一种用于制备修复肺血管损伤药物新型过氧化碳酰胺制剂及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及肺血管损伤修复制剂领域，尤其涉及一种用于制备修复肺血管损伤药物新型过氧化碳酰胺制剂及其制备方法。


背景技术：

[0002]
内皮细胞(ecs)是位于血管和淋巴管内壁的一层高分化单层扁平细胞，由内皮细胞形成的血管内皮位于官腔内血液循环和血管壁之间，是维持血管通透性的主要屏障。内皮细胞主要分布在脑、肺、肝脏等器官组织中，较间皮细胞小，排列紧密。人肺动脉内皮细胞(hpaecs)的主要作用是维持血管的动态平衡。此细胞能合成和分泌凝血和纤溶系统中的活化和抑制因子，同时也能合成和分泌影响着血小板粘附和聚集的某些介质。内皮细胞还可以释放具有调控细胞增殖和血管壁张力功能的分子。人肺动脉内皮细胞上的腺苷受体被脂多糖激活后，会引起参与急性肺损伤的病生理过程的il-6的释放。
[0003]
细胞增殖和凋亡是一个多细胞生物在发育过程中的基本生命活动。细胞增殖是以细胞分裂的方式进行增殖，以细胞分裂产生新细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。细胞凋亡是细胞在特定环境下的主动自杀过程。细胞凋亡是临床许多疾病病理变化的主要特征。内皮细胞缺失或功能受损可能会造成许多疾病，如肺动脉高压等。
[0004]
过氧化碳酰胺制剂(cp)分子式为co(nh
2
)
2
·
h
2
o
2
，相对分子质量为94.07，外观为白色较透明片状晶体或是白色粉末状固体。其易溶于水，溶于水会吸热，熔点在75-85℃。溶于水会分解为过氧化氢和尿素，具有尿素和过氧化氢的性质，水溶液ph近中性，无毒无气味，稳定性好，作用效果时间长，可用于杀菌、消毒、漂白等，可广泛应用于医学、日用化工、农业、食品等不同领域。现有的生产方法存在反应条件较高，产率较低，成分复杂，大多生产过氧化碳酰胺制剂需要加热，这也造成了能耗较严重等问题，同时加入了稳定剂，引入了除c、h、o、n以外的其他元素，所以加入合适的稳定剂和降低能耗则是接下来需要解决的问题之一。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于制备修复肺血管损伤药物新型过氧化碳酰胺制剂及其制备方法。
[0006]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0007]
本发明的第一方面是提供一种用于制备修复肺血管损伤药物新型过氧化碳酰胺制剂的制备方法，步骤包括：
[0008]
s1、将物质的量之比为(1～2)：1的过氧化氢和尿素装入反应器，室温下搅拌使其溶解，然后加入0.05～0.2g的山梨酸，室温下搅拌30～200min，得反应溶液；
[0009]
s2、反应结束后，将所述反应溶液置于0～5℃下冷却结晶，结晶时间为12～36h，然后取出过滤，将滤饼放在冷冻干燥机内冻干，冻干时间为5～20h，即得所述新型过氧化碳酰
胺制剂。
[0010]
优选地，所述冻干时间为20h。
[0011]
优选地，所述结晶时间为24h。
[0012]
优选地，所述结晶温度为5℃。
[0013]
优选地，所述搅拌时间为30min。
[0014]
优选地，所述山梨酸的添加量为0.1g。
[0015]
优选地，所述过氧化氢和尿素的物质的量之比为1.6:1。
[0016]
优选地，所述过氧化氢的质量分数为30％。
[0017]
本发明的第二方面是提供一种如前所述制备方法得到的用于制备修复肺血管损伤药物新型过氧化碳酰胺制剂。
[0018]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0019]
本发明新型过氧化碳酰胺制剂的制备方法反应条件温和、产率较高、成分简单、且不需要加热，能耗较低。
[0020]
本发明的新型过氧化碳酰胺制剂可显著促进hpaecs的增殖活性，抑制hpaecs的凋亡活性，尤其是在低氧条件下效果更为显著，可用于促进血管新生，增强细胞增殖能力，可应用于制备修复肺血管损伤的药物。
附图说明
[0021]
图1为本发明新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs增殖的影响；
[0022]
图2为本发明新型过氧化碳酰胺制剂对常氧下hpaecs凋亡的影响；
[0023]
图3为本发明新型过氧化碳酰胺制剂对低氧下hpaecs凋亡的影响；
[0024]
图4为本发明新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs迁移的影响；
[0025]
图5为本发明新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs迁移的影响。
具体实施方式
[0026]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0028]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
[0029]
实施例1
[0030]
本实施例提供一种用于制备修复肺血管损伤药物的新型过氧化碳酰胺制剂，包括尿素、过氧化氢和山梨酸；其制备方法，步骤包括：
[0031]
s1、将物质的量之比为1.6:1的30％过氧化氢和尿素装入反应器，室温下搅拌使其溶解，然后加入0.1g的山梨酸，室温下搅拌30min，得反应溶液；
[0032]
s2、反应结束后，将所述反应溶液置于5℃下冷却结晶，结晶时间为24h，然后取出过滤，将滤饼放在冷冻干燥机内冻干，冻干时间为20h，即得所述新型过氧化碳酰胺制剂。
[0033]
综上所述，本发明新型过氧化碳酰胺制剂的制备方法反应条件温和、产率较高、成分简单、且不需要加热，能耗较低。
[0034]
将上述新型过氧化碳酰胺制剂配置成10-6
～10-12
m不同浓度的溶液待用。
[0035]
检测实施例1
[0036]
检测体外促进内皮细胞(hpaecs)增殖的活性：检测实施例1中的新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs增殖活性的影响。
[0037]
(1)取冻存的hpaecs，37℃水浴锅解冻复苏，加1ml ecm培养基转移至15ml离心管，在低速离心机中以1000rpm离心5min，吸去上清液，然后加入1ml ecm培养基重悬；
[0038]
(2)重悬细胞转移至新培养瓶，加入适量的ecm培养基，置于co
2
培养箱(5％co
2
浓度、37℃)培养；
[0039]
(3)待细胞生长至80％时，消化吹散细胞并计数，调整细胞数目大约为1
×
10
5
个/ml，加至96孔板内，每孔100μl；
[0040]
(4)待细胞贴壁以后，加入10μl不同浓度的新型过氧化碳酰胺制剂，使最后浓度分别为10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m和10-12
m；为了减少误差设定6个副孔，并以水作为阴性对照；
[0041]
(5)将培养板在co
2
培养箱(5％co
2
浓度)或低氧培养箱(5％o
2
浓度)内孵育24h；分别加入10μl cck-8溶液；
[0042]
(6)再次孵育4h后，使用酶标仪测定450nm处的吸光度。
[0043]
实验结果如图1所示，常氧条件下，给药10-9
m时，24h后hpaecs可提高至对照组的126.68％(p<0.05)。低氧条件下，给药10-9
m时，24h后hpaecs可提高至对照组的134.39％(p＝0.001)；即实施例1中的新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs有促进增殖的效果。
[0044]
检测实施例2
[0045]
检测体外抑制内皮细胞(hpaecs)凋亡的活性：检测实施例1中的新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs凋亡活性的影响。
[0046]
(1)取冻存的hpaecs，37℃水浴锅解冻复苏，加1ml ecm培养基转移至15ml离心管，在低速离心机中以1000rpm离心5min，吸去上清液，然后加入1ml ecm培养基重悬；
[0047]
(2)重悬细胞转移至新培养瓶，加入适量的ecm培养基，置于co
2
培养箱(5％co
2
浓度、37℃)培养；
[0048]
(3)待细胞生长至80％时，消化吹散细胞并计数，调整细胞数目大约为1
×
10
5
个/ml，加至24孔板内，每孔200μl；
[0049]
(4)待细胞贴壁以后，常氧组加入10μl不同浓度的新型过氧化碳酰胺制剂，使最后浓度分别为10-8
m、10-9
m和10-10
m；为了减少误差设定2个副孔，并以水作为阴性对照；低氧组加入10μl不同浓度的新型过氧化碳酰胺制剂，使最后浓度分别为10-8
m、10-9
m和10-10
m；为了减少误差设定2个副孔，并以水作为阴性对照；
[0050]
(5)将培养板在co
2
培养箱(5％co
2
浓度)或低氧培养箱(5％o
2
浓度)内孵育24h；
[0051]
(6)吸去培养板中培养液，用pbs清洗2次，然后消化并在1.5ml离心管中重悬细胞，将悬液1000rpm离心5min，弃上清；使用pbs清洗，重复上述步骤两次；
[0052]
(7)加入预先配制好的1x annexin v binding solution，制成最终浓度为1
×
10
6
个/ml的细胞悬液；取上述悬液100μl，加入新的ep管中；
[0053]
(8)向细胞悬液中加入5μl annexin v，fitc结合物，再加入5μl的pi solution；在室温下避光培养15min；最后加入400μl annexin v binding solution；
[0054]
(9)使用流式细胞仪测量hpaecs的凋亡率。
[0055]
实验结果如图2和图3所示，常氧条件和低氧条件与对照组比较均可发现有大量细胞生成，且在低氧条件下的细胞凋亡率升高，可能是由于细胞过多氧气供应不足造成细胞死亡；即实施例1中的新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs有抑制凋亡的效果。
[0056]
检测实施例3
[0057]
检测体外促进内皮细胞(hpaecs)迁移能力：检测实施例1中的新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs迁移能力的影响。
[0058]
(1)取冻存的hpaecs，37℃水浴锅解冻复苏，加1ml ecm培养基转移至15ml离心管，在低速离心机中以1000rpm离心5min，吸去上清液，然后加入1ml ecm培养基重悬；
[0059]
(2)重悬细胞转移至新培养瓶，加入适量的ecm培养基，置于co
2
培养箱(5％co
2
浓度、37℃)培养；
[0060]
(3)待细胞生长至80％时，消化吹散细胞并计数，调整细胞数目大约为1
×
10
5
个/ml，加至24孔板内transwell中，每孔100μl；为了减少误差设定3个副孔，并以水作为阴性对照；常氧组加入10μl不同浓度的新型过氧化碳酰胺制剂，使最后浓度分别为10-8
m、10-9
m和10-10
m；为了减少误差设定2个副孔，并以水作为阴性对照；低氧组加入10μl不同浓度的新型过氧化碳酰胺制剂，使最后浓度分别为10-8
m、10-9
m和10-10
m；为了减少误差设定2个副孔，并以水作为阴性对照；
[0061]
(4)预培养24h，对24孔板各transwell孔取出，采用棉签将小孔内膜细胞轻轻擦出掉，然后用刀片将transwell孔地膜沿着周边轻轻滑下来，将膜倒扣在载玻片上，进行dapi染色，然后倒置显微镜进行拍照；比较膜上dapi数量与总数量之比即可确定给药后细胞的迁移能力大小。
[0062]
实验结果如图4和图5所示，在常氧条件下新型过氧化碳酰胺制剂可增强hpaecs的迁移能力，给药10-8
m时，较对照组的迁移能力提高了28.23％(p<0.05)。而低氧条件下新型过氧化碳酰胺制剂可显著增强hpaecs的迁移能力，给药10-9
m时，较对照组的迁移能力提高了32.37％(p<0.05)；即实施例1中的新型过氧化碳酰胺制剂对hpaecs有提高迁移能力的效果。
[0063]
综上所述，本发明的新型过氧化碳酰胺制剂可显著促进hpaecs的增殖活性，抑制hpaecs的凋亡活性，提高hpaecs的迁移能力，尤其是在低氧条件下效果更为显著，可用于促进血管新生，增强细胞增殖能力，可应用于制备修复肺血管损伤的药物。
[0064]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。