本发明涉及疫苗佐剂
技术领域：
：，具体涉及一种含人参皂苷的植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途。
背景技术：
：：畜禽养殖业为人类提供重要的蛋白质来源，是人类不可缺少的重要产业。在规模化养殖场，由于动物高密度饲养，动物与动物之间接触频繁，使疫病在动物中传播变得更加容易。给动物注射疫苗，使动物产生特异性免疫反应，提高动物对疫病的抵抗力，可减少疫病的发生，降低由疫病给养殖户造成的经济损失，是预防动物疫病发生的一项重要措施。为了提高疫苗的免疫效果，需要在疫苗中添加佐剂，以增强疫苗诱导的免疫反应强度和延长免疫反应的持续时间。我国目前采用的动物疫苗佐剂的主要是以矿物油为原料的白油。白油的主要成分是c16～c31的正异构烷烃的混合物，难以被动物吸收和代谢。动物实验证明白油中的杂质多环芳烃类成分对机体有致癌作用。因此，使用以矿物油为主要成分的佐剂可对食品安全构成潜在威胁。此外，用矿物油制备的疫苗乳剂给动物注射后不易吸收，可在注射部位长时间滞留，引起局部组织炎症、化脓、坏死等副作用，影响动物产品的质量。因此，一些发达国家对油佐剂疫苗的使用进行了限制，例如早在20多年以前美国政府就已经严禁动物上市前42天之内注射油佐剂疫苗。现有的矿物油疫苗佐剂主要存在以下不足：1、矿物油佐剂残留的多环芳香烃类成分有致癌作用，该佐剂制成疫苗免疫动物后可对食品安全构成潜在威胁；2、传统矿物油佐剂在动物体内不容易吸收、代谢，影响动物产品的质量；3、传统矿物油佐剂的闪点比较低，容易燃烧，贮存不安全。综上，有必要对现有技术做进一步改进。参考文献：(1)中国饲料行业信息网.2012年全年生猪出栏量预计为7.1亿头；(2)文杰.我国肉鸡产业现状与鸡肉安全.今日畜牧兽医，2013，05，40-42；(3)李建军，熊良铨，王登峰，等.不同白油佐剂制备新城疫、禽流感疫苗免疫效果的比较研究.第三届中国兽药大会论文集.2010：34-39.(4)李立权.白油及白油生产技术.润滑油，2003，18(4)：1-6.(5)何海蓉，姜平，梅忠，宋立芹，岳建新.不同来源白油佐剂质量分析及其制备的禽流感疫苗安全生与免疫效力研究.中国家禽，2009，31：15-18；(6)陈世豪，郝同杨，施祖灏，等.油乳佐剂及其安全性研究进展.中国家禽，2013，35(16)：44-46.(7)曾明.疫苗佐剂的设计和选择：动物模型和人体试验.国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册)，2003，26(2)：67-70.(8)白满英，张金诚.掺伪粮油食品鉴别检验.北京：中国标准出版社，1996.(9)秦玉明,赵耘,李宇,王栋.国外疫苗佐剂的评价.中国兽药杂志，2005,36：34-36(10)河牧牧业.养鸡业走出疫病困扰的重要出路；(11)stonehd.efficacyofexperimentalanimalandvegetableoil-emulsionvaccinesfornewcastlediseaseandavianinfluenza.aviandiseases，1993,37(2)：399-405；201310754903.4的发明《一种含人参皂苷的植物油佐剂及其制备方法和应用》告知了植物油佐剂的制备方法：将人参皂苷加入二甲基亚砜中进行溶解，混匀得到人参皂苷溶液；将所述人参皂苷溶液加入植物油中直接混合均匀；或植物油加热至20～40℃后，在植物油中加入去水山梨醇单油酸酯和所述人参皂苷溶液，混合均匀。201910518452.1的发明《植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途》告知了一种含人参皂苷和维生素e的植物油的制备方法：先在植物油中加入司班-80和吐温-80，再加入维生素e和人参皂苷溶液，得组分a；将甘油和1,2-丙二醇混合，得组分b；将组分a和组分b混合，获得植物油疫苗佐剂。上述两个专利获得的植物油佐剂制备疫苗，为一种水包油型(o/w)乳剂，佐剂作用较弱。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提出一种含人参皂苷的复合植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种复合植物油疫苗佐剂，按照以下方法制备而得：1)、复合植物油佐剂由以下体积含量的成分组成：1.50％～3.5％油酸、9.5％～12.5％司班-85、2.50％～3.50％聚甘油蓖麻醇酸酯(pgpr)，余量为植物油；2)、按照2～8mg人参皂苷/100ml复合植物油佐剂的用量比，在复合植物油佐剂中加入人参皂苷溶液，得复合植物油疫苗佐剂。作为本发明的复合植物油疫苗佐剂的改进：所述植物油为山茶油、花生油、亚麻籽油、葵花籽油、稻米油、玉米油、大豆油、调和油、葡萄籽油或菜籽油；步骤1)的复合植物油佐剂的制备方法为：于35℃～50℃，将油酸、司班-85和聚甘油蓖麻醇酸酯(pgpr)加入到植物油中，混合均匀，得复合植物油佐剂；步骤2)中人参皂苷溶液的制备方法为：在1毫升二甲基亚砜中加入5～15mg人参皂苷，均匀混合，得人参皂苷溶液。本发明还同时提供了上述复合植物油疫苗佐剂的用途：以复合植物油疫苗佐剂(含人参皂苷的复合植物油佐剂)为油相，以含抗原的水溶液为水相；将油相、水相先分别升温至35℃～40℃，然后按照2:1的体积比混合乳化，得油包水型(w/o)疫苗乳剂。本发明制备所得的疫苗，可按照常规用法使用。和现有技术比较，本发明具有如下技术优势：(1)本发明由于采用了可食用的植物油为原料制备疫苗佐剂，使疫苗的安全性大幅度提高，克服了传统矿物油佐剂对食品卫生的潜在危害。(2)本发明的复合植物油佐剂在促进抗体产生和延长抗体有效期方面优于传统佐剂。(3)本发明的油佐剂制备的疫苗为油包水型(w/o)型，且由于采用了天然植物油，比常规的矿物油和动物组织有更好的相容性，更加容易吸收、代谢，在注射部位容易吸收，克服了传统矿物油佐剂疫苗不容易的缺点，提高了动物产品的质量。(4)本发明佐剂中的多环芳香烃成分大幅度降低，具有良好的食品安全性；闪点小，不易燃烧，在运输、贮藏、加工过程中安全性好；综上所述，用本发明佐剂制备的疫苗注射动物后容易被机体吸收，不易在注射部位形成疫苗残留，并可延长抗体持续时间，能更好地保护免疫动物。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1复合植物油佐剂(实施例1、5、9、13方法制备)(组2～5)和10号白油(组1)对模式抗原(bsa)诱导抗体igg水平的比较。图2复合植物油佐剂(实施例2、6、10、14方法制备)(组2～5)和10号白油(组1)对模式抗原(bsa)诱导抗体igg水平的比较。图3复合植物油佐剂(实施例3、7、11、15方法制备)(组2～5)和10号白油(组1)对模式抗原(bsa)诱导抗体igg水平的比较。图4复合植物油佐剂(实施例4、8、12、16方法制备)(组2～5)和10号白油(组1)对模式抗原(bsa)诱导抗体igg水平的比较。图5复合植物油佐剂(实施例1、5、9、13方法制备)(组2～5)和10号白油(组1)对口蹄疫疫苗诱导抗体igg水平的比较。图6山茶油、亚麻籽油、花生油、玉米油、葡萄籽油、葵花籽油、调和油、菜籽油、大豆油、棉籽油、稻米油型复合植物油佐剂(组3～13)和mc52(组2)对ndv疫苗诱导hi效价的比较。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。在本发明的复合植物油疫苗佐剂的制备过程中用到的各种原料，均能通过常规市购的方式获得。例如：油酸(阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国)，司班-85(阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国)，聚甘油蓖麻醇酸酯(卡迈舒生物科技有限公司，上海，中国)，山茶油(益海嘉里食品工业有限公司，上海，中国)，二甲基亚砜(阿拉丁生化科技有限公司，上海，中国)，人参皂苷(宏久集团，吉林，中国)。实施例1、一种复合植物油(山茶油)疫苗佐剂的制备方法，依次进行以下步骤：1)、配制复合植物油佐剂：按照体积比，将1.5％油酸、12.5％司班-85、2.5％聚甘油蓖麻醇酸酯以及作为余量的山茶油在35℃混合均匀，得复合植物油佐剂。2)、配制含人参皂苷的复合植物油佐剂：首先在每ml二甲基亚砜中加入10mg人参皂苷，均匀混合，得人参皂苷溶液。然后按照2mg人参皂苷/100ml复合植物油佐剂的用量比，在复合植物油佐剂中加入人参皂苷溶液，得复合植物油(山茶油)疫苗佐剂。实施例2、复合植物油(山茶油)疫苗佐剂复合植物油佐剂由以下体积含量的成分组成：3.5％油酸、9.5％司班-85、3.5％聚甘油蓖麻醇酸酯；余量为山茶油。其余等同于实施例1。实施例3、复合植物油(山茶油)疫苗佐剂复合植物油佐剂改成由以下体积含量的成分组成：2.5％油酸、11.5％司班-85、2.5％聚甘油蓖麻醇酸酯；余量为山茶油。其余等同于实施例1。实施例4、复合植物油(山茶油)疫苗佐剂步骤2)中，改成按照8mg人参皂苷/100ml复合植物油佐剂的用量比；其余等同于实施例1。实施例5～实施例8、复合植物油(花生油)疫苗佐剂：将实施例1～实施例4中的山茶油改成花生油；其余等同；从而对应获得实施例5～实施例8所述的复合植物油(花生油)疫苗佐剂。实施例9～实施例12、复合植物油(玉米油)疫苗佐剂：将实施例1～实施例4中的山茶油改成玉米油；其余等同；从而对应获得实施例9～实施例12所述的复合植物油(玉米油)疫苗佐剂。实施例13～实施例16、复合植物油(大豆油)疫苗佐剂：将实施例1～实施例4中的山茶油改成大豆油；其余等同；从而对应获得实施例13～实施例16所述的复合植物油(大豆油)疫苗佐剂。以下实验1、2、6、8采用的是实施例1、5、9、13方法制备的含人参皂苷复合植物油佐剂。实验1：含人参皂苷复合植物油佐剂中的多环芳香烃含量低于常规矿物油佐剂1.材料和方法1.1.疫苗佐剂：本试验采用以下佐剂，(1)mc52：esso埃索石油公司产品，法国；(2)10号白油：中国石化集团杭州炼油厂产品，杭州，中国；(2)山茶油型复合植物油佐剂：按照实施例1方法制备；(3)花生油型复合植物油佐剂：按照实施例5方法制备；(4)玉米油型复合植物油佐剂：按照实施例9方法制备；(5)大豆油型复合植物油佐剂：按照实施例13方法制备；1.2.六种佐剂送上海专业公司检测多环芳香烃含量。2.结果和分析如下表1表1、各种油佐剂中的多环芳香烃含量(μg/kg)佐剂稠环芳香烃含量mc522019.1110号白油219.24山茶油型复合植物油佐剂(实施例1)30.05玉米油型复合植物油佐剂(实施例9)29.98实验2：含人参皂苷复合植物油佐剂对模式抗原牛血清白蛋白bsa的佐剂作用1.材料和方法1.1.实验动物：雌性icr小鼠(18～22g)购自上海斯莱克实验动物有限公司。饲养于ivc独立送风饲养笼具。饲喂无菌饲料和水，室内温度为25±1℃，湿度为50％±10％。动物适应饲养1周后，开始试验。1.2.抗原溶液：将模式抗原牛血清白蛋白(bsa)(sigma公司产品)加入到生理盐水中，bsa的终浓度为100μg/ml，即得。1.3.疫苗佐剂：除mc52外，其它同实验1。1.4.实验疫苗制备方法：将步骤1.3中的佐剂与抗原bsa溶液分别升温至35℃～40℃，按体积比2:1混合，用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：ff-esb-300)乳化2分钟(16000转/分)，制成相应的乳白色疫苗乳剂。将生理盐水与抗原bsa溶液按体积比2:1混合均匀，对照用。1.5.动物分组和处理：将36只小白鼠随机分成6组。每组动物按表2肌肉注射(0.2ml/次)实验疫苗二次，间隔二周。表2、动物分组和处理1.6.采血二免后1、2周采血，制备血清，供抗体igg检测。1.7.抗体检测方法：用elisa方法检测抗bsa的血清特异性igg水平，方法如下：(1)抗原包被：取96孔酶标板，按100μl/孔加入bsa溶液(5μg/ml，溶于碳酸盐缓冲液，ph＝9.6)，振荡混匀，封板，于4℃过夜。(2)洗涤：弃去酶标板内液体，按300μl/孔加入pbst洗涤液洗涤3次。拍干。(3)封闭：按300μl/孔加入5％以pbs稀释的胎牛血清，置于37℃环境下孵育2h。(4)洗涤同上，按100μl/孔加入胎牛血清稀释液稀释的待检血清，于37℃环境下孵育2h。(5)洗涤同上，按100μl/孔加入hrp标记的羊抗鼠抗体，于37℃孵育2h。(6)洗涤同上，按100μl/孔加入现配的tmb底物工作液(避光)，于室温孵育10min。(7)按50μl/孔加入2mh2so4终止液，轻轻振荡混匀，在15min内用酶标板测得其在450nm波长下的od值。2.结果和分析结果如图1所示，10号白油(组1)和4个含人参皂苷的复合植物油(组2～5)均有佐剂作用，10号白油是我国生产的质量较好的疫苗佐剂。本发明佐剂组的igg水平高于10号白油组，说明本发明佐剂效果优于10号白油。实验3：含人参皂苷复合植物油佐剂对模式抗原牛血清白蛋白bsa的佐剂作用1.材料和方法复合植物油佐剂分别选用按照实施例2、实施例6、实施例10和实施例14方法制备，其余同实验2。2.结果和分析结果如图2所示，10号白油(组1)和4个含人参皂苷的复合植物油(组2～5)均有佐剂作用，本发明佐剂组的igg水平高于10号白油组，说明本发明佐剂效果优于10号白油。实验4：含人参皂苷复合植物油佐剂对模式抗原牛血清白蛋白bsa的佐剂作用1.材料和方法复合植物油佐剂分别选用按照实施例3、实施例7、实施例11和实施例15方法制备，其余同实验2。2.结果和分析结果如图3所示，10号白油(组1)和4个含人参皂苷的复合植物油(组2～5)均有佐剂作用，本发明佐剂组的igg水平高于10号白油组。实验5：含人参皂苷复合植物油佐剂对模式抗原牛血清白蛋白bsa的佐剂作用(4)1.材料和方法复合植物油佐剂分别选用按照实施例4、实施例8、实施例12和实施例16方法制备，其余同实验2。2.结果和分析结果如图4所示，10号白油(组1)和4个含人参皂苷的复合植物油(组2～5)均有佐剂作用，本发明佐剂组的igg水平高于10号白油组。从图1～4可见，以山茶油、花生、玉米油和大豆油为主要原料制备的含人参皂苷的复合植物油对模式抗原bsa具有疫苗佐剂作用，其佐剂效果高于10号白油佐剂。通过后续实验7，进一步观察以11种植物油为主要原料制备的含人参皂苷的复合植物油对灭活病原鸡新城疫病毒抗原的佐剂作用，并比较它们的佐剂效果。实验6：含人参皂苷复合植物油佐剂对口蹄疫疫苗的免疫增强作用1、材料和方法1.1.将实验2中的抗原由“bsa”更改为“fmdv”，即，将猪o型口蹄疫病毒(fmdv)灭活抗原加入到生理盐水中，146s抗原(沉降系数为146的口蹄疫病毒颗粒)终浓度为9μg/ml，即得含抗原的水相，其余同实验2。动物分组和处理按表3肉注射疫苗二次(0.2ml/次)，间隔二周。表3、动物分组和处理组别小鼠佐剂146s(μg)/一次注射1610号白油0.626山茶油型复合植物油佐剂(实施例1)0.636花生油型复合植物油佐剂(实施例5)0.646玉米油型复合植物油佐剂(实施例9)0.656大豆油型复合植物油佐剂(实施例13)0.666生理盐水0.61.2.采血：同实验2。1.3.抗体检测方法：检测血清中抗fmdv特异性抗体，步骤如下：(1)包被：将兔抗o型fmdv血清按1:8加入碳酸盐缓冲液(ph9.6)，混匀后在96孔酶标板中每孔加入50μl包被，放置于4℃孵育过夜；(2)洗板：用pbst(含0.05％tween-20的pbs)清洗96孔板3～5次，每孔300μl，每次2分钟(以下同)；(3)封闭：每孔加入300μl含5％(w/v)脱脂乳的pbs封闭液，37℃孵育2h；(4)洗板，每孔加入50μl1:8稀释的o型fmdv抗原，4℃孵育2h；(5)洗板，每孔加入50μl经1:200稀释待检血清和阴性血清，37℃孵育1h；(6)洗板，加入1:1000稀释的hrp标记山羊抗小鼠igg抗体，50μl/孔，37℃孵育1h；(7)洗板，加入tmb底物溶液显色，50μl/孔，37℃孵育10min；(8)洗板，加入50μl/孔2mh2so4终止反应；(9)酶标仪测定od450nm值。2.结果和分析结果如图5所示，10号白油(组1)和4个含人参皂苷的复合植物油(组2～5)对fmdv疫苗均有佐剂作用，本发明佐剂效果优于10号白油。实验7：含人参皂苷复合植物油佐剂可延长动物产生抗体的时间1.材料和方法1.1.试验动物：1日龄三黄肉鸡(振宁禽业有限公司，宁波，中国)。1.2.疫苗佐剂：本试验采用以下佐剂：(1)mc52：esso埃索石油公司产品，法国；(2)含人参皂苷的复合植物油佐剂：参照实施例2，以山茶油、亚麻籽油、花生油、玉米油、葡萄籽油、葵花籽油、调和油、菜籽油、大豆油、棉籽油、稻米油(益海嘉里食品工业有限公司，上海，中国)为原料，分别制成11种含人参皂苷的复合植物油佐剂；1.3.实验疫苗制备方法：将步骤1.2中的佐剂与灭活鸡新城疫病毒抗原(ndv)溶液按体积比2:1混合，用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：ff-esb-300)乳化2分钟(16000转/分)，制成相应的乳白色疫苗乳剂。将生理盐水与抗原ndv溶液按体积比2:1混合均匀，对照用。1.4.动物分组和处理：将130只肉鸡随机分成13组，饲养至21日龄后每只鸡按照表4肌肉注射ndv疫苗。表4、动物分组和处理1.5.采血：免疫后1、2、3、4、5、6周采血。1.6.抗体检测方法：用血凝抑制(hi)试验检测血清中hi效价，步骤如下：1)用微量移液器在96孔板的每排第1～10孔中各加25μl生理盐水，第11孔和12孔分别为4单位抗原对照和阳性血清对照。2)用微量移液器吸取待检血清25μl置于第1孔中，然后倍比稀释至第10孔，弃去25μl。3)用微量移液器吸取配制好的4单位抗原，每孔25μl。4)置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀。5)室温静置20min。6)用微量移液器吸取1％红细胞悬液于每孔，各加25μl。7)置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀。8)室温静置40min后观察结果。9)判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的hi滴度，以2的对数表示。2.结果和分析当禽血清hi效价大于4log2时，被认为该动物具有抗ndv感染作用。mc52是一种常见的禽用疫苗佐剂。实验结果如图6所示，mc52和含人参皂苷复合植物油佐剂均能促进特异性抗体的产生。但mc52组的hi效价下降较快，在免疫后6周时，hi效价低于4，小于保护性抗体水平，而本发明佐剂组的hi效价仍大于4，对动物具有保护作用，说明可延长抗体的持续时间。一个好的疫苗应该可使动物在免疫后的较长时间内仍然能使抗体维持在较高的水平，使动物具有抗感染能力。选择合适的佐剂，可使疫苗获得这种功能。从图6可见，不同植物油制备的佐剂有不同的佐剂作用。根据抗体效价从高到低，在免疫后6周仍能使抗体维持在较高水平的佐剂依次是：玉米油>亚麻籽油>花生油、调和油>葡萄籽油>菜籽油>山茶油>大豆油>稻米油>葵花籽油>mc52>棉籽油。实验8：含人参皂苷复合植物油佐剂比常规矿物佐剂更加容易在注射部位吸收1.材料和方法1.1.实验动物：1日龄三黄肉鸡(振宁禽业有限公司，宁波，中国)。1.2.疫苗佐剂：本试验所用佐剂同实验2；1.3.疫苗制备方法：将佐剂与抗原ndv溶液按体积比2:1混合，用乳化机(北京卓川电子科技有限公司，型号：ff-esb-300)乳化2分钟(16000转/分)，制成相应的乳白色疫苗乳剂。1.4.动物分组和处理：将72只鸡饲养至两周(14日龄)分成6组，每组12只。然后按表5胸部肌肉注射ndv疫苗0.3ml。免疫后每周每组取2只鸡剖解注射部位，观察注射部位疫苗乳剂残留情况。2.结果与分析观察结果见表5。10白油和mc52佐剂疫苗注射后在第5周，即49日龄仍见疫苗残留。这对快速生长，50日龄左右上市的肉鸡是不适合的。而4个复合植物油佐剂的疫苗注射后第5周起，未见疫苗残留，适合肉鸡疫苗使用。表5、免疫后在注射部位检测到残留疫苗的时间-：2只鸡均未见疫苗残留；+：只观察到1只鸡有疫苗残留；++：2只鸡均有疫苗残留。实验9：含人参皂苷复合植物油佐剂的闪点低于常规矿物佐剂1.材料和方法1.1.含人参皂苷复合植物油佐剂：参照实施例1、5、9和13，分别制备山茶油型、花生油型、玉米油型和大豆油型复合植物油佐剂。1.2.闪点测定：使用闪点测定仪(型号：syd-261-i，上海精析仪器制造有限公司，上海，中国)测定。按照说明书，将佐剂油样品样品倒入检测杯中，使油表面与杯内刻度线保持一致。打开搅拌器，接通气源并点火；当温度计读数升至90℃时，调整升温速度至每分钟升高2～3℃，且每分钟点火两次，点火时关闭搅拌器，当出现闪火时纪录温度计读数即为检测样品的闪点。2.结果与分析闪点是火焰引起试样蒸汽着火，并使火焰蔓延至液体表面的最低温度。闪点值用于表示可燃性物质中是否存在可燃性物质，是石油产品运输、贮存、操作、安全管理的重要参数之一。表6可知，本发明佐剂的闪点大大mc52和10号白油的闪点。说明在运输、贮存、操作中，本发明产品比传统佐剂更为安全。表6、几种佐剂的闪点测定结果佐剂闪点(℃)mc52158白油10#155山茶油型复合植物油佐剂228花生油型复合植物油佐剂225玉米油型复合植物油佐剂230大豆油型复合植物油佐剂227实验10：采用含人参皂苷复合植物油佐剂制备的疫苗乳剂是油包水型乳剂(w/o)1.材料和方法1.1.含人参皂苷复合植物油佐剂：参照实施例1、5、9和13，分别制备山茶油型、花生油型、玉米油型和大豆油型复合植物油佐剂。1.2.疫苗制备：参照实验7，分别制备山茶油型、花生油型、玉米油型和大豆油型复合植物油佐剂的ndv疫苗。1.3.疫苗乳剂类型鉴别：(1)稀释法取2～3滴乳剂分别滴入清水中和植物油中，观察植物油乳滴在水和油中的分散情况。结果，乳剂不能在水中散，而在油中分散良好的为油包水型乳剂(w/o)；乳剂在水中散良好，而不能在油中分散的为水包油型乳剂(o/w)。(2)染色法分别将水溶性曙红y染液和油溶性苏丹ⅲ染液滴入疫苗乳剂中。结果，滴入曙红y染色液时，疫苗不染色，而滴入苏丹iii染色液时，疫苗染色者为水包油型乳剂(o/w)；滴入曙红y染色液时，疫苗染色，而滴入苏丹iii染色液时，疫苗不染色者为油包水型乳剂(w/o)。2.结果和分析鉴别结果如表7。用本发明的佐剂制备的ndv疫苗乳剂能在油中分散而不能在水中分散，能被苏丹iii染色而不能被曙红y染色，是一种油包水型乳剂(w/o).表7、含人参皂苷复合植物油佐剂:ndv疫苗乳剂类型鉴别结果对比例1、取消“油酸”的使用，将山茶油改为玉米油，且相应增加了玉米油的用量，其余等同于实施例2。此案例造成油水分离，不能形成稳定的乳剂。对比例2、取消“聚甘油蓖麻醇酸酯”的使用，将山茶油改为玉米油，且相应增加了玉米油的用量，其余等同于实施例2。此案例造成油水分离，不能形成稳定的乳剂。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12