喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物、制备方法与应用与流程

本发明涉及纳米药物合成技术领域，具体涉及一种刺激响应的线粒体靶向喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物及其制备方法与应用。

背景技术：

癌症正严重威胁人类的生命健康，在中国，每年死于癌症的人数超过百万。因此，癌症的治疗在医药领域成为热门的研究话题。由于具备高效的递送效率、特定的靶向功能等优势，纳米药物在治疗癌症方面显示出巨大的潜力。不同的纳米载体如脂质体、聚合物胶束、无机纳米粒子等被广泛应用来制备纳米药物从而提高化疗药物的安全性和治疗效果。尽管有许多药物载体被文献报道，但是由于低的载药量以及短期和长期的毒性等问题，到目前为止仅有很少一部分纳米药物载体被fda批准用于临床。因此，探索简单、高效的方法制备无载体的纳米药物尤为重要。

超分子自组装形成的纳米粒子在优化成像信号、控制药物释放及提高药物治疗效果等领域发挥了重要作用。大量的工作致力于开发基于弱相互作用自组装的有机分子。这些有机分子具备结构多样性、高的生物可降解性以及可调控的多功能性，这样的结构为其在纳米药物领域提供了广泛的应用。此外，这些有机纳米粒子可以通过增强的渗透滞留效应提高纳米粒子的被动靶向功能，从而提高疾病的诊断和治疗效果。

线粒体在细胞的新陈代谢过程中发挥重要作用，因此线粒体靶向的药物递送是非常有潜力的癌症治疗措施。在众多线粒体靶向方法中，非定域的亲脂性阳离子是最常见的一类结构，这些线粒体靶向结构通常与其他小分子偶联或者直接修饰在纳米载体的表面。相比于正常细胞，癌细胞的线粒体膜带有更强负电性，导致阳离子靶向基团倾向于在癌细胞的线粒体中聚集。黄连素是一种异喹啉生物碱，拥有许多生物活性，如抗癌、抗微生物、抗炎等。值得注意的是，黄连素由于其特殊的离域正电荷结构，也能够选择性的在癌细胞线粒体中积聚。而且，黄连素还能通过多种方式如降低线粒体膜电位、调高活性氧等方式诱导细胞凋亡。

喜树碱及其类似物通过与拓扑异构酶i相结合，阻止癌细胞dna复制，从而实现抑制癌细胞的增殖。到目前为止，已有许多喜树碱类似物应用于临床并对肺癌、卵巢癌、宫颈癌等发挥作用。但是，随着临床上的长时间使用，药物的耐药性也随之产生。此外，化疗虽然是临床上主要的治疗方式，但也有诸如严重的副反应、高复发性等缺点。因此，为了解决这些问题，新的治疗方式应运而生。作为用于肿瘤治疗的代表性和非侵入性方法，集成了光热转换剂的光热疗法(ptt)可以将吸收的光转换为热能，以破坏局部癌细胞，同时减少对正常细胞的副作用。而且，将化疗和光热治疗联合使用的组合疗法在临床应用中具有巨大的优势，因为它可以利用两种治疗方式的优点，同时克服每种治疗方式的缺点。谷胱甘肽(gsh)是一种强的生物还原性三肽，在一定浓度下可以断裂二硫键。癌细胞中线粒体比正常组织中的gsh含量更高，足以还原二硫键。

技术实现要素：

发明目的：鉴于现有癌症的化疗、纳米药物载体存在的上述问题以及组合治疗和线粒体靶向给药表现的优势，本发明的目的之一在于提供一种喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物；本发明的目的之二在于提供喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的制备方法；本发明的目的之三在于提供喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的应用。

本专利通过二硫键将喜树碱与黄连素偶联，然后在水中与光敏剂吲哚菁绿共组装形成具有线粒体靶向的无载体纳米药物，从而达到线粒体靶向给药，实现抗肺癌作用，同时也解决了由于载体带来的安全性问题。

技术方案：本发明所述的喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的合成方法，包括如下步骤：

(1)取适量的盐酸黄连素置于单口反应容器中，高温真空条件下反应得到去甲基黄连素；

(2)去甲基黄连素与溴乙醇在乙腈作溶剂，碳酸钾作碱条件下，回流反应24h得到羟乙基黄连素；

(3)将步骤(2)中得到的羟乙基黄连素溶解于无水甲醇中，冰浴下搅拌，然后少量多次的加入硼氢化钠的甲醇溶液，反应24小时后得到还原的羟乙基黄连素；

(4)二硫代二丙酸在乙酰氯中回流得到二硫代二丙酸酐，然后与喜树碱反应得到二硫代二丙酸喜树碱；

(5)二硫代二丙酸喜树碱与还原的羟乙基黄连素在吡啶作溶剂，n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)作脱水剂，4-二甲氨基吡啶(dmap)作催化剂条件下反应得到喜树碱-黄连素偶联药物前体；

(6)喜树碱-黄连素偶联药物前体与n-溴代丁二酰亚胺(nbs)反应得到喜树碱-黄连素偶联药物；

(7)喜树碱-黄连素偶联药物与光敏剂吲哚菁绿溶解在有机溶剂中，滴到去离子水中，超声一段时间，超纯水中透析，即得到喜树碱-黄连素/吲哚菁绿共组装纳米药物。

进一步的，所述步骤(2)中去甲基黄连素与溴乙醇、乙腈、碳酸钾的物质的量之比为1:1～2:60～80:1～2。

进一步的，所述步骤(3)中羟乙基黄连素、甲醇、硼氢化钠的物质的量之比为1:120～150:1～3；

进一步的，所述步骤(1)的反应温度为180～190℃。

进一步的，所述步骤(4)二硫代二丙酸、乙酰氯、喜树碱的物质的量之比为5～10:120～150:1。

进一步的，步骤(5)中，先依次将二硫代二丙酸喜树碱、dcc和dmap溶解于吡啶中，然后在氮气保护下搅拌30～60min得到第一混合溶液，再向第一混合溶液中缓慢加入还原的羟乙基黄连素二氯甲烷溶液，反应24～48h得到喜树碱-黄连素偶联药物前体。

进一步的，步骤(5)中，还原的羟乙基黄连素、二硫代二丙酸喜树碱、n,n'-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶的物质的量之比为1:1.2～2:1.5～2.5:0.1～0.3:55。

进一步的，步骤(6)中，喜树碱-黄连素偶联药物前体溶于氯仿溶液中，搅拌30min后，然后缓慢加入nbs的氯仿溶液，继续反应24h。

进一步的，步骤(6)中，喜树碱-黄连素偶联药物前体与n-溴代丁二酰亚胺的物质的量之比为1:1～1.2。

进一步的，步骤(6)中，反应温度为30～50℃。

进一步的，步骤(7)中，所述喜树碱-黄连素与吲哚菁绿的物质的量之比为1:0.5～1.5。

进一步的，步骤(7)中，有机溶剂为乙醇、丙醇、吡啶、异丙醇、二甲基亚砜、甲醇中任意一种或几种。

进一步的，步骤(7)中，超声功率为300w，超声的时间为20～60min。

进一步的，步骤(7)中，透析时间为12～24h。

根据上述方法制备得到的喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物在制备抗癌药物制剂中的应用也在本发明的保护范围内。其中，所述肿瘤为肺癌。

本发明中喜树碱-黄连素偶联药物合成路线如下：

有益效果：本发明利用超分子共组装技术制备了喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物，实现了纳米药物的刺激响应释放，线粒体靶向给药，化疗和光热治疗联合用药。本发明所设计的新纳米药物，结果确定，易于进行重复和表征，并且具有较好的治疗作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为喜树碱-黄连素偶联药物前体的氢谱；

图2为喜树碱-黄连素偶联药物前体的高分辨质谱；

图3为喜树碱-黄连素偶联药物的氢谱；

图4为喜树碱-黄连素偶联药物的高分辨质谱；

图5为喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的透射电子显微镜(tem)形貌图；

图6为喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物分别在0时刻以及放置20天时的粒径分布图。图中的横坐标是粒径分布，纵坐标是强度；

图7为喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物在20天时间内不同时间的粒径变化图。图中横坐标是时间，纵坐标是粒径；

图8为喜树碱-黄连素偶联药物(cpt-ss-bbr)，喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物(cpt-ss-bbrnps)以及吲哚菁绿(icg)的紫外吸收谱图。图中横坐标是波长，纵坐标是吸光度；

图9为喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物中喜树碱(cpt)在37℃下分别在不同的ph，含有/不含有20mmgsh，有/无光照下的药物累计释放图，图中横坐标为时间，纵坐标为累计释放的药物量；

图10为72h喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物(有/无光照)，吲哚菁绿(有/无光照)，喜树碱-黄连素偶联药物，喜树碱等对a549的体外细胞毒性(mtt)图，图中横坐标为药物浓度，纵坐标为癌细胞存活率；

图11为培养45min及90min后喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的线粒体靶向共聚焦图，图中第一列为黄连素片段的共聚焦图片，第二列为线粒体荧光探针的共聚焦图片，第三列为第一列和第二列合并的图片，第四列为线粒体共定位相关性。

具体实施方式

为了清楚了解本发明的技术方案，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明的优选实施例详细描述如下，除详细描述的这些实施例外，本发明所包含的实施方试并不局限于此，还可以具有其他实施方式。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：去甲基黄连素的合成

向100ml圆底烧瓶中加入盐酸黄连素5g，在真空及190℃高温下加热2h，黄色的固体粉末逐渐变成暗红色粉末，得到去甲基黄连素粗产品。柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇15/1)分离，得暗红色去甲基黄连素粉末3.68g，收率85％。

实施例2：羟乙基黄连素的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例1中制备的去甲基黄连素4.22g(13.14mmol)、乙腈30ml、碳酸钾1.82g(13.14mmol)，60℃下搅拌20min，然后加入溴乙醇2.46g(19.71mmol)，升高温度至回流24h，柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇15/1)分离，得黄色羟乙基黄连素粉末5.03g，收率86％。

实施例3：还原的羟乙基黄连素的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例2中制备的羟乙基黄连素4.48g(10.07mmol)、甲醇35ml，冰浴下搅拌，然后加入硼氢化钠(0.76g,20.14mmol)的甲醇溶液，反应12h，得到还原的羟乙基黄连素粗产品，柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇15/1)分离，得白色还原的羟乙基黄连素粉末3.06g，收率82％。

实施例4：二硫代二丙酸喜树碱的合成

将二硫代二丙酸(2g,9.51mmol)溶解在乙酰氯(15ml)中回流5小时。然后去除溶剂，在过量的冰乙醚中沉淀滤渣，干燥，即得二硫代二丙酸酐粗产品。向100ml圆底烧瓶中加入制备的二硫代二丙酸酐(1.24g,6.45mmol)、喜树碱(0.45g,1.29mmol)，然后用吡啶溶解，氮气保护，冰浴下搅拌，向体系中加入dmap(0.16g,1.29mmol)的吡啶溶液。然后将混合溶液加热至70℃，继续在冰浴下反应48h。反应溶液用氯仿和稀盐酸萃取，真空干燥得到二硫代二丙酸喜树碱0.51g，收率73％。

实施例5：喜树碱-黄连素偶联药物前体的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例4中合成的二硫代二丙酸喜树碱1.57g(2.81mmol)、催化量的dmap28.09mg(0.23mmol)、dcc0.73g(3.51mmol)、吡啶10ml，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入实施例3中合成还原的羟乙基黄连素(2.0g,2.34mmol)二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到喜树碱-黄连素偶联药物前体粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇＝30/1)分离，得喜树碱-黄连素偶联药物前体2.58g，收率79％。

¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.38(s,1h),8.22(d,j＝5.7hz,1h),7.93(d,j＝5.5hz,1h),7.82(t,j＝5.5hz,1h),7.66(t,j＝5.0hz,1h),7.26(s,1h),6.86(d,j＝5.6hz,1h),6.77(d,j＝5.6hz,1h),6.70(s,1h),6.57(s,1h),5.91(s,2h),5.67(d,j＝11.4hz,1h),5.40(d,j＝11.4hz,1h),5.29–5.27(m,2h),4.36(dd,j＝7.1,3.3hz,2h),4.24(dd,j＝5.7,2.4hz,2h),4.17(dd,j＝5.2,2.3hz,1h),3.81(s,3h),3.48(s,2h),3.21(d,j＝7.2hz,3h),3.02–2.88(m,7h),2.78(t,j＝4.8hz,2h),2.70–2.56(m,2h),2.28(dd,j＝9.7,4.6hz,1h),2.16(dd,j＝9.4,5.0hz,1h),0.98(t,j＝5.0hz,3h).；esi-msm/z[m+h]⁺＝892.25649。

图1和图2分别为喜树碱-黄连素偶联药物前体的氢谱图和高分辨质谱图，证明了该化合物制备成功。

实施例6：喜树碱-黄连素偶联药物前体的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例4中合成的二硫代二丙酸喜树碱1.57g(2.81mmol)、催化量的dmap56.18mg(0.46mmol)、dcc0.73g(3.51mmol)、吡啶10ml，氮气保护，于冰浴下搅拌30min，向反应体系中加入实施例3中合成还原的羟乙基黄连素(2.0g,2.34mmol)二氯甲烷溶液，继续在冰浴下反应48h，得到喜树碱-黄连素偶联药物前体粗产品，减压蒸馏除去溶剂吡啶，然后柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇＝30/1)分离，得喜树碱-黄连素偶联药物前体2.78g，收率85％。

实施例7：喜树碱-黄连素偶联药物的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例5中合成的喜树碱-黄连素偶联药物前体450mg(0.32mmol)、氯仿20ml，室温下搅拌30min，然后向反应体系加入nbs(86.49mg,0.48mmol)的氯仿溶液，50℃下继续反应24h，得到喜树碱-黄连素偶联药物粗产品，柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇＝10/1)分离，得喜树碱-黄连素偶联药物133.57mg，收率45％。

¹hnmr(600mhz,dmso-d6,ppm):δ9.70(s,1h),8.83(s,1h),8.65(s,1h),8.16(d,j＝6.1hz,1h),8.05(dd,j＝12.5,5.5hz,2h),7.94(d,j＝6.1hz,1h),7.77(t,j＝5.1hz,1h),7.70(s,1h),7.64(t,j＝5.0hz,1h),7.13(s,1h),6.96(s,1h),6.18(s,2h),5.50–5.41(m,2h),5.23(d,j＝2.8hz,2h),4.89–4.85(m,2h),4.48(dd,j＝7.0,3.7hz,2h),4.43(dd,j＝6.5,4.3hz,2h),4.03(s,3h),3.15–3.11(m,2h),3.00–2.90(m,6h),2.77(t,j＝4.5hz,2h),2.12(dt,j＝7.1,4.7hz,2h),0.91(t,j＝4.9hz,3h).；esi-msm/z[m-br]⁺＝888.22594。

图3和图4分别为喜树碱-黄连素偶联药物的氢谱图和高分辨质谱图，证明了该化合物制备成功。

实施例8：喜树碱-黄连素偶联药物的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例5中合成的喜树碱-黄连素偶联药物前体450mg(0.32mmol)、氯仿20ml，室温下搅拌30min，然后向反应体系加入nbs(57.66mg,0.32mmol)的氯仿溶液，50℃下继续反应24h，得到喜树碱-黄连素偶联药物粗产品，柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇＝10/1)分离，得喜树碱-黄连素偶联药物103.88mg，收率35％。

实施例9：喜树碱-黄连素偶联药物的合成

向100ml圆底烧瓶中加入实施例5中合成的喜树碱-黄连素偶联药物前体450mg(0.32mmol)、氯仿20ml，室温下搅拌30min，然后向反应体系加入nbs(86.49mg,0.48mmol)的氯仿溶液，室温下继续反应24h，得到喜树碱-黄连素偶联药物粗产品，柱层析(洗脱机：二氯甲烷/甲醇＝10/1)分离，得喜树碱-黄连素偶联药物118.72mg，收率40％。

实施例10：制备喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物

取实施例7中合成的喜树碱-黄连素偶联药物10mg(0.01mmol)以及8mg(0.01mmol)吲哚菁绿溶于0.4ml的二甲基亚砜溶剂中，室温下以300w功率超声20min，溶液逐渐注入到10ml的去离子水中，混合溶液体系搅拌2h。然后在截留分子量为3500da的透析袋中透析12h，得到喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物。

实施例11：制备喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物

取实施例7中合成的喜树碱-黄连素偶联药物10mg(0.01mmol)以及8mg(0.01mmol)吲哚菁绿溶于0.4ml的二甲基亚砜溶剂中，室温下以300w功率超声60min，溶液逐渐注入到10ml的去离子水中，混合溶液体系搅拌2h。然后在截留分子量为3500da的透析袋中透析12h，得到喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物。

实施例12：制备喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物

取实施例7中合成的喜树碱-黄连素偶联药物5mg(0.005mmol)以及8mg(0.01mmol)吲哚菁绿溶于0.4ml的二甲基亚砜溶剂中，室温下以300w功率超声20min，溶液逐渐注入到10ml的去离子水中，混合溶液体系搅拌2h。然后在截留分子量为3500da的透析袋中透析12h，得到喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物。

实施例13：制备喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物

取实施例7中合成的喜树碱-黄连素偶联药物10mg(0.01mmol)以及8mg(0.01mmol)吲哚菁绿溶于0.4ml的甲醇溶剂中，室温下以300w功率超声20min，溶液逐渐注入到10ml的去离子水中，混合溶液体系搅拌2h。然后在截留分子量为3500da的透析袋中透析12h，得到喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物。

实施例14：喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的相关表征

透射电子显微镜(tem)和动态光散射仪(dls)被用来观察和表征喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的形貌和粒径分布。图5的tem图片表明喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物呈现规整的球状，粒径大概为150nm。图6的dls分析发现喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的平均粒径在～165nm，且分布窄(pdi＝0.086)。而且在经过20天之后，喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的粒径依然变化不大(图7)。紫外可见分光光度计被用来检测喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物中的单体相互作用，结果发现喜树碱-黄连素与吲哚菁绿之间存在相互作用，因为两个单体的紫外吸收峰都有明显的红移(图8)。

实施例15：喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物的药物释放实验

通过透析法测量喜树碱从喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物中的累积释放。取实施例10喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物1ml置于截留分子量为3500da的透析袋中，然后将其浸润在30ml的pbs(ph＝7.4或者5.6，有/无20mm的gsh，有/无808nm1w/cm²光照)溶液中，继续在37℃下，以150r/min振荡。在预定的时间取2ml的试样用于紫外检测，并补充2ml的新鲜pbs。

结果发现(如图9所示)，喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物展现明显的gsh响应特性，而且药物释放过程可以被低的ph和光照所加速。值得注意的是，在ph＝5.6，光照，gsh＝20mm条件下，喜树碱的释放量超过80％。

实例16：mtt法癌细胞活力实验

a549人肺癌细胞接种量接种于96孔培养板，5％co2、37℃培养箱中培养24h后，每孔加入不同浓度的实施例10的喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物(有/无808nm1w/cm²光照)、喜树碱、黄连素、吲哚菁绿(有/无808nm1w/cm²光照)、喜树碱-黄连素偶联药物溶液各100μl，使最终的药物浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μm，继续培养72h；分别加入50μl的mtt，继续于5％co2、37℃培养箱中继续培养4h，弃去培养基，加入150μl的dmso，在平板摇床上摇匀，酶标仪495nm读板，根据测得的吸光度值计算细胞抑制率。数据表示为平均数±sd(n＝3)。

结果发现(如图10所示)，在培养24小时后，喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物(808nm1w/cm²光照)(ic50＝0.21μm)对a549的抑制效果要由于喜树碱(ic50＝0.43μm)。

实例17：线粒体共定位实验

激光共聚焦显微镜被用来观察喜树碱-黄连素纳米药物线粒体定位。a549人肺癌细胞接种于玻璃小皿中，5％co2、37℃培养箱中培养12h后，每个皿中分别加入5μm的喜树碱-黄连素纳米药物继续培养45min或90min。然后，含有a549细胞的玻璃小皿用pbs缓冲溶液洗三次，加入线粒体定位试剂mitotrackerred(1μm)再另外培养25min。培养结束后，玻璃小皿用pbs缓冲溶液洗三次，用激光共聚焦显微镜观察细胞。

结果发现(如图11所示)，不管是培养45min还是90min，喜树碱-黄连素/吲哚菁绿纳米药物均具有好的线粒体靶向功能，共定位系数均超过0.9。