一种用于治疗仔猪腹泻的组合型噬菌体制剂的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及三株能够特异性裂解仔猪产肠毒素大肠杆菌、多重耐药大肠杆菌及痢疾志贺菌菌株的噬菌体分离物及其在治疗仔猪腹泻中的应用。
背景技术：
：初生仔猪因肠道未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感，易受病原微生物的侵染和各种应激因素的影响。引起仔猪腹泻的传染性因素有病毒性和细菌性两大类，其中细菌性腹泻主要由大肠杆菌和志贺菌引起。仔猪大肠杆菌感染具有流行面广、发病率和死亡率高等特点，往往导致仔猪成活率下降、生长受阻甚至死亡。在临床上，治疗大肠杆菌和志贺菌感染的基本方法是采用抗菌药物。近些年，随着抗菌药物的大量使用，尤其是作为饲料添加剂长期添加于饲料中，使得大肠杆菌产生耐药性，耐药谱不断扩大，传播速度越来越快，多重耐药大肠杆菌的数量也在不断增加，严重威胁着人们的健康和公共卫生安全。当前，全球养殖业已经全面掀起“禁抗”的热潮，2019年7月10日，农业农村部发布194号公告，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，加快了我国进入“无抗时代”的脚步。噬菌体是一类可感染细菌、真菌和放线菌的病毒总称，结构简单、分布广泛，被誉为生物圈中最为丰富的生物实体。噬菌体疗法与传统抗生素相比，具有自我复制能力强、宿主专一性高、安全、研发成本低等优势，是理想的抗生素替代品。但是噬菌体疗法也存在裂解谱过于狭窄、作用效果不稳定、裂解活性不强等问题。本发明选用的噬菌体专门针对引起仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌、多重耐药大肠杆菌和痢疾志贺菌，具有效价高、稳定性好和较强的裂解活性，这三种噬菌体的混合制剂克服了以往噬菌体产品裂解谱窄的缺点，能够有效防治仔猪腹泻细菌性疾病。技术实现要素：为了防治由大肠杆菌、志贺菌等引起的仔猪腹泻，本发明提供了一种产肠毒素大肠杆菌、多重耐药大肠杆菌和痢疾志贺菌组合型噬菌体制剂，同时提供了该噬菌体制剂在防治仔猪腹泻的应用。为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种组合型噬菌体制剂，包括三种噬菌体，大肠杆菌噬菌体vb_ecop_e21、大肠杆菌噬菌体vb_ecom_f2和志贺氏菌噬菌体vb_ssom_z31，大肠杆菌噬菌体vb_ecop_e21于2019年11月06日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.18869，分类命名为大肠杆菌噬菌体；大肠杆菌噬菌体vb_ecom_f2于2019年11月06日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.18871，分类命名为大肠杆菌噬菌体；志贺氏菌噬菌体vb_ssom_z31于2019年11月06日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.18870，分类命名为志贺氏菌噬菌体。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：10010。本发明大肠杆菌噬菌体vb_ecop_e21透射电镜观察表明，该噬菌体属于有尾噬菌体目，短尾噬菌体科，头部衣壳直径52.1±1.2nm，尾部长10.4±1.1nm，一步生长曲线表明该噬菌体裂解细菌的潜伏期为20min，裂解量为370pfu/ml；大肠杆菌噬菌体vb_ecom_f2透射电镜观察表明，该噬菌体属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，头部衣壳直径160±1.1nm，尾部长19±1.4nm，一步生长曲线表明该噬菌体潜伏期为30min，裂解量为110pfu/ml；志贺氏菌噬菌体vb_ssom_z31透射电镜观察表明，该噬菌体属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，头部直径63.8±1.3nm，尾部长102±2.3nm，一步生长曲线表明该噬菌体潜伏期为10min，裂解量为115pfu/ml。上述技术方案中，进一步地，所述大肠杆菌噬菌体vb_ecop_e21、大肠杆菌噬菌体vb_ecom_f2和志贺氏菌噬菌体vb_ssom_z31的体积比为1:1:1。本发明另一方面还提供了一种组合型噬菌体制剂在防治仔猪腹泻的细菌性疾病中的初步应用，使用本发明噬菌体液对发病期的仔猪进行灌服，组合型噬菌体效价≥1010pfu/ml，每天灌服1次，连续进行3-7天，可以有效治疗或预防仔猪腹泻。进一步地，灌服时，先灌服100ml浓度为1.2-1.4％的小苏打溶液，10-15min后，再灌服100ml组合型噬菌体制剂裂解液。本发明的有益效果：本发明的组合型噬菌体制剂，以直接灌服的方式施用，可降低大肠杆菌和志贺菌丰度，有效防治养殖过程中仔猪腹泻疾病的发生，提高仔猪成活率，减少经济损失。使用本发明组合型噬菌体制剂控制仔猪腹泻，能够减少抗生素在仔猪养殖过程中的使用量，降低耐药菌株的出现几率，从源头上维护养殖业生产安全、动物源性食品安全、公共卫生安全和生态环境安全，本发明提供的组合型噬菌体制剂可代替传统饲用抗生素的使用，具有安全、高效、无残留等特点，是一种理想的抗生素替代品。附图说明图1投射电镜观察噬菌体形态，a.噬菌体vb_ecop_e21，b.vb_ecom_f2，c.vb_ssom_z31；图2噬菌体温度稳定性，a.噬菌体vb_ecop_e21，b.vb_ecom_f2，c.vb_ssom_z31；图3噬菌体ph值稳定性，a.噬菌体vb_ecop_e21，b.vb_ecom_f2，c.vb_ssom_z31；图4噬菌体一步生长曲线，a.噬菌体vb_ecop_e21，b.vb_ecom_f2，c.vb_ssom_z31；图5实施例6试验猪直肠温度图；图6实施例6试验猪粪便评分图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1噬菌体的分离与筛选(一)宿主菌的准备本发明涉及三种宿主菌，其中产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacolik88,cvcc83902)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(chinaveterinaryculturecollectioncenter,cvcc)，志贺菌(shigelladysenteriae,cgmcc21535)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)；多重耐药大肠杆菌f2(jisnky-e.colif2)分离自吉林省农业科学院(jilinacademyofagriculturalsciences,jaas)养猪场的仔猪腹泻粪便，由吉林省农业科学院畜牧分院抗生素替代品实验室自主保藏，经药敏试验鉴定其对氨苄西林、舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢替坦、亚胺培南、复方新诺明等9种抗生素具有耐药性。多重耐药大肠杆菌f2具体分离过程如下：采集仔猪腹泻粪便样品，放入有冰袋的泡沫箱中，运回实验室进行菌种分离鉴定。用棉签挑取少许粪便样品划线于麦康凯平板上，置于37℃恒温培养12-16h，用接种环挑取圆形、光滑、边界整齐、清晰、大小一致的红色菌落继续划线于麦康凯平板中，进行纯化培养；纯化2-3次后，用接种环挑取圆形、光滑的红色菌落划线于伊红美蓝培养基，37℃恒温培养12-16h后进一步纯化。用接种环挑取伊红美蓝培养基上可见黑色金属光泽的单菌落，在载玻片涂匀，室温内干燥。滴加草酸铵结晶紫溶液，作用90s，用纯水清洗，并吸取玻片上残留的水滴；再加革兰氏碘溶液，充分作用90s，用纯水清洗，并吸取玻片上残留的水滴；将玻片稍倾斜一定角度，用滴管滴加95％的乙醇脱色30s，用纯水清洗；用番红液复染30s，纯水清洗干燥后，用油镜镜检，可见革兰氏染色呈阴性、无芽孢短杆状细菌形态。经生化反应试验和16srdna序列比对结果，综合评定该菌株为大肠杆菌。随后利用药敏纸片法监测e.colif2对于临床上常用抗生素的耐药以及敏感情况，具体操作根据美国临床实验室标准化委员会(nccls)2010年制定的标准操作执行，e.colif2对氨苄西林、舒巴坦、哌拉西林等9种抗生素具有耐药性(9/20)。将这三种宿主菌分别划线接种于lb固体培养基上，经37℃过夜培养后，挑取平板上的单个菌落，接种于新鲜的lb液体培养基中，37℃振荡培养5-8h后，选取对数期菌液用于噬菌体的分离、扩增与纯化。(二)污水样的处理取来自于吉林某养猪场及大连市某医院排污口废水样品各500ml，混合后将水样做预处理：加入cacl2和mgcl2，使其终浓度为1mmol/l。(三)污水样噬菌体扩增取污水样50ml，12000rpm离心6min，用0.22μm滤膜过滤得上清液；取上清液30ml加入等体积lb液体培养基和1-2ml处于对数期宿主菌液，混匀后于37℃，160r/min恒温摇床培养过夜；取50ml培养液，12000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤得上清液，保存于4℃，即为增殖后的待测噬菌体扩增液。(四)鉴定是否含有噬菌体采用单层平板点滴法鉴定污水扩增液中是否含有噬菌体。在单层lb固体培养基上均匀涂布200ml对数期菌液，彻底晾干后在平板上两滴10μl待测噬菌体扩增液，平板正置放入37℃培养箱中过夜培养。第二日取出观察是点滴处是否出现明显空斑，若有，即为污水扩增液中含有待测噬菌体。(五)噬菌体的初次分离采用双层平板法进行噬菌体的分离，准备两种lb固体培养基：含2％琼脂的下层lb固体培养基；含1％琼脂的上层lb半固体培养基。将上层培养基加热溶解，放置于60℃的烘箱中待用，取8支10ml离心管，分别加200μl宿主菌液，吸取噬菌体悬液进行梯度稀释至10-7，将8种不同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出200μl，加到10ml离心管中作用3-5min，加入8ml含1％琼脂的lb半固体培养基充分混匀后，立刻倒在凝固的2％琼脂lb固体培养基平板上，待凝固后，倒置培养于37℃培养箱中，8-12h后观察有无透明噬菌斑形成。如果在平板上形成可计数的单个空斑则说明在此稀释梯度下可用于噬菌体的分离及效价计算。(六)噬菌体的纯化初次分离的噬菌斑的大小、形状不一致，需要对噬菌体进一步纯化，使噬菌体在平板上形成大小及形态一致的噬菌斑。用无菌200μl枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑，将其分别加入到1ml无菌smbuffer缓冲液的离心管中，于4℃静置4h，使噬菌体充分释放到smbuffer中，12000r/min离心5min，收集上清，用0.22μm滤膜过滤后将噬菌体滤液进行梯度稀释，采用双层平板法分离纯化。重复5-6次上述操作，直至出现噬菌斑形态、大小完全一致为止，即得到纯化的噬菌体。纯化后的三株噬菌体于2019年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠杆菌噬菌体和志贺氏菌噬菌体，大肠杆菌噬菌体vb_ecop_e21保藏编号为：cgmcc18869，大肠杆菌噬菌体vb_ecom_f2保藏编号为：cgmcc18871，志贺氏菌噬菌体vb_ssom_z31保藏编号为：cgmcc18870。纯化后的三株噬菌体全基因组序列已提交至ncbi网站的genbank库中，噬菌体基因组命名及序列登录号分别为vb_ecop_e21(mn604053)、vb_ecom_f2(mn864145)和vb_ssom_z31(mn655999)。(七)噬菌体的富集与扩增采用液体增殖法进行增殖。具体的方法如下：将每种噬菌体纯化液按1:10比例加入到培养至对数期的宿主菌液中，再于37℃摇床中培养8-10h，将噬菌体裂解液于12000r/min离心6min，去处细菌碎片，上清液用0.22μm的滤膜过滤，即获得高效价的噬菌体富集液。最后将三种噬菌体富集液等比例混合，即为组合型噬菌体制剂。实施例2噬菌体温度、ph稳定性及裂解谱测定。分别取1ml噬菌体裂解液加入1.5ml无菌离心管当中，然后将离心管分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴锅中，选取20、40、60、80、100和120min的不同时间点，从离心管中取出100μl噬菌体裂解液，先冷却至室温，然后利用双层平板法测出其效价，每组做三个重复。结果显示，噬菌体vb_ecop_e21、vb_ecom_f2和vb_ssom_z31对温度有较强的耐受性，在40℃、50℃、和60℃作用120min效价基本保持稳定，除噬菌体vb_ecom_f2在70℃作用40min后，效价开始急剧下降，作用80min后效价降至0外，噬菌体vb_ecop_e21和vb_ssom_z31在80℃环境中仍能维持一定的活性。结果见附图2。利用1mhcl和1mnaoh溶液将lb培养基的ph值分别调至2-12，分别取900μl不同ph培养基加入1.5ml离心管里，然后加入100μl新鲜噬菌体裂解液，于37℃恒温培养1h，利用双层平板法测噬菌体效价，每组做三个平行。结果显示，噬菌体vb_ecop_e21、vb_ecom_f2和vb_ssom_z31对ph有一定的耐受性，当ph值为2.0或12.0时噬菌体失活，效价为0，当ph值为4、6、8和10时，噬菌体活性基本保持稳定，说明这三种噬菌体对ph值有较强的耐受性。结果见附图3。裂解谱的测定：将不同的对数期待测菌液分别涂布于lb固体培养基上，待其晾干后，吸取5μl噬菌体裂解液滴于培养基上，37℃倒置培养10-12h，观察是否出现噬菌斑，若有噬菌斑出现则说明噬菌体对该菌株有裂解作用，噬菌体裂解谱结果见表1。从表1-1和1-2中可以看出，噬菌体vb_ecop_e21、vb_ecom_f2和vb_ssom_z31在裂解谱上有较强的互补性，这三种噬菌体的组合能够互相弥补裂解谱狭窄的缺陷。表1-1大肠杆菌噬菌体vb_ecop_e21和vb_ecom_f2裂解谱宿主菌vb_ecop_e21vb_ecom_f2escherichiacoli6—+escherichiacoli8++escherichiacoli11—+escherichiacolif1—+escherichiacolif2—+escherichiacolie13++escherichiacolio157+—enterotoxigenicescherichiacolik88+—escherichiacoli12588+—escherichiacoli236++escherichiacoli233++escherichiacoli238——escherichiacolif18+—表1-2志贺氏菌噬菌体vb_ssom_z31裂解谱宿主菌vb_ssom_z31shigatoxin-producingescherichiacoli10668+shigellafirigella+shigellafirigella10865+shigellasonnei21535+shigelladysentery10983+实施例3噬菌体最佳感染复数的测定。噬菌体感染复数(moi)是指，感染时噬菌体与宿主菌的数量比值，即每个细菌感染噬菌体的数目。测定方法：(1)用接种环挑取宿主菌单菌落接种于lb液体培养基，37℃、160r/min振荡培养至宿主菌的对数生长期；(2)将已知效价的噬菌体按照0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10六种不同的比例与上述菌液进行混合；(3)37℃，160r/min震荡培养5h，12000r/min，离心2min，收集上清用0.22μm的滤膜过滤除菌；(4)取三组平行的过滤液梯度稀释，利用双层平板法测噬菌体效价，所测得的噬菌体效价最高的感染复数组即为最佳感染复数。噬菌体的感染复数见表2。从表2可以看出，这三种噬菌体的最佳感染复数分别为0.1、1和0.01。表2噬菌体最佳感染复数(moi)噬菌体最佳感染复数(moi)vb_ecop_e210.1vb_ecom_f21vb_ssom_z310.01实施例4噬菌体一步生长曲线的测定噬菌体一步生长曲线能够描绘噬菌体生长规律，了解噬菌体潜伏期和裂解量。步骤如下：(1)按照最佳moi结果，将1ml培养至对数期的宿主菌与噬菌体混合，37℃孵育15min，12000r/min离心10min，弃上清；(2)用2ml37℃预热lb液体培养基洗涤两次，以保证未吸附上细菌的游离噬菌体完全去除；(3)用2ml37℃预热lb液体培养基重悬，加入到10ml37℃预热lb液体培养，充分混匀，迅速置于37℃振荡培养，同时开始计时t0＝0，每隔10min连续采样120min，用0.22μm滤膜去除细菌后，采用双层平板法测定效价，以时间为横坐标，效价为纵坐标，绘制噬菌体一步生长曲线。噬菌体一步生长曲线见附图4。结果显示，噬菌体vb_ecop_e21的潜伏期为20min，裂解量为370pfu/ml；噬菌体vb_ecom_f2潜伏期为30min，裂解量为110pfu/ml；噬菌体vb_ssom_z31潜伏期为10min，裂解量为115pfu/ml。实施例5安全性试验选取30只8周龄雄性昆明小鼠(体重35g±2g)，随机分为两组，每组各15只，其中实验组灌服本发明组合型噬菌体制剂，每天每只灌服10ml效价为1010pfu/ml的噬菌体制剂，对照组灌服等量生理盐水，连续实验7天后，将小鼠脱颈处死，尸检，观察其肺部、肝脏、肾脏、腹腔是否出现病变症状，初步验证此计量噬菌体液对小鼠生理状况没有影响，证明组合型噬菌体制剂具有饲喂安全性。实施例6防控仔猪大肠杆菌和志贺菌腹泻效果1、试验动物及管理试验选择24头断奶仔猪(28日龄断奶)，随机分为对照组、攻毒组和噬菌体治疗组三个组，每组8头猪，各组均自由采食不含抗生素的基础日粮。实验开始前，各组均灌服100ml浓度为1.2-1.4％的小苏打溶液，10min后，攻毒组和噬菌体组灌服5ml用生理盐水重悬的大肠杆菌和志贺氏菌复合菌液(按体积比1：1混合，浓度为108cfu/ml)，对照组灌服5ml的生理盐水无菌溶液，10min后，噬菌体治疗组灌服100ml本发明噬菌体制剂(效价为1010pfu/ml)，攻毒组口服100ml不含噬菌体的生理盐水，试验连续观察14天。2、测定指标及方法在试验期间，详细记录各组动物体重变化、腹泻发生次数、程度及粪便评分(0分，正常粪便；1分，便较软，但能成型；2分，棕褐色稀便；3分，严重水样稀便；连续测定7天)，同时测定直肠温度(连续测定7天)；分别在实验第1、7和14天对所有试验猪前腔静脉采血10ml，制备血浆，-20℃冷冻保藏，用以测定il-8和tnf-α含量。试验结束后，每组选择3头猪进行屠宰，分离消化道样品，用以测定十二指肠、空肠、回肠、结肠和盲肠段肠粘膜结合的大肠杆菌数量和ph值。3、试验结果3.1生长性能试验猪生长性能结果见表3。由表3可知，各组间初始重差异不显著(p>0.05)，攻毒组和治疗组的末重和平均日增重均显著低于对照组(p<0.05)，但是治疗组末重和平均日增重显著高于攻毒组(p<0.05)，说明噬菌体能够在一定程度上抑制由大肠杆菌腹泻引起的体重损失。表3试验猪生长性能3.2直肠温度及粪便评分试验猪直肠温度及粪便评分结果如图5和图6所示。由图5可知，攻毒组和治疗组口服大肠杆菌菌液后，直肠温度会有增高，说明大肠杆菌攻毒后机体产生炎症反应，体温升高，第2天直肠温度达到最高，以后逐步下降，到第7天基本正常，但是攻毒组直肠温度较攻毒组低，说明噬菌体能够抑制大肠杆菌生长，降低了大肠杆菌对机体的炎症反应。由图6可知，攻毒组和治疗组口服大肠杆菌后均能发生不同程度的腹泻，攻毒组从第一天到第七天腹泻评分基本在1.5分以上，治疗组口服本发明第1天后，腹泻症状就开始减轻，第5天后腹泻基本治愈粪便评分基本上在1分以下，说明本发明提供的噬菌体产品能够有效防治大肠杆菌引起的仔猪的腹泻。3.3血液细胞因子含量由表4可知，攻毒组和治疗组口服大肠杆菌攻毒第7天，细胞因子il-8和tnf-α显著升高(p<0.05)，但是攻毒组和治疗组间差异不显著(p>0.05)，到14天时，攻毒组和治疗组细胞因子含量下降，与对照组相比差异不显著(p>0.05)，且噬菌体治疗组细胞因子含量低于攻毒组但未达到差异显著水平(p>0.05)，说明本发明提供的噬菌体产品能够在一定程度上降低大肠杆菌感染引起的炎症反应。表4血液细胞因子含量3.4消化道各肠段黏膜结合的大肠杆菌数量及ph值由表5可知，口服大肠杆菌攻毒，与对照组相比能够显著增加盲肠和结肠ph值(p<0.05)，但是对空肠和回肠段的ph值差异不显著(p<0.05)，说明大肠杆菌感染主要发生在消化道后端，口服本发明提供的噬菌体制剂能够显著降低结肠段ph值(p<0.05)，但是与对照组相比还是显著增加(p<0.05)；从肠道黏膜结合的大肠杆菌数量来看，空肠、回肠、结肠和盲肠各段黏膜均有不同程度的大肠杆菌结合，攻毒组黏膜结合数量显著高于治疗组或对照组(p<0.05)，经口服本发明提供的噬菌体制剂，各肠段黏膜结合的大肠杆菌数量显著下降(p<0.05)，说明本发明噬菌体产品有很强的裂解作用，能够达到消化道后端发挥裂解作用，能够有效防治大肠杆菌引起的腹泻。表5消化道各肠段ph值及黏膜结合的大肠杆菌数量对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。当前第1页12