专利名称：靶向的氧化性治疗制剂在癌症治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含过氧化物类物质(peroxidic species)或氧化产物的组合物，其制备方法，和其用途。更具体地，本发明涉及药物组合物或制剂，其包含烯化合物被含氧的氧化剂氧化而产生的过氧化物类物质或反应产物，其为液体形式或在溶液中；含有被螯合的金属的染料；以及芳香族氧化还原化合物(aromatic redoxcompound)。本发明还涉及所述药物制剂的制备和它用于治疗癌症的用途。
背景技术：
臭氧是三原子气体分子，是氧的同素异形体。它可以通过在纯氧中放电或使强紫外线通过而得到。人们对臭氧是严重的污染物的普遍的误解，疾病的“自由基”理论以及抗氧化补充剂市场，显而易见地使主流的医疗不倾向于使用其作为治疗手段。但是“臭氧疗法”是一种误称。臭氧是一种反应性极高且极不稳定的气体，臭氧的反应机制直接与它和细胞质(plasma)及细胞膜中的有机化合物选择性相互作用而产生的副产物相关。臭氧与非饱和的烯在碳一碳双键处发生选择性反应，产生臭氧化物。臭氧本身是有毒的，其反应产物，臭氧化物，是不稳定的，本身也没有治疗性。
过氧化氢(H2O2)发现于1818年，在自然界以痕量存在。过氧化氢不稳定，当与有机膜和颗粒物质直接接触时剧烈分解(或起泡)。光、搅动、加热和铁都会加快过氧化氢在溶液中分解的速率。过氧化氢通过体外(ex vivo)直接接触可杀死具有低水平的破坏过氧化物的酶例如过氧化氢酶的微生物。但是当过氧化氢被输注到感染了过氧化物敏感的大肠杆菌(E.coli)的兔的血液中时，没有杀菌作用。另外，在含大肠杆菌的兔或人血液中体外升高过氧化物的浓度没有产生直接杀菌活性的证据。高浓度的过氧化氢缺乏效用直接与宿主动物血液中破坏过氧化物的酶——过氧化氢酶的存在有关。要起任何作用，高浓度的过氧化氢必须与细菌接触相当长时间。正常情况下血液中存在的大量的破坏过氧化氢的酶，例如过氧化氢酶，使得过氧化物不可能在血液中存在多于数秒钟的时间。因此，通过注射或输注而被导入到血流中的过氧化氢在血液或细胞外液中并不直接充当细胞外杀菌剂。
但是，过氧化氢的确参与了活化的巨噬细胞的杀菌过程。活化的巨噬细胞被吸引到感染或新生物部位，附着于感染生物和/或肿瘤，并将其摄入。在巨噬细胞内这些感染生物和/或肿瘤细胞被过氧化氢所杀死。过氧化氢将细胞中的氯氧化成二氧化氯自由基，其使微生物膜变得不稳定，而且如果持续存在，会诱导凋亡或细胞自杀(cellular suicide)。细胞内过氧化的关键治疗标准是过氧化物载体分子仅仅针对患病的或活化的巨噬细胞被选择性地送递、吸收和活化，这样的巨噬细胞被认为不能具有提升的过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶活性。输注的过氧化氢是全身性的毒物，而靶向的细胞内过氧化则是一种选择性的治疗工具。
根据它们所定位的部位，巨噬细胞在免疫、骨钙化、视觉、神经绝缘(neural insulation)(髓鞘形成)、解毒作用、泵强度(pumpstrength)及身体清除毒素中起关键性的作用。巨噬细胞的能量需求是由称为线粒体的细胞内结构所满足的。线粒体经常在结构上于微丝内部细胞结构(cytoarchitecture)相关联。线粒体折叠的内膜产生高能分子ATP，而外膜含有产生过氧化物的电子再循环分子(electron recycling molecules)和细胞色素。线粒体的外膜对内毒素、真菌毒素、病毒编码的毒素、药物、重金属和杀虫剂的毒性阻断(toxic blockade)和损伤敏感。当线粒体的过氧化功能被阻断时，细胞的丝性结构(filament architecture)倾向于交联，产生不正确的信号、机能不全(incompetence)、不当的复制或细胞过早死亡(premature cell death)。
线粒体细胞色素氧化酶活性在许多恶性肿瘤和病毒感染的巨噬细胞中显著降低(Allen等人，1977)。特别地，对猿病毒转化的和未转化的细胞的研究显示，在转化的细胞中的线粒体细胞色素氧化酶活性只有未转化细胞中的活性的50％(White等人，1975)。一些研究也指示恶性变中的微丝交联，这些缠结的微丝直接影响某些癌基因的活性(Holme，1990)。
淋巴瘤是一个广义的术语，涵盖了多种淋巴系统癌症。在淋巴瘤中，淋巴系统中的细胞不可控制地增殖形成恶性肿瘤。淋巴瘤按细胞类型和癌性肿瘤的表现(presentation)而区分。
淋巴瘤可以在皮肤中的几乎任何位置发生。这些肿瘤经常作为孤立的损害出现，但临近的皮肤可能有发生该肿瘤的危险。早期的损害倾向成为小的浅表的小结，其可能被正常皮肤覆盖。随着肿瘤发展，在上方的表皮层被破坏，并随着损害逐渐扩大，会出现溃疡，坏死和难闻的气味。
淋巴瘤是一种经常被诊断的马肿瘤，占被诊断的新生物的高达20％。诊断的平均年龄为8.5-14.6岁，但也有低达1岁直至29岁的报道。UV辐射已被暗示是发生该肿瘤的促成因素，且颜色较浅的马倾向于具有更高的风险。皮肤癌(cutaneous carcinomas)是从表皮细胞发生的，且为局部浸润性，但倾向于较慢地转移。但是，已经有报道说转移的频率高达18.6％。当转移发生时，局部的淋巴结通常是受累的部位。
治疗方法有数种，根据肿瘤的位置选择最合适的一种。只要可能，手术去除是最常用的治疗。这些肿瘤经常在难以或不可能实现手术去除的位置出现。冷冻手术(cryosurgery)(用液氮冷冻)和化疗是可选择的治疗选项。取决于肿瘤的位置和大小，化疗剂可以作为乳膏(cream)或油膏(ointment)施用于肿瘤表面，或通过注射到肿瘤的基质(base)。如果诊断和治疗开始得早，预后经常是积极的。但是数周或数月后复发并不少见。
因此，需要一种治疗患有癌症例如淋巴瘤的患者的有效而不产生明显副作用的方法。
授予De Villez的美国专利4,451,480教导了一种治疗痤疮的组合物和方法。该方法包括用由臭氧化多种不挥发油和不饱和酯、醇、醚和脂肪酸而得到的臭氧化材料局部处理患处。
授予De Villez的美国专利4,591,602公开了一种加州希蒙得木(jojoba)的臭氧化物，用于控制微生物感染。
授予Herman的美国专利No.4,983,637公开了一种通过施用药学上可接受的载体中的萜的臭氧化物来非经肠地治疗局部和全身病毒感染的方法。
授予Herman的美国专利No.5,086,076公开了一种抗病毒组合物，其包含载体和萜的臭氧化物。该组合物适于全身施用或局部施用。
授予Herman的美国专利No.5,126,376描述了一种使用载体中的萜的臭氧化物来局部治疗哺乳动物中的病毒感染的方法。
授予Herman的美国专利No.5,190,977教导了一种抗病毒组合物，包含非水性载体和适用于全身注射的萜的臭氧化物。
授予Herman的美国专利No.5,190,979描述了一种用载体中的萜的臭氧化物来非经肠地治疗哺乳动物中的医学症状的方法。
授予Herman的美国专利No.5,260,342描述了一种用载体中的萜的臭氧化物来非经肠地治疗哺乳动物中的病毒感染的方法。
授予Herman的美国专利No.5,270,344公开了一种治疗哺乳动物中的全身性机能紊乱的方法，其是通过将不饱和烃的trioxolane或二过氧化物(diperoxide)衍生物施用于哺乳动物的肠，所述衍生物是通过在非极性溶剂中臭氧化所述不饱和烃而制备的。
授予Herman的美国专利No.5,364,879描述了一种用于治疗哺乳动物中的医学症状的组合物，该组合物含有非萜的不饱和烃的二过氧化物或trioxolane衍生物，该衍生物是通过在载体中35℃以下臭氧化所述不饱和烃而制备的。
虽然报道了萜臭氧化物用于不同医学适应证的应用，但是萜臭氧化物显示了许多缺陷。例如，香叶烯和柠檬烯等单萜的臭氧化物曾在实验室着火。因此，它们的配制或存放是极为危险的。
因此，需要利用烯类化合物的氧化反应产物的、安全而有效的药物制剂或组合物。还需要刺激线粒体针对自由基生成的防御和有效治疗患有癌症例如淋巴癌的患者的方法。
发明内容
本发明涉及药物制剂，该制剂包含由含氧的氧化剂氧化液体状态或溶液中的不饱和有机化合物而产生的过氧化物类物质或反应产物；渗透溶剂；螯合的染料；以及芳香族氧化还原化合物。在该药物制剂的一个实施方案中，主要组分包括不饱和醇的臭氧解所形成的过氧化物类物质，稳定性溶剂，金属卟啉以及醌。本发明还涉及该药物制剂用于治疗癌症的用途。
所述过氧化物类物质或反应产物优选地通过烯和臭氧的反应形成。人们普遍认为，烯和臭氧的反应通过Criegee机理进行。根据该机理，如下面的示意图1所示，该反应的第一步是臭氧1，3偶极环加成到烯，产生初级臭氧化物(1，2，3-trioxalane)。该初级臭氧化物不稳定，发生1，3-裂环反应(1，3-cycloreversion)变为羰基化合物和羰基氧化物(carbonyl oxide)。在没有其他试剂或亲核溶剂存在下，这种新的1，3-偶极子(1，3-dipole)进入第二次1，3偶极环加成产生“正常的”臭氧化物1，2，4-trioxalane。
(示意图1)在一个副反应中，羰基氧化物可进入二聚化反应产生过氧化二聚体1，2，4，5-tetraoxane，如下面示意图2所示。
(示意图2)羰基氧化物是强亲电性的物质，在亲核性物质(例如醇或水)存在下其容易发生亲核加成生成1-烷氧基过氧化氢(1-alkoxyhydroperoxide)，如下面示意图3所示。在特定的条件下，1-烷氧基过氧化氢可以进一步反应产生羧酸衍生物。
(示意图3)此外，不受理论限制，认为在本发明中含醇的烯的臭氧解过程中，有理由预期将存在3种主要的过氧化产物正常的臭氧化物；羰基tetraoxane二聚体，和1-烷氧基过氧化氢。在水的存在下，这些过氧化产物中的一些可能也会导致粗产品混合物中有机过酸的存在。
本发明还涉及使用渗透溶剂如二甲亚砜(″DMSO″)来“稳定”臭氧化反应的最初产物。类似地，不受理论限制，认为该稳定化最有可能是简单的溶剂化现象。但是，已知DMSO本身是亲核试剂。它也可能是作为亲核伴侣(nucleophilic partner)参与稳定反应性的物质(例如作为二甲基氧化锍(dimethylsulfoxonium)盐)。本发明的药物制剂中的渗透溶剂和被稳定的过氧化分子是由通常认为是安全的(generally regarded as safe，“GRAS”)的组分制成的。
所述药物制剂的另一组分是螯合的染料，例如卟啉。金属卟啉在光化学激发下敏化氧的倾向，以及亚铁卟啉和铜卟啉结合含氧系统的倾向，都已经得到了充分的证明。
所述药物制剂的另一组分是芳香族氧化还原化合物，例如醌。
虽然受理论限制，假定优选的药物制剂是在感染的、活化的、肿瘤性的和发育不良的巨噬细胞中诱导循环性自催化氧化(recycling autocatalytic oxidation)的生化剂的组合。该药物制剂通过未被抵抗的过氧化作用(unopposed peroxidation)刺激靶向的凋亡(细胞自杀)。因此，该药物制剂在多种看起来截然不同的基于线粒体的巨噬细胞疾病中产生治疗效果。特别地，已经证明，在具有缺陷的细胞色素氧化酶和过氧化氢酶活性的实体瘤中，该药物制剂选择性地杀死癌细胞而没有附带损害。该药物制剂还可有效地降低肿瘤细胞增殖和肿瘤生长。这些结果暗示了其治疗癌症的有效性。
图1显示用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理的小鼠ASL-1细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图2显示用不同浓度的本药物制剂的另一个实例处理的小鼠ASL-1细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图3显示用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理的小鼠EL-4细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图4显示用不同浓度的本药物制剂的另一个实例处理的小鼠EL-4细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图5显示在用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理后，随时间计算的活的小鼠ASL-1细胞数。
图6显示在用所述药物制剂的两个实例的任一个处理4小时和20小时后，计算到的死亡的小鼠ASL-1百分率。
图7显示用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理的、促细胞分裂剂刺激的小鼠淋巴细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图8显示显示用不同浓度的本药物制剂的另一个实例处理的、促细胞分裂剂刺激的小鼠淋巴细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图9显示用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理的小鼠脾细胞肿瘤细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图10显示用不同浓度的本药物制剂的另一个实例处理的小鼠脾细胞肿瘤细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图11显示用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理的小鼠胸腺细胞肿瘤细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图12显示用不同浓度的本药物制剂的另一个实例处理的小鼠胸腺细胞肿瘤细胞的核苷酸摄入(3H-TdR)。
图13显示在用不同浓度的本药物制剂的一个实例处理后，随时间计算的死亡的小鼠胸腺淋巴瘤细胞的百分率。
图14显示从只用DSMO处理的小鼠和用本药物制剂的一个实例处理的小鼠切下的肿瘤的平均重量。
具体实施例方式
本发明涉及药物制剂，其包含由含氧的氧化剂氧化液体状态或溶液中的非饱和有机化合物而产生的过氧化物类物质或反应产物；渗透溶剂；螯合的染料；以及芳香族氧化还原化合物。该药物制剂可用来治疗患有癌症例如淋巴癌的个体。在该药物制剂的一个实施方案中，主要组分包括不饱和醇的臭氧解所形成的过氧化物类物质，稳定性溶剂，金属卟啉以及醌。
所述药物制剂中的不饱和的有机化合物-其也可以是不饱和的烯烃-可以是不带羟基的烯，或含羟基的烯。优选地，所述烯具有少于约35个碳原子。不带羟基的烯可以是开链不饱和烃，单环不饱和烃，或双环不饱和烃。含羟基的烯可以是开链的不饱和醇，单环不饱和醇，或双环不饱和醇。所述烯也可以包含在不挥发油、酯、脂肪酸或醚中。
使用的不饱和烯烃可以是非取代的，取代的，环状的或复合的(complexed)烯、肼、类异戊二烯、类固醇、喹啉、类胡萝卜素、生育酚、异戊二烯化(prenylated)蛋白质，或不饱和脂肪。本发明的优选的不饱和烃是烯和类异戊二烯。
类异戊二烯主要在植物中作为精油的组分存在。虽然许多类异戊二烯是烃，也存在含氧的类异戊二烯，例如醇、醛和酮。从形式上说，类异戊二烯烃的结构单元可以看作异戊二烯烃CH2＝C(CH3)-CH＝CH2，尽管已知异戊二烯本身是类异戊二烯生物合成的终产物而不是中间产物。类异戊二烯烃是根据它们包含的异戊二烯(C5H8)单元的数目来分类的。因此，单萜有2个、倍半萜有3个、二萜有4个、二倍半萜(sesterterpenes)有5个、三萜有6个，四萜有8个异戊二烯单元。四萜更常被称为类胡萝卜素。
柠檬烯和蒎烯是单萜的例子。法尼醇和橙花叔醇(nerolidol)是倍半萜的例子。维生素A1和叶绿醇是二萜烯醇(diterpenealcohol)的例子，而鲨烯是三萜的例子。被称为胡萝卜素的维生素原A1(Provitamin A1)是四萜的例子。香叶醇是一种单萜烯醇(monoterpene alcohol)，它在正常状态和结合氧的状态都是液体，而且对活细胞是安全的。
优选用于所述药物制剂的不饱和烃包括类异戊二烯的烯(alkene isoprenoids)，例如myricene，citrillene，柠檬醛，蒎烯，或柠檬烯。优选的不饱和烃还包括线性的类异戊二烯醇，其具有线性链中的2-4个重复的异戊二烯基团，例如松油醇，香茅醇，橙花醇，叶绿醇，薄荷醇，香叶醇，香叶基香叶醇(geranylgeraniol)，芳樟醇，或法尼醇。
在构型上，所述不饱和有机化合物可以是线性、分枝、环状、螺旋状或与其他分子复合的。该不饱和有机化合物在与氧化剂结合之前可天然地以气态、液态或固态存在。
开链不饱和烃可以是CnH2n，1个双键，n＝2-20；CnH2n-2，2个双键；n＝4-20；CnH2n-4，3个双键，n＝6-20；CnH2n-6，4个双键；n＝8-20；C25H40，倍半萜烯烃；或C30H48，三萜烯烃。
单环不饱和烃可以是CnH2n-2，1个双键和1个环，n＝3-20；CnH2n-4，2个双键和1个环；n＝5-20；CnH2n-6，3个双键和1个环，n＝7-20；C25H40倍半萜烃；或C30H48，三萜烃。
双环不饱和烃可以是CnH2n-4，1个双键和2个环，n＝4-20；CnH2n-6，2个双键和2个环；n＝6-20；C25H40，倍半萜烃；或C30H48，三萜烃。
开链不饱和醇可以是CnH2nOm，1个双键，n＝3-20，m＝1-4；CnH2n-2Om，2个双键，n＝5-20，m＝1-4；CnH2n-4Om，3个双键，n＝7-20，m＝1-4；CnH2n-6Om，4个双键，n＝9-20，m＝1-4；C25H40Om，m＝1-4，倍半萜烯醇(sesterterpene alcohols)；或C30H48On，m＝1-4，三萜烯醇(triterpene alcohols)。
单环不饱和醇可以是CnH2n-2Om，1个双键和1个环，n＝3-20，m＝1-4；CnH2n-4Om，2个双键和1个环，n＝5-20，m＝1-4；CnH2n-6Om，3个双键和1个环，n＝7-20，m＝1-4；C25H40Om，m＝1-4，倍半萜烯醇(sesterterpene alcohols)；或C30H48Om，m＝1-4，三萜烯醇(triterpene alcohols)。
双环不饱和醇可以是CnH2n-4Om，1个双键和2个环，n＝5-20，m＝1-4；CnH2n-6Om，2个双键和2个环，n＝7-20，m＝1-4；C25H40Om，m＝1-4，倍半萜烯醇(sesterterpene alcohols)；或C30H48Om，m＝1-4，三萜烯醇(triterpene alcohols)。
基于所述药物制剂的总重量，烯可以为大约0.001％到大约30％，优选大约0.1到大约0.5％，更优选大约0.5％到大约3.0％。
药物制剂中氧化所述不饱和烃的含氧的氧化剂可以是单线态氧，三线态氧，超氧阴离子，臭氧，高碘酸盐，羟基，过氧化氢，烷基过氧化物，氨甲酰基过氧化物，苯甲酰基过氧化物，或结合于过渡元素如钼的氧(例如MoO5)。
结合“活化的氧”到完整的类异戊二烯醇，例如香叶醇的优选方法是通过在没有水或极性溶剂存在下，0-20℃的温度下，黑暗中进行臭氧化。然后香叶醇“臭氧化物”在黑暗中被溶解和稳定在100％DMSO中以避免产物的过早降解。虽然不想受限于理论，相信在超氧阴离子存在下，在细胞内部香叶醇臭氧化的tetraoxane过氧化二聚体副产物-其不是臭氧化物-会发生催化降解。最终释放的反应性治疗剂是过氧化氢和乙酸。
药物制剂还使用渗透溶剂。渗透溶剂稳定化结合氧的不饱和烃，它可以是润滑剂，液体，脂质体，胶束膜，或蒸汽。可用的渗透溶剂包括水性溶液，脂肪，固醇，卵磷脂，磷酯，乙醇，丙二醇，甲磺酰甲烷(methylsulfonylmethane)，聚乙烯吡咯烷酮，pH缓冲盐水，和二甲亚砜(″DMSO″)。优选的渗透溶剂包括DMSO，聚乙烯吡咯烷酮，和pH缓冲盐水。最优选的渗透溶剂是DMSO。
基于药物制剂的总重量，渗透溶剂可以为大约50％到大约99％，优选大约90％到大约98％，更优选大约95％到大约98％。
“稳定化的”过氧化分子和其渗透溶剂是用目前在食品药品管理局(“FDA”)的监管下用于生产的组分制备的。这些成分是药物主文(Drug Master Files)和药物专论(Drug Monographs)的题目，它们可在美国药典/国家处方集(USP/NF)中找到，或者是通常被认为安全的(″GRAS″)。
所述药物制剂的另一组分是螯合的染料。该染料优选地含有螯合的二价或三价金属，例如铁、铜、锰、锡、镁或锶。优选的螯合的金属是铁。金属卟啉在光化学激发下敏化氧的倾向，以及亚铁卟啉和铜卟啉结合含氧系统的倾向，都已经得到了充分的证明。可用的染料包括天然或合成的染料。这些染料的例子包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸、氯高铁血红素、卟吩、咕啉，texaphrins、亚甲蓝，苏木精，曙红，赤藓红，类黄酮(flavinoids)、核黄素、蒽染料、金丝桃素、甲基胆蒽、中性红、酞菁、荧光黄、真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)。优选的染料可以是任何天然或合成的卟啉、血卟啉、叶绿酸、玫瑰红、它们各自的同源物，或其混合物。最优选的染料是天然存在的卟啉，例如血卟啉和玫瑰红。该染料可以对光子、激光、电离辐射(ionizing radiation)、声子、电心脏冲动(electrical cardiac impulse)、电穿孔、磁脉冲，或连续流激发(continuous flow excitation)起响应。
基于药物制剂或组合物的总重量，该染料可以为约0.1％到约30％，优选约0.5％到约5％，更优选约0.8到约1.5％。
本药物制剂的另一组分是芳香族氧化还原化合物，例如醌。该芳香族可以是任何取代或非取代的苯醌、萘醌或蒽醌。优选的芳香族氧化还原化合物包括苯醌、甲基苯醌、萘醌和甲基萘醌。最优选的芳香族氧化还原化合物是甲基萘醌。
基于药物制剂或组合物的总重量，芳香族氧化还原化合物可以为约0.01％到约20.0％，优选约0.1％到约10％，更优选约0.1到约0.5％。
药物制剂还优选地被能量源或电子供体所活化。有用的电子供体包括NADH、NADPH、电流、抗坏血酸盐或抗坏血酸、和三氧化二锗。优选的电子供体包括抗坏血酸盐和三氧化二锗。最优选的电子供体是任何盐形式的抗坏血酸。
基于药物制剂的总重量，电子供体可以为约0.01％到约20％，优选约1％到约10％，更优选约l到约5％。
为了获得体内的生物效应，药物制剂优选地作为臭氧解产生的不饱和烃过氧化产物，而不是臭氧化物，与产生超氧化物的螯合染料及芳香族的醌组合。不饱和烃产物，或过氧化二聚体分子，应该稳定在非水性的稳定化溶剂中，且应该能渗透脂膜。
能量活化染料疗法(energetical1y activated dye therapy)的研究者早已知道产生超氧化物的染料和芳香族氧化还原化合物优先吸收到感染的、活化的、肿瘤性的或发育不良的细胞，这些细胞通常也是过氧化氢酶缺陷的。不想受理论限制，认为在靶细胞中，过氧化氢酶所诱导的过氧化物的破坏应该天然地被压制或被该药物制剂所压制。过氧化二聚体应该也被该产超氧化物的染料所活化，引发电子被供给二聚体，并导致细胞内过氧化氢和乙酸的释放。该染料的电子活化并不总是需要光，而是可以通过小电脉冲发生，所述小电脉冲是由例如心脏脉冲提供的。然后在感染的巨噬细胞中的过氧化反应倾向于破坏细胞内微管的异戊二烯化蛋白连接，摧毁感染的毒素，或诱导巨噬细胞宿主细胞的凋亡。
所述药物制剂是稳定的成分的组合。这些成分可以优选地作为干燥地固体成分和液体成分保存在不同的容器中，然后在使用的地方混合它们。所述干燥的固体成分优选地包含螯合的染料和芳香族氧化还原化合物。液体成分优选地包含所述由含氧活性剂活化不饱和烃而产生的过氧化物类物质或反应产物，以及渗透溶剂。优选通过静脉内施用。重溶的产品优选地可以作为稀释在盐水中的浓缩液而通过静脉内施用。局部、眼、腹膜内、直肠或鞘内送递也是可能的施用途径。不优选肌肉注射，因为它有产生局部刺激的倾向。
体内施用所述药物制剂可以有效地治疗受影响的患者中的新生物。具体地，该药物制剂抑制培养的肿瘤细胞的自发和促细胞分裂剂刺激下的增殖。已证明在具有缺陷的细胞色素氧化酶和过氧化氢酶活性的实体瘤中，该药物制剂选择性地杀死癌细胞而没有附带损害。
实施例1.不饱和烃的臭氧解烯的臭氧解可以在溶液中或单独(neat)进行。在任一情形下，反应混合物的冷却对于防止该反应的过氧化产物的爆炸性分解都是关键的。
下列通用过程对液体烯的臭氧解而言是典型的。
将烯(2摩尔)装入带有磁力搅拌子的1升烧瓶将该装置称重。用冷却浴(冰-水或冰-盐)将烧瓶包围。一旦内容物被冷却到5℃以下，即开始搅拌，并使含臭氧的干燥的氧(典型地为3％臭氧)气流通过该混合物。借助玻璃料(glass frit)来分散该臭氧化的(ozonated)氧是有利的手段，但是对被搅拌的溶液就不需要了。定期地停止气流并称重反应烧瓶或对反应混合物取样。然后重新开始气流。
一旦反应烧瓶的质量显示出足够的增重，或一旦反应混合物的质子磁共振(″H1NMR″)谱显示所需的烯质子共振强度的所希望的减少(通常大约50％)，则停止气流。
臭氧解可以如上述进行，用烯在与臭氧没有反应性的溶剂如饱和烃或氯化烃中的溶液来替代。臭氧解也可以如上述进行，有或没有溶剂，用烯醇(alkenol)来替代烯，而不以任何实质性的方式影响该反应。
然后将反应混合物缓慢地倒入冷却的渗透溶剂。
实施例2药物制剂的制备本发明的优选的药物制剂是如下制备的(1)以1升气体每小时将120mg/L的臭氧/纯氧气体混合物向上鼓泡通过一种二烯醇(alkadiene alcohol)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇(香叶醇)；(2)将反应的温度保持在5℃左右；(3)每小时取出小等份的反应产物，并用H1NMR测量过氧化物类物质或反应产物的形成；(4)当多于50％的可用的不饱和键已反应以后，停止反应；(5)用二甲亚砜(1∶10)稀释产物混合物，得到溶液或分散体；(6)在目标生物系统中使用之前，将血卟啉、玫瑰红和甲基萘醌干粉的混合物加入溶液或分散体中，加入的量足以使分散于其中的每一组分在通过盐水静脉输注送递到目标生物系统时形成20μM的浓度。任选地，抗坏血酸盐可在使用前加入制剂中。
实施例3药物制剂的例子优选的两种配方如下
*通过质谱测定
*通过质谱测定实施例4治疗马淋巴瘤的定性评价将药物制剂静脉注射到7匹分别具有淋巴瘤肿瘤细胞生长的受试马中。剂量和疗程由6次药物制剂治疗构成，每次治疗由溶于30cc的无菌生理盐水的3cc的上述实施例3的制剂A组成，经历2周的时间。注射为颈静脉内注射。在该疗程期间不给予其他的疗法或程序。
对所有的受试马进行预处理和随后的(follow-up)活组织检查，并对其中的一匹受试马进行了系列摄影。显微和摄影证据证明了新生物的消解，正常结构的恢复，及最终的愈合。临床观察指出，在没有外科或其他的过程性介入下，随着治疗过程的进行肿瘤颜色变灰，剥落。处理后(30天)的受试马的摄影记录显示新生的肉芽形成(raw granulation)和肌肉组织，然后被正常的上皮覆盖而愈合。初始治疗两年后拍摄的摄影证据显示了正常的、无症状的组织的持续生长。显微记录也显示肿瘤的完全消解和正常组织的重新生长。其他的受试马没有被拍照，但显示了相似的消解进程。
实施例5降低培养的肿瘤细胞的增殖分别培养两种小鼠肿瘤细胞系ASL-1(白血病)和EL-4(T细胞淋巴瘤)。
用浓度为0％、0.001％、0.01％和0.1％的实施例3所述的制剂A和制剂B处理这些细胞的样品。为了测量该药物制剂对培养的肿瘤细胞增殖的效应，测量从培养基中对氚化的胸腺嘧啶(3H-TdR)的摄取。对这种胸腺嘧啶核苷酸的摄取表示细胞增殖为阳性，因为其显示细胞正在进行DNA合成。
图1-4所示的结果显示，0.01％和0.1％浓度下的制剂A和制剂B都抑制ASL-1和EL-4细胞的增殖。
并且，在0.01％和0.001％浓度的制剂A处理后对存活的ASL-1细胞计数。结果显示于图5。通过制剂A的处理存活的ASL-1细胞数显著降低。
图6显示制剂A和B在ASL-1细胞中诱导凋亡或细胞死亡。制剂A或制剂B处理4小时后都没有观察到细胞死亡。但是20小时后被制剂A处理的ASL-1细胞几乎100％死亡。
结果显示该药物制剂可以有效地降低肿瘤细胞的增殖和刺激肿瘤细胞中的凋亡。
实施例6抑制促细胞分裂剂刺激的淋巴细胞增殖培养小鼠淋巴细胞，并用促细胞分裂剂处理以刺激增殖。
用浓度为0％、0.001％、0.01％和0.1％的实施例3所述的制剂A和制剂B处理这些细胞的样品。为了测量该药物制剂对培养的肿瘤细胞增殖的效应，测量从培养基中对氚化的胸腺嘧啶(3H-TdR)的摄取。
结果如图7-8所示，显示0.001％、0.01％和0.1％浓度的制剂A和制剂B都抑制促细胞分裂剂刺激的淋巴细胞增殖。
实施例7抑制自然的淋巴细胞增殖培养小鼠脾细胞和淋巴细胞肿瘤细胞。
用浓度为0％、0.001％、0.01％和0.1％的实施例3所述的制剂A和制剂B处理这些细胞的样品。为了测量该药物制剂对培养的肿瘤细胞增殖的效应，测量从培养基中对氚化的胸腺嘧啶(3H-TdR)的摄取。
结果如图9-12所示，显示0.1％浓度的制剂A和制剂B都抑制自然的淋巴细胞增殖，其中制剂A在0.01％的也显示抑制。
实施例8肿瘤细胞的形态学检查肿瘤细胞样品用实施例5、6和7的药物制剂处理后被杀死，用锥虫蓝将其染色并用显微镜检查。虽然细胞看上去已死亡，它们的形态还是完整的。这一观察结果显示该药物制剂在肿瘤细胞中是诱导凋亡而不是诱导坏死。
实施例9体外对培养的小鼠胸腺淋巴瘤的影响从3月龄的Atm/-小鼠中分离胸腺淋巴瘤细胞并培养。
用DMSO和0.01％及0.1％浓度的上述实施例3的制剂A处理这些细胞样品。对照样品只用DMSO处理。
图13显示各浓度的制剂A处理后死亡的肿瘤细胞的百分比。该结果清楚地显示，该药物制剂在体外减少了存活的胸腺肿瘤细胞数。
实施例10体外对小鼠胸腺淋巴瘤的影响如实施例9培养的胸腺淋巴瘤细胞(1×105)皮下注射到成年雄性Atm+/+小鼠中。
6天后，用0.01％浓度的实施例3的制剂A通过20mg/kg体重的皮下注射处理小鼠。每天进行该处理，持续14天。注射了培养的淋巴瘤细胞的对照小鼠用DMSO处理。14天后，切下生长在小鼠上的肿瘤并称重。
图14显示在药物制剂处理的小鼠和DMSO处理的小鼠中的肿瘤的平均重量。结果显示该药物制剂抑制被培养并移植到免疫妥协(immune compromised)的受体转基因小鼠中的胸腺淋巴瘤细胞的体内生长。
参考文献在此通过引用将下面的美国专利文献和出版物并入本文。
美国专利美国专利No.4,451,480授予DeVillez美国专利No.4,591,602授予DeVillez美国专利No.4,983,637授予Herman美国专利No.5,086,076授予Herman美国专利No.5,126,376授予Herman美国专利No.5,190,977授予Herman美国专利No.5,190,979授予Herman美国专利No.5,260,342授予Herman美国专利No.5,270,344授予Herman美国专利No.5,364,879授予Herman其他出版物Allen，N.，Clendenon，N.R.，等人.Acid hydrolase andcytochrome oxidase activities in nitrosourea induced tumorsof the nervous system.Acta Neuropathol(Berl)，vol.39(1)，pp.13-23，19.77.
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权利要求
1.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药物制剂，该药物制剂包括由含氧的氧化剂氧化薄荷醇或烯而生成的过氧化物类物质或反应产物，其中所述烯包括松油醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、叶绿醇、香叶醇、紫苏子醇、薄荷醇、香叶基香叶醇或法尼醇，其中所述由薄荷醇或烯的氧化而生成的过氧化物类物质或反应产物约为药物制剂的0.001wt％-30wt％；渗透溶剂，其中该渗透溶剂包括二甲亚砜、固醇、卵磷脂、丙二醇或甲磺酰甲烷，且其中渗透溶剂约为药物制剂的50wt％-99wt％；含有螯合的二价或三价金属的染料，其中所述染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸、氯高铁血红素、咕啉、texaphrin、亚甲蓝、苏木精、曙红、赤藓红、核黄素、蒽染料、金丝桃素、甲基胆蒽、中性红、酞菁、荧光黄、真黑素或褐黑素，且其中所述染料约为药物制剂的0.1wt％-30wt％；以及芳香族氧化还原化合物，其中所述氧化还原化合物包括取代的或非取代的苯醌、萘醌或者蒽醌，且其中所述芳香族氧化还原化合物约为药物制剂的0.01wt％-20wt％。
2.权利要求1的方法，其中烯为液体形式，在溶液中，或在悬液中。
3.权利要求1的方法，其中烯包含于不挥发油、酯、脂肪酸或醚中。
4.权利要求1的方法，其中含氧的氧化剂包含单线态氧、三线态氧、超氧阴离子、高碘酸盐、羟基、过氧化氢、烷基过氧化物、氨甲酰基过氧化物、苯甲酰基过氧化物或结合于过渡元素的氧。
5.权利要求1的方法，其中含氧的氧化剂包含臭氧。
6.权利要求1的方法，其中渗透溶剂是液体、胶束膜、脂质体、润滑剂或蒸汽。
7.权利要求1的方法，其中渗透溶剂是二甲亚砜(“DMSO”)。
8.权利要求1的方法，其中染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸或其混合物。
9.权利要求1的方法，其中金属包括铁。
10.权利要求1的方法，其中金属包括铜、锰、锡、镁或锶。
11.权利要求1的方法，还包括电子供体。
12.权利要求11的方法，其中电子供体包含抗坏血酸或其药用盐。
13.权利要求1的方法，其中癌症是淋巴瘤。
14.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药物制剂，该药物制剂包含香叶醇被臭氧和氧的混合物氧化所生成的过氧化物类物质或反应产物；二甲亚砜(“DMSO”)；含有螯合的二价或三价金属的染料，其中该染料包含血卟啉和玫瑰红的混合物或血卟啉和叶绿酸的混合物；以及甲基萘醌。
15.权利要求14的方法，其中癌症是淋巴瘤。
16.一种抑制患者中肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药物制剂，该药物制剂包含由含氧的氧化剂氧化薄荷醇或烯而生成的过氧化物类物质或反应产物，其中所述烯包括松油醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、叶绿醇、香叶醇、紫苏子醇、薄荷醇、香叶基香叶醇或法尼醇，且其中所述由薄荷醇或烯的氧化而生成的过氧化物类物质或反应产物约为药物制剂的0.001wt％-30wt％；渗透溶剂，其中该渗透溶剂包括二甲亚砜、固醇、卵磷脂、丙二醇或甲磺酰甲烷，且其中渗透溶剂约为药物制剂50wt％-99wt％；含有被螯合的二价或三价金属的染料，其中所述染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸、氯高铁血红素、咕啉、texaphrin、亚甲蓝、苏木精、曙红、赤藓红、核黄素、蒽染料、金丝桃素、甲基胆蒽、中性红、酞菁、荧光黄、真黑素或褐黑素，且其中所述染料约为药物制剂的0.1wt％-30wt％；以及芳香族氧化还原化合物，其中所述氧化还原化合物包括取代的或非取代的苯醌、萘醌或者蒽醌，且其中所述芳香族氧化还原化合物约为药物制剂的0.01wt％-20wt％。
17.权利要求16的方法，其中烯为液体形式，在溶液中，或在悬液中。
18.权利要求16的方法，其中烯包含于不挥发油、酯、脂肪酸或醚中。
19.权利要求16的方法，其中含氧的氧化剂包含单线态氧、三线态氧、超氧阴离子、高碘酸盐、羟基、过氧化氢、烷基过氧化物、氨甲酰基过氧化物、苯甲酰基过氧化物或结合于过渡元素的氧。
20.权利要求16的方法，其中含氧的氧化剂包含臭氧。
21.权利要求16的方法，其中渗透溶剂是液体、胶束膜、脂质体、润滑剂或蒸汽。
22.权利要求16的方法其中渗透溶剂是二甲亚砜(“DMSO”)。
23.权利要求16的方法，其中染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸或其混合物。
24.权利要求16的方法，其中金属包括铁。
25.权利要求16的方法，其中金属包括铜、锰、锡、镁或锶。
26.权利要求16的方法，还包括电子供体。
27.权利要求16的方法，其中电子供体包含抗坏血酸或其药用盐。
28.权利要求16的方法，其中肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。
29.一种抑制患者中肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药物制剂，该药物制剂包含香叶醇被臭氧和氧的混合物氧化所生成的过氧化物类物质或反应产物；二甲亚砜(″DMS0″)；含有被螯合的二价或三价金属的染料，其中该染料包含血卟啉和玫瑰红的混合物或血卟啉和叶绿酸的混合物；以及甲基萘醌。
30.权利要求29的方法，其中肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。
全文摘要
本发明公开了一种药物制剂及其用途。该药物制剂含有由含氧的氧化剂例如臭氧氧化烯例如香叶醇而产生的过氧化物类物质或反应产物；渗透溶剂，例如二甲亚砜(“DMSO”)；含螯合金属的染料，例如血卟啉；和芳香族氧化还原化合物，例如苯醌。本药物制剂用于有效地治疗癌症例如淋巴瘤患者。
文档编号A61K31/525GK101083980SQ200580023352
公开日2007年12月5日 申请日期2005年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者罗伯特·F·霍夫曼 申请人:罗伯特·F·霍夫曼