使其在预防和降低病毒感染中有应用前景。附图说明图1显示了慢病毒表达载体质粒phage-ctb-t2a-cd40l-puro的构建与搭载蛋白的表达验证。包括整合人cd40l与ctb基因的慢病毒表达载体质粒pphage-ctb-t2a-cd40l-puro表达图谱(图1a)；所述慢病毒表达载体包装的慢病毒感染k562细胞后，cd40l表达的验证(图1b)与ctb表达的验证(图1c)。图2显示了慢病毒表达载体质粒phage-il-4-t2a-il-21-zsgreen1的构建与搭载细胞因子的表达验证。包括整合人il-4和il-21基因的慢病毒表达载体质粒phage-il-4-t2a-il-21-zsgreen1表达图谱(图2a)；所述慢病毒表达载体包装的慢病毒感染k562细胞后，il4的表达验证(图2b)与il-21表达的验证(图2c)。图3显示了慢病毒表达载体质粒phage-baff-puro的构建与活化分子的表达验证。包括整合人baff基因的慢病毒表达载体质粒phage-baff-puro表达图谱(图3a)；及所述慢病毒表达载体包装的慢病毒感染k562细胞后，baff蛋白表达的验证(图3b)。图4显示了慢病毒表达载体质粒phage-il-4-t2a-il-21-ires-cxcr5-zsgreen1的构建与活化分子的表达验证。包括整合人cxcr5基因的慢病毒表达载体质粒phage-il-4-t2a-il-21-ires-cxcr5-zsgreen1表达图谱(图4a)；及所述慢病毒表达载体包装的慢病毒感染k562细胞后，cxcr5蛋白表达的验证(图4b)。图5显示了慢病毒表达载体质粒phage-ae2fsosip.664-zsgreen1的构建与抗原蛋白表达验证。包括整合ae2fsosip.664基因的慢病毒表达载体质粒phage-ae2fsosip.664-zsgreen1表达图谱(图5a)；及所述慢病毒表达载体包装的慢病毒感染k562细胞后，ae2fsosip.664表达的验证(图5b)。图6显示了慢病毒表达载体质粒(phage-ha1-flag-cd8tm-zsgreen)的构建与搭载抗原蛋白的表达验证。包括整合有ha的基因的慢病毒表达载体质粒phage-ha1-flag-cd8tm-zsgreen表达图谱(图6a)；及所述慢病毒表达载体包装的慢病毒感染k562细胞后，ha蛋白表达的验证(图6b)。图7显示了含有b细胞活化相关因子体外对b细胞的作用。图7a为流式细胞技术分析转载有cd40l、il-4、il-21与ctb四种b细胞活化相关的分子并带有baff的k562细胞，在体外能明显提升b细胞的存活。图7b为酶联免疫吸附测定法(elisa)分析显示，转载有cd40l、il-4、il-21与ctb四种b细胞活化相关的分子并带有baff的k562细胞，在体外能促进b细胞分泌抗体。图7c为流式细胞技术分析转载有cd40l、il-4、il-21与baff四种b细胞活化相关的分子并带有cxcr5的k562细胞，在体外能明显提升b细胞的存活。图7d为酶联免疫吸附测定法(elisa)分析显示，转载有cd40l、il-4、il-21与baff四种b细胞活化相关的分子并带有cxcr5的k562细胞，在体外能促进b细胞分泌抗体。图8所示为带有ae2fsosip.664抗原的四因子k562细胞在恒河猴体内抗体的诱导效果。如图所示，装载有四因子并带有hiv-1抗原ae2fsosip.664的k562细胞免疫中国恒河猴后，可显著提升针对hiv-1的特异性抗体。图9所示为带有ha抗原的四因子k562细胞在恒河猴体内抗体的诱导效果。如图所示，装载有四因子并带有流感病毒抗原ha的k562细胞免疫中国恒河猴后，可显著提升针对ha蛋白的特异性抗体。具体实施方案下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。阅读以下公开的实施方案的详细描述和所附权利要求后，本发明的这些和其它特征和优点将变得显而易见。实施例一：人cd40l与ctb基因的慢病毒表达载体phage-ctb-t2a-cd40l-puro的构建以及表达验证1.1带人cd40l与ctb基因目的基因的phage载体构建人工合成人源cd40l与ctb的dna序列：为了增强ctb的分泌，ctb的5’端加有cd8的信号肽，两个基因之间加t2a序列，进行基因的双表达。合成的序列如seqidno:2所示，序列5’端带有noti酶切位点，3’端带有bamhi酶切位点。双酶切合成的片段与载体质粒：用noti酶切(thermoscientific公司，货号fd0596)与bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出人cd40l与ctb基因的慢病毒表达质粒(phage-ctb-t2a-cd40l-puro)，质粒构建图谱如图1a所示。1.2含有人cd40l与ctb基因的载体phage-ctb-t2a-cd40l-puro的慢病毒包装取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将带有人cd40l与ctb的phage-ctb-t2a-cd40l-puro，慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的人cd40l与ctb慢病毒。1.3含有人cd40l与ctb基因的k562细胞的表达验证准备5×105的k562细胞，用500μl完全细胞培养基重悬，放置于12孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入步骤1.2中浓缩的病毒100μl，1000g，离心2小时。离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12小时左右，将培养基换成1μg/ml的嘌呤霉素细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有cd40l基因的细胞。取上述感染后存活的k562细胞，用anti-cd40l-pe的抗体(biolegend公司，型号310805)进行染色，最后用流式细胞术(bdpharminge公司，型号forttesa)分析。并将阳性的细胞不断的进行流式细胞分选富集，最终获得有高表达cd40l的k562细胞。结果显示，不断富集后的能够在k562细胞中高表达目的基因人cd40l(图1b)；所用的一抗分别为anti-ctb的小鼠血清，二抗分别为hrp标记山羊抗小鼠(中杉金桥公司，货号zb-2305)。结果显示，利用蛋白质免疫印迹方法能检测到带有cd8信号肽的ctb蛋白的高表达，单独ctb有少量表达(图1c)。实施例二：人il-4与il-21基因的慢病毒表达载体phage-il-4-t2a-il-21-zsgreen1的构建以及表达验证2.1带人il-4与il-21目的基因的phage载体构建人工合成人来源il-4与il-21的dna序列，两种基因之间加入t2a片段用于双表达。合成的序列如seqidno:4所示，序列5’端带有noti酶切位点，3’端带有bamhi酶切位点。用noti酶切(thermoscientific公司，货号fd0596)与bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)双酶切合成的片段与载体质粒，并进行切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收片段与载体酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)。将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出人来源il-4与il-21基因的慢病毒表达质粒(phage-il-4-t2a-il-21-zsgreen1)，质粒构建图谱如图2a所示。2.2含有人il-4与il-21基因的载体phage-il-4-t2a-il-21-zsgreen1的慢病毒包装取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将带有人il-4与il-21的phage-il-4-t2a-il-21-zsgreen1，慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的il-4与il-21慢病毒。2.3含有人il-4与il-21基因的k562细胞的表达验证准备5×105表达cd40l与ctb的k562细胞，用500μl完全细胞培养基重悬，放置于12孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入步骤1.2中浓缩的病毒100μl，1000g，离心2小时离心。离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养48小时左右。取上述感染后的k562细胞，由于表达载体质粒带有绿色荧光标签，将绿色荧光阳性的细胞不断的进行流式细胞分选富集，最终获得有高表达il-4与il-21的k562细胞。用anti-il4-apc的抗体(biolegend公司，型号500714)与anti-il-21-bv421的抗体(bdpharminge公司，型号564755)进行染色，最后用流式细胞术(bdpharminge公司，型号forttesa)分析。结果显示，不断富集后能够在k562细胞中高表达目的基因人il-4与il-21(图2b，2c)。实施例三：人baff基因的慢病毒表达载体phage-baff-puro的构建以及表达验证3.1带人baff目的基因的phage载体构建人工合成人baff基因的dna序列。合成的序列如seqidno:6所示，序列5’端带有noti酶切位点，3’端带有bamhi酶切位点。用noti酶切(thermoscientific公司，货号fd0596)与bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)双酶切合成的片段与载体质粒，并进行切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收片段与载体酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)。将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出人baff基因的慢病毒表达质粒(phage-baff-puro)，质粒构建图谱如图3a所示。3.2含有人baff基因的载体phage-baff-puro的慢病毒包装取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将带有人baff的phage-baff-puro，慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的人baff慢病毒。3.3含有人baff基因的k562细胞的表达验证准备同时表达cd40l、ctb、il-4与il-21的5×105的k562细胞，用500μl完全细胞培养基重悬，放置于12孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入步骤1.2中浓缩的病毒100μl，1000g，离心2小时。离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12小时左右，将培养基换成1μg/ml的嘌呤霉素细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有cd40l基因的细胞。取上述感染后存活的k562细胞，用anti-baff-apc的抗体(biolegend公司，型号366508)进行染色，最后用流式细胞术分析。并将阳性的细胞不断的进行流式细胞分选富集，最终获得有高表达baff的k562细胞。结果显示，不断富集后能够在k562细胞中高表达目的基因人baff(图3b)。实施例四：人cxcr5基因的慢病毒表达载体phage-il-4-t2a-il-21-ires-cxcr5的构建以及表达验证4.1带人cxcr5目的基因的phage载体构建人工合成人cxcr5基因的dna序列。合成的序列如seqidno:8所示，序列5’端带有noti酶切位点，3’端带有sali酶切位点。用noti酶切(thermoscientific公司，货号fd0596)与sali酶切(thermoscientific公司，fd0644)双酶切合成的片段与载体质粒，并进行切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收片段与载体酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)。将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出人cxcr5基因的慢病毒表达质粒(phage-il-4-t2a-il-21-ires-cxcr5)，质粒构建图谱如图4a所示。4.2含有人cxcr5基因的载体phage-il-4-t2a-il-21-ires-cxcr5的慢病毒包装取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将带有人cxcr5的phage-il-4-t2a-il-21-ires-cxcr5，慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的人baff慢病毒。4.3含有人cxcr5基因的k562细胞的表达验证准备5×105的k562细胞，用500μl完全细胞培养基重悬，放置于12孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入步骤1.2中浓缩的病毒100μl，1000g，离心2小时。离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12小时左右。取上述感染后存活的k562细胞，用anti-cxcr5-apc/cy7的抗体(biolegend公司，型号356926)进行染色，最后用流式细胞术分析。并将阳性的细胞不断的进行流式细胞分选富集，最终获得有高表达cxcr5的k562细胞。结果显示，不断富集后能够在k562细胞中高表达目的基因人cxcr5(图4b)。实施例五：ae2fsosip.664基因的慢病毒表达载体phage-ae2fsosip.664-zsgreen1的构建以及表达验证5.1带ae2fsosip.664目的基因的phage载体构建人工合成ae2fsosip.664基因的dna序列。合成的序列如seqidno:10所示，序列5’端带有noti酶切位点，3’端带有bamhi酶切位点。用noti酶切(thermoscientific公司，货号fd0596)与bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)双酶切合成的片段与载体质粒，并进行切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收片段与载体酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)。将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出人baff基因的慢病毒表达质粒(phage-ae2fsosip.664-zsgreen1)，质粒构建图谱如图5a所示。5.2含有ae2fsosip.664基因的载体phage-ae2fsosip.664-zsgreen1的慢病毒包装取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将带有ae2fsosip.664的phage-ae2fsosip.664-zsgreen1，慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。37℃，5％的孵箱培养48小时，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的ae2fsosip.664慢病毒。5.3含有ae2fsosip.664基因的k562细胞的表达验证准备同时表达cd40l、ctb、il-4与il-21的5×105的k562细胞，用500μl完全细胞培养基重悬，放置于12孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入步骤1.2中浓缩的病毒100μl，1000g，离心2小时。离心感染结束后，用1μg/ml的嘌呤霉素细胞培养基，继续在37℃，5％的孵箱培养。取上述感染后的k562细胞，用anti-hiv-1的血清进行染色，最后用流式细胞术分析。并将阳性的细胞不断的进行流式细胞分选富集，最终获得有高表达ae2fsosip.664的k562细胞。结果显示，不断富集后能够在k562细胞中高表达目的基因ae2fsosip.664(图5b)。实施例六：ha基因的慢病毒表达载体phage-ha1-flag-cd8tm-zsgreen1的构建以及表达验证6.1带ha目的基因的phage载体构建人工合成ha基因的dna序列。合成的序列如seqidno:12所示，序列5’端带有noti酶切位点，3’端带有bamhi酶切位点。用noti酶切(thermoscientific公司，货号fd0596)与bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)双酶切合成的片段与载体质粒，并进行切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收片段与载体酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)。将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出人baff基因的慢病毒表达质粒(phage-ha1-flag-cd8tm-zsgreen1)，质粒构建图谱如图6a所示。6.2含有ha基因的载体phage-ha1-flag-cd8tm-zsgreen1的慢病毒包装取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将带有ha的phage-ae2fsosip.664-zsgreen1，慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。37℃，5％的孵箱培养48小时，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的ha慢病毒。6.3含有ha基因的k562细胞的表达验证准备同时表达cd40l、ctb、il-4与il-21的5×105的k562细胞，用500μl完全细胞培养基重悬，放置于12孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入步骤1.2中浓缩的慢病毒100μl，1000g，离心2小时。离心感染结束后，用1μg/ml的嘌呤霉素细胞培养基，继续在37℃，5％的孵箱培养。取上述感染后的k562细胞，用anti-flag-pe的抗体进行染色(biolegend公司，货号37310)，最后用流式细胞术分析。并将阳性的细胞不断的进行流式细胞分选富集，最终获得有高表达ha的k562细胞(图6b)。实施例七：含有b细胞活化相关因子在体外对b细胞的作用采用磁珠分选方法从人pbmc中分选b细胞，将磁珠分选后的人b细胞(1e4)、分别与同等数量的如下三种细胞放置于96孔板中共孵育：(1)k562对照细胞；(2)装载有cd40l、il-4、il-21与ctb四种b细胞活化因子的k562细胞；(3)装载有cd40l、il-4、il-21与ctb四种b细胞活化因子并带有baff的k562细胞。共孵育14天后，采用流式细胞术检测孔内的b细胞的存活情况及比例；用人igg检测试剂盒(thermoscientific公司，货号88-50550-22)检测igg的含量。如图7所示，装载有四因子(包括cd40l、il-4、il-21与ctb四种b细胞活化因子)k562细胞、及在四因子基础上搭载baff基因k562细胞(图7a)，在体外能够提升b细胞的存活时间与增加细胞的数目。相比对照k562细胞，b细胞总抗体分泌水平(igg)，在加持四因子组可提升约11倍，在此之上搭载baff之后可进一步提升至16倍(图7b)。采用磁珠分选方法从人pbmc中分选b细胞，将磁珠分选后的人b细胞(1e4)、分别与同等数量的如下三种细胞放置于96孔板中共孵育：(1)k562对照细胞；(2)装载有cd40l、il-4、il-21与baff四种b细胞活化因子的k562细胞；(3)装载有cd40l、il-4、il-21与baff四种b细胞活化因子并带有cxcr5的k562细胞。共孵育14天后，通过cd19分子标记人b细胞(biolegend公司，货号hib19)，采用流式细胞术检测孔内的b细胞的数目；并用人igg检测试剂盒(thermoscientific公司，货号88-50550-22)检测igg的含量。装载有四因子(包括cd40l、il-4、il-21与baff四种b细胞活化因子)k562细胞、及在四因子基础上搭载cxcr5基因k562细胞(图7c)，在体外能够提升b细胞的存活数目，相较k562细胞组，四因子的能够提升超过3倍，而五因子的能近4倍。相比对照k562细胞，b细胞总抗体分泌水平(igg)，在加持四因子组可提升约5倍，在此之上搭载cxcr5之后可进一步提升至11倍(图7d)。实施例八：带有ae2fsosip.664抗原的四因子k562细胞的体内抗体的诱导评价采用中国恒河猴(n＝3)进行免疫。免疫前2周采集本底血，第0周初免2.5×107的带有ae2fsosip.664抗原的四因子k562细胞，并在免疫后第1周以及第2周采集外周血，分离血浆，用elisa的方法检测hiv-1特异性抗体的滴度。如图8所示，装载有四因子并带有hiv-1抗原ae2fsosip.664的k562细胞免疫中国恒河猴后，可显著提升针对hiv-1的特异性抗体，平均滴度可达到1：25600，说明本发明的载体搭载hiv-1抗原后，有较强的免疫原性。实施例九：带有ha抗原的四因子k562细胞的体内抗体的诱导效果评价采用中国恒河猴(n＝3)进行免疫。免疫前2周采集本底血，第0周初免1mg表达ha的dna疫苗，免疫后2周采集外周血；在第4周第一次加强免疫1.5×107的带有ha抗原的四因子k562细胞，并在免疫后2周，4周分别采集外周血，分离血浆；在第11周第二次加强免疫2×107的带有ha抗原的四因子k562细胞，并在免疫后1周、3周、10周分别采集外周血，分离血浆，用elisa的方法检测ha特异性抗体的滴度。如图9结果显示，装载有四因子并带有流感病毒抗原ha的k562细胞免疫中国恒河猴后，可显著提升针对ha蛋白的特异性抗体，平均滴度可达到1：25600；第二次加强免疫后，能继续提升抗体滴度到1：51200，而且能够维持较高滴度的抗体浓度，直至21周。该实施例说明，本发明载体搭载流感抗原后，不仅有较强的免疫原性，而且能够在体内持续诱导较高水平的抗体应答。序列表<110>上海市公共卫生临床中心<120>一种高效诱导机体体液免疫应答的疫苗载体、其制备方法及用途<141>2020-03-25<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>407<212>prt<213>human<400>1metilelysleulyspheglyvalphephethrvalleuleuserser151015alatyralahisglythrproglnasnilethraspleucysalaglu202530tyrhisasnthrglniletyrthrleuasnasplysilephesertyr354045thrgluserleualaglylysargglumetalaileilethrphelys505560asnglyalailepheglnvalgluvalproglyserglnhisileasp65707580serglnlyslysalailegluargmetlysaspthrleuargileala859095tyrleuthrglualalysvalglulysleucysvaltrpasnasnlys100105110thrprohisalailealaalailesermetalaasnleugluglugly115120125argglyserleuleuthrcysglyaspvalglugluasnproglypro130135140thrargmetilegluthrtyrasnglnthrserproargseralaala145150155160thrglyleuproilesermetlysilephemettyrleuleuthrval165170175pheleuilethrglnmetileglyseralaleuphealavaltyrleu180185190hisargargleuasplysilegluaspgluargasnleuhisgluasp195200205phevalphemetlysthrileglnargcysasnthrglygluargser210215220leuserleuleuasncysglugluilelysserglnphegluglyphe225230235240vallysaspilemetleuasnlysglugluthrlyslysgluasnser245250255pheglumetglnlysglyaspglnasnproglnilealaalahisval260265270ileserglualaserserlysthrthrservalleuglntrpalaglu275280285lysglytyrtyrthrmetserasnasnleuvalthrleugluasngly290295300lysglnleuthrvallysargglnglyleutyrtyriletyralagln305310315320valthrphecysserasnargglualaserserglnalapropheile325330335alaserleucysleulysserproglyargphegluargileleuleu340345350argalaalaasnthrhisserseralalysprocysglyglnglnser355360365ilehisleuglyglyvalphegluleuglnproglyalaservalphe370375380valasnvalthraspproserglnvalserhisglythrglyphethr385390395400serpheglyleuleulysleu405<210>2<211>1224<212>dna<213>human<400>2atgatcaagctgaagttcggcgtgttcttcaccgtgctgctgagcagcgcctacgcccac60ggcaccccccagaacatcaccgacctgtgcgccgagtaccacaacacccagatctacacc120ctgaacgacaagatcttcagctacaccgagagcctggccggcaagcgcgagatggccatc180atcaccttcaagaacggcgccatcttccaggtggaggtgcccggcagccagcacatcgac240agccagaagaaggccatcgagcgcatgaaggacaccctgcgcatcgcctacctgaccgag300gccaaggtggagaagctgtgcgtgtggaacaacaagaccccccacgccatcgccgccatc360agcatggccaacctcgaggagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggag420aatcctggcccaacgcgtatgatcgaaacatacaaccaaacttctccccgatctgcggcc480actggactgcccatcagcatgaaaatttttatgtatttacttactgtttttcttatcacc540cagatgattgggtcagcactttttgctgtgtatcttcatagaaggttggacaagatagaa600gatgaaaggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgatacagagatgcaacaca660ggagaaagatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagccagtttgaaggcttt720gtgaaggatataatgttaaacaaagaggagacgaagaaagaaaacagctttgaaatgcaa780aaaggtgatcagaatcctcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaaaaca840acatctgtgttacagtgggctgaaaaaggatactacaccatgagcaacaacttggtaacc900ctggaaaatgggaaacagctgaccgttaaaagacaaggactctattatatctatgcccaa960gtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccatttatagccagcctctgc1020ctaaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgcaaatacccacagttcc1080gccaaaccttgcgggcaacaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaaccaggt1140gcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccatggcactggcttcacg1200tcctttggcttactcaaactctga1224<210>3<211>337<212>prt<213>human<400>3metglyleuthrserglnleuleuproproleuphepheleuleuala151015cysalaglyasnphevalhisglyhislyscysaspilethrleugln202530gluileilelysthrleuasnserleuthrgluglnlysthrleucys354045thrgluleuthrvalthraspilephealaalaserlysasnthrthr505560glulysgluthrphecysargalaalathrvalleuargglnphetyr65707580serhishisglulysaspthrargcysleuglyalathralaglngln859095phehisarghislysglnleuileargpheleulysargleuasparg100105110asnleutrpglyleualaglyleuasnsercysprovallysgluala115120125asnglnserthrleugluasnpheleugluargleulysthrilemet130135140argglulystyrserlyscysserserleuglugluglyargglyser145150155160leuleuthrcysglyaspvalglugluasnproglyprothrargmet165170175argserserproglyasnmetgluargilevalilecysleumetval180185190ilepheleuglythrleuvalhislysserserserglnglyglnasp195200205arghismetileargmetargglnleuileaspilevalaspglnleu210215220lysasntyrvalasnaspleuvalproglupheleuproalaproglu225230235240aspvalgluthrasncysglutrpseralaphesercyspheglnlys245250255alaglnleulysseralaasnthrglyasnasngluargileileasn260265270valserilelyslysleulysarglysproproserthrasnalagly275280285argargglnlyshisargleuthrcysprosercysaspsertyrglu290295300lyslysproprolysglupheleugluargphelysserleuleugln305310315320lysmetilehisglnhisleuserserargthrhisglysergluasp325330335ser<210>4<211>1014<212>dna<213>human<400>4atgggtctcacctcccaactgcttccccctctgttcttcctgctagcatgtgccggcaac60tttgtccacggacacaagtgcgatatcaccttacaggagatcatcaaaactttgaacagc120ctcacagagcagaagactctgtgcaccgagttgaccgtaacagacatctttgctgcctcc180aagaacacaactgagaaggaaaccttctgcagggctgcgactgtgctccggcagttctac240agccaccatgagaaggacactcgctgcctgggtgcgactgcacagcagttccacaggcac300aagcagctgatccgattcctgaaacggctcgacaggaacctctggggcctggcgggcttg360aattcctgtcctgtgaaggaagccaaccagagtacgttggaaaacttcttggaaaggcta420aagacgatcatgagagagaaatattcaaagtgttcgagcctcgaggagggcagaggaagt480ctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggcccaacgcgtatgagatccagtcct540ggcaacatggagaggattgtcatctgtctg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