专利名称：用于治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰rna制剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂及其制备方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)是严重损害人类健康的病毒性肝炎的重要致病因子之一。乙型病毒性肝炎在临床上呈现各种不同的疾病类型，包括无症状携带状态，急、慢性肝炎，重症肝炎，肝硬化，最终可能发展为肝癌。目前干扰素是最常用的抗HBV药物，在严格选择适应症的患者中，有效率仅达30％～40％。核苷类似物未呈现明显的临床效果，且有明显的毒性。
1965年Blumberg及其同事发现了澳大利亚抗原(Austril-ianantigen)，经过一系列临床观察证明澳大利亚抗原就是乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，这是最早发现的肝炎病毒抗原。1970年Dane发现了完整的HBV颗粒，称之为Dane颗粒，直径为42nm，含外膜和核心。HBV为双链环状DNA病毒。其外膜为糖脂蛋白结构，约含25％脂质和75％糖蛋白，糖蛋白主要成分为HBsAg。在电镜下存在于血清中的HBsAg为直径约22nm的小球形颗粒和管状结构。用去污剂破坏HBV的外膜，就可见到27nm的核心颗粒，由核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)、DNA多聚酶(DNA-P)和乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)所组成。HBV-DNA含正链和负链，负链全长3200bp，包括HBV的全部基因，共4个开放读码框架(ORF)即S、C、P和X区，各ORF之间相互重叠。不同HBV之间存在着基因变异，即使在同一血清型的HBV之间，HBV基因的变异也达10.4％。HBV基因变异与病毒的致病性有关。近年来很多研究表明从重症肝炎和慢性活动性肝炎患者中分离的HBV，其C区基因中均有基因点突变。由于这些突变改变了HBV的抗原成分，而激起了机体不同免疫反应，使病情加重，病程迁延化。
RNAi技术(RNA干涉技术)，简言之，就是当把21-23个核苷酸长的RNA片段(dsRNA)导入细胞或组织中后，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段，从而降解mRNA，阻碍或阻止了由mRNA翻译成相应蛋白质的过程。举例说明，根据病毒复制相关的mRNA序列，设计21-23个核苷酸长的RNA片段(dsRNA)，当病毒侵入生物体后，把dsRNA导入生物体，引起病毒复制相关的mRNA的降解，从而阻断了病毒的复制，达到清除病毒的作用。
RNAi发现仅短短5年的时间，由于其高效性和高度特异性，RNAi成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段。通过采取21 nt siRNA在哺乳动物细胞中诱导了强有力的特异性RNA干扰作用，这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新天地，在AIDS等病毒感染性疾病治疗中的应用研究非常活跃和深入，并取得了令人鼓舞的成果。
在AIDS的治疗上，RNA干扰可能成为对抗HIV病毒感染、复制的最有利方式。人们针对HIV生活周期的不同阶段设计了多种siRNA，针对HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒复制，针对宿主细胞的表面HIV受体基因的siRNA可用以控制病毒进入宿主细胞内，抑制病毒的感染过程。RNAi技术除用于抗HIV研究以外，还用于抗其他多种病毒的探索。它们包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(influenzavirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)等。
2002年12月20日，Small RNA & RNAi被Science杂志评为年度十大科技成就之首，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与人类基因组计划(human genomicsprogram，HGP)相提并论的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。人们对小RNA分子的深入研究必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒性疾病和肿瘤等疾病的根治，开辟新的治疗途径。具有极其重要的理论和实际意义，它必将对生物学和医学的发展产生深远的影响。
多肽基因释放系统中最早使用的是二油酰蜂毒肽(dioleoylmelittin)，与质粒DNA形成环形颗粒，可有效地转染真核细胞，建立了多肽转基因载体的方法。碱性氨基酸多肽长度16～18氨基酸足以转移DNA至细胞内。阳离子多聚赖氨酸或精氨酸肽链压缩DNA分子，最少需6到8个阳离子氨基酸残基；添加半胱氨酸和组氨酸后可以增加转染效率，如Cys-His-(Lys)(6)-His-Cys寡肽等。多肽载体是配体区、结合DNA的阳离子区、核定位信号区、两性分子功能区，是四位一体的合成短肽。如THALWHT寡肽可特异结合气道上皮，共聚焦显微镜发现标记的THALWHT寡肽与细胞结合后，被吞入细胞内；包含CTHALWHTC序列和DNA结合部分的合成多肽，能有效地将基因转移到气道上皮细胞内。添加吞噬泡释放剂、阳离子聚合物以及病毒的表面蛋白颗粒有助于提高转染效率。多肽载体的优势在于可用多肽合成仪合成，便于体内应用和基因工程法生产，克服了配体寡肽与多聚赖氨酸或PEI偶联制备的复杂性、不均一性以及系统误差大的缺陷。多肽载体是非病毒载体小型化的趋势。不足之处在于阳离子负荷相对偏少。
肝脏为靶器官的给药系统能提高肝脏的药物浓度，提高药物对某些肝脏疾病的治疗效果和降低毒副作用。目前，主要有如下几种机制可以实现肝靶向药物的传输1.含糖基的大分子化合物通过肝实质细胞去唾液酸糖蛋白受体或非实质细胞(Kupffer细胞和内皮细胞)甘露糖受体介导途径；2.聚阴离子化合物通过肝巨噬细胞和内皮细胞的清除介导途径，如强阴离子化合物丁二酰脂蛋白，但弱聚阴离子化合物仅有很小程度的肝摄入；3.聚阳离子化合物在肝细胞膜上经独特的静电作用途径，如二乙胺葡聚糖与肝细胞膜产生静电作用，使肝摄入增加；4.某些内源性载体，利用其特异性、可溶性优势，包裹或携带药物进入肝组织，如类脂乳、胆酸、微球等。经肝脏去唾液酸糖蛋白受体介导的给药系统对肝有较高的亲和性，且肝吸收迅速，在肝实质细胞中直接发挥作用，是目前最好的肝靶向的给药途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂，治疗效率高，毒副作用小；本发明的另一个目的在于提供其制备方法。
本发明治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂，由小干扰RNA、肝细胞靶向分子和核酸结合分子组成，能将小干扰RNA高效导入肝细胞或肝组织，使乙肝病毒(HBV)病毒的反转录酶失活，使HBV的Enhancer I核心区的功能丧失，降解HBV前基因组RNA，从而达到调控HBV基因及其表达的作用；也可抑制宿主细胞上HBV病毒的受体基因及肝损伤相关基因的表达。
本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的21-23碱基对的双链RNA；也可以是表达载体或表达框架表达的21-23碱基对的双链RNA，所述的表达载体或表达框架为RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子。
本发明所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述的靶序列是乙型肝炎病毒的RNA基因组序列，或发病宿主自身基因的序列包括人肝细胞的乙型肝炎病毒的受体去唾液酸糖蛋白或Fas基因；小干扰RNA的序列可以由序列表中至少一个序列组成。
本发明所述的肝细胞靶向分子为乳糖或半乳糖、乳糖或半乳糖化蛋白或去唾液酸糖蛋白；可以是聚乙二醇(PEG)修饰的聚乙烯亚胺(PEI)。
本发明所述的核酸结合分子可以是富含碱性氨基酸和两性氨基酸分子，可以是线性分子，其序列特征为KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA，CCKKHHHKKHKKHGGLLALALHHLALLAHHLALAL；也可以是分枝型的分子(序列特征见图1)；所述的核酸结合分子核酸结合分子可以是通过化学方法合成的，也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞或昆虫杆状病毒中表达。
本发明所述的在酵母细胞中表达生产体系包括酵母细胞和酵母表达载体，其中酵母细胞可以是毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞，酵母表达载体是pICZα或pYES2/CT或其它酵母表达载体；哺乳动物细胞表达生产体系包括人的CHO细胞和哺乳动物细胞外源基因表达载体；昆虫表达生产体系包括昆虫细胞和杆状病毒表达载体。
本发明治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂的制备方法，重组生产的核酸结合分子经超速离心或柱纯化后，透析后冻干，取适量多肽与α-乳糖按照1∶3-9的比例，与氰硼酸钠共溶于500-3000ml水中，37℃反应6-72小时后，用KOH溶液将反应液调至pH7.5-8.5，37℃继续反应6小时。反应液室温下用水透析终止反应去除未反应的乳糖，硫酸一葱酮法定性检测，直至透析液中乳糖含量为阴性，产物真空干燥。制备的乳糖化的肝靶向核酸结合分子溶于pH5-7的PBS溶液中与5-20∶1的比例的siRNA混合，使siRNA与融合分子形成复合物。
本发明治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂的制备方法，化学合成的分枝型核酸结合分子与α-乳糖按照1∶3-9的比例，与氰硼酸钠共溶于500-3000ml水中，37℃反应6-24小时后，用KOH溶液将反应液调至pH7.5-8.5，37℃继续反应6小时。反应液室温下用水透析终止反应去除未反应的乳糖，硫酸一葱酮法定性检测，直至透析液中乳糖含量为阴性，真空干燥，与siRNA按10∶1的比例混合，静置一定时间后，形成复合物，最终形成靶向分子/分枝型核酸结合分子/siRNA复合物。
本发明治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂的制备方法，取适量乳糖化或半乳糖化蛋白溶于二甲基亚砜(DMSO)加入TEA，在氮的保护下搅拌1分钟，PEG(PEG3400-N-hydroxy succinimide)以2-5∶1的重量比例加入，在室温下搅拌4小时，后使有机溶剂挥发完，获得乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG；乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG溶于DMSO，加入4-8倍体积的TEA，搅拌均匀，并在搅拌的条件下加入PEI，加入PEI的质量为PEG的20-40倍，搅拌条件下过夜反应。乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG-PEI和PEI按1∶1的比例混合溶于pH为8的5mM HEPES缓冲液。合成的siRNA也溶于pH为8的5mM HEPES缓冲液；两者按2∶1的比例混合，振荡混匀30秒，获得治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂。
本发明治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂能够提高肝脏的药物浓度，提高药物乙型肝炎疾病的治疗效果，并没有明显的毒副作用。治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂能够抑制HBV病毒复制和感染及对肝组织的保护作用，能够减少HBV DNA和RNA的含量，减少HBsAg及HbeAg颗粒的分泌；肝组织的病理指标评价siRNA制剂对肝有很好的保护作用。
图1分枝型核酸结合分子的结构特征。
图2siRNA、靶向分子和核酸结合分子所形成的复合物能够有效介导siRNA高效转染肝细胞。A靶向分子、核酸结合分子和荧光标记的siRNA组成的制剂转染肝细胞；B荧光标记的siRNA转染肝细胞。
图3pCI-HBV-Luc重组质粒图。
图4HBV特异的siRNA敲低HBV-Luc融合基因的表达。
具体实施例方式
通过基因重组的方法在酵母表达载体或昆虫杆状病毒表达载体或哺乳动物细胞生产直线型多肽化合物，或采用化学方法合成了直线型或分枝型的多肽化合物，这些多肽化合物富含赖氨酸、精氨酸、组氨酸和亮氨酸，赖氨酸或精氨酸为带正电荷的碱性氨基酸，可以和核酸分子有效结合，亮氨酸则有利于形成多肽空间结构的形成，组氨酸有利于siRNA等核酸分子在细胞内从复合物中释放出来，是核酸分子到达所需要作用的部位。多肽化合物通过半乳糖酰基化或乳糖酰基化使多肽具有肝细胞或肝器官靶向性。
直线型的核酸结合多肽如上所述，具有如下结构特征KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA或CCKKHHHKKHKKHGGLLALALHHLALLAHHLALAL人工合成编码KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA-NH2多肽的基因序列5’aagaaggccttattggcgttcgccttcgcccaccacctcgcgctcctcgcgctcctcgcgcaccacctcgcgctcgcgctccaccacctggcgctcgccctt’3，将序列克隆到T载体中，经测序验证正确，将编码的基因序列克隆进酵母表达载体或大肠杆菌表达载体，生产能结合核酸的直线型多肽分子。通过半乳糖酰基化或乳糖酰基化使多肽具有肝细胞或肝器官靶向性，并与siRNA分子结合。从而制备成具有肝靶向型的siRNA制剂。
也可通过人工合成的的方法合成直线型或分枝型的核酸结合分子，分枝型的核酸结合分子的序列特征见图1。通过半乳糖酰基化或乳糖酰基化使多肽具有肝细胞或肝器官靶向性，并与siRNA分子结合。从而制备成具有肝靶向型的siRNA制剂。
并设计了针对乙型肝炎病毒基因组及前RNA基因组，设计了50条siRNA，其中包括靶向顺向重复序列(DR区)、S基因区、C基因区、P基因区、X基因区的siRNA。并采用化学方法和体外转录的合成了这50条siRNA。采用本发明所制备的多肽与所设计的siRNA在室温下结合，在体外转染含有HepG2.2.15或Huh7.0肝细胞、通过静脉注射或局部组织注射或经肺的系统给药方式导入到活体的肝组织中。
本发明使用的细胞模型是HepG2.2.15细胞，携带HBV DNA包括染色体整合序列及染色体外松弛环状、共价闭合环状和不完全拷贝的HBV基因组，并产生多种HBV特异性mRNA(3.5，2.5，2.1kb)，在培养上清中也可检测到病毒DNA，HBsAg浓度可达4.2～94.3μg·L-1，免疫电镜发现22nm球形和杆状HBsAg样颗粒及42nmDane样颗粒。或使用HB611细胞株，可产生高水平HBsAg及HBeAg。或使用C2.4.10细胞株，能表达、分泌HBsAg与HbeAg，进一步鉴定发现其中C2.4.10细胞株含整合型及染色体外游离型HBV基因组，并可测到HBVDNA复制中间体及3.6kb与2.2kbRNA转录物，培养上清中也测到病毒DNA及22nm球形颗粒，后者含前S1，前S2及HBsAg成分。或使用Q7HBV-21细胞株，能产生高水平HBsAg及HBeAg的细胞克隆。
本发明使用的动物模型是HBV全长片段的转基因动物模型，具有病毒DNA复制及蛋白合成的能力，能够产生较高水平的血清HBsAg及HBeAg，分别可达1.5与2μg·L-1，血清中可测到HBV DNA。转基因小鼠肝、肾组织内可检测到HBV特异性3.5，2.1与0.8kbmRNA及单链与双链HBVDNA，肝组织内还发现存在2.4kbmRNA。每一肝细胞可测到约100～200拷贝的HBV复制中间体，与土拨鼠肝炎病毒感染期间约100～700拷贝数相当。每毫升血清可测到约107～108病毒基因组，与慢性感染人的血清浓度相当。或使用HBV部分基因片段的转基因动物模型，包括转X基因小鼠模型、转S基因小鼠模型、转C基因小鼠模型。或使用HBV感染树鼩模型，用HBV阳性患者血清静脉注射或腹腔接种96只云南产的中缅树鼩滇西亚种，实验观察137周。结果显示感染率为55％，感染树鼩血ALT明显升高；HBsAg血症者47％，平均持续7周，HBV DNA阳性率51％，持续41周以上；电镜下，血清可查见Dane颗粒及HBsAg颗粒；免疫组化法可测出肝细胞内HBsAg与HbcAg；肝细胞HBVDNA阳性率67％，并存在复制型HBV DNA。用感染树鼩的血清可连续传代感染。
荧光标记的siRNA和乳糖或半乳糖化的核酸结合多肽形成复合物，将复合物与肝细胞共培养，24小时或37小时后，使用PBS溶液洗涤细胞后，在显微镜下观察培养细胞的荧光状况，以荧光标记的siRNA为对照，从图2中可见未结合乳糖或半乳糖化的核酸结合多肽的siRNA转染细胞未能观察到荧光，使用乳糖或半乳糖化的核酸结合多肽制备的siRNA制剂转染细胞后，可观察到细胞有明显的荧光。
在成功将siRNA高效导入肝细胞后，我们设计了乙型肝炎病毒基因序列和萤火虫荧光素酶基因(Luc基因)的融合基因，并将融合基因克隆到哺乳动物表达载体pCI，够建成pCI-HBV-Luc重组质粒，该质粒转录出的mRNA含有HBV mRNA并且能够翻译出有活性的萤火虫荧光素酶，如果HBV特异的siRNA能够降解该融合基因的mRNA，就检测不到萤火虫荧光素酶。该质粒和HBV特异的siRNA通过与乳糖或半乳糖化的核酸结合多肽形成复合物，经静脉注射导入鼠体内，从图3图4中可知，HBV特异的siRNA能有效抑制肝组织中萤火虫荧光素酶的表达。
在建立了siRNA药物靶向肝器官的给药方法后，我们将进一步在体外和体内评价siRNA对乙型病毒性肝炎或肝癌的防治作用。通过实时定量RT-PCR评价siRNA分子对降低细胞内病毒基因组拷贝数的抑制作用。将siRNA的序列克隆进哺乳动物表达载体或表达框架，含siRNA序列的哺乳动物重组表达载体或表达框感染，可获得与上述类似的结果。
设计了一系列试验评价HBV特异siRNA在动物体内药效和安全性。将权力要求中的至少一条siRNA与乳糖或半乳糖化的核酸结合多肽制成siRNA体内导入制剂。配制好的siRNA在病毒攻击前后不同时间把不同剂量的siRNA制剂通过静脉或呼吸道或局部肝组织给药。在动物模型体内导入HBV特异的siRNA与乳糖或半乳糖化的核酸结合多肽制剂。在24小时、48小时、72小时以及96小时分别通过实时定量RT-PCR评价siRNA分子对降低肝组织样品中病毒基因组拷贝数的抑制作用；检测血清中HBsAg及HbeAg颗粒的含量；通过肝组织的病理指标评价siRNA分子对肝的保护作用，结果表明本发明的siRNA及制备的siRNA制剂在体内能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制与感染，并有效保护了肝组织。将这10条siRNA的序列克隆进哺乳动物表达载体或表达框架，含siRNA序列的哺乳动物重组表达载体或表达框，可获得与上述类似的结果。
在本发明所使用的siRNA制剂及其剂量范围内，尚未有毒理反应。
这类siRNA物质组成和制剂制备方法不仅适用乙型肝炎的的防治，而且适用于其他肝脏类疾病的治疗，如丙型肝炎、肝癌等。
实施例1直线型核酸结合多肽的制备。
合成以下相邻片断的末端重叠的单链的DNA序列，5’aagaaggccttattggcgttcgccttcgcc’3；5’caccacctcgcgctcctcgcgctcctcgcgcaccacctcgc’3；5’gctcgcgctccaccacctggcgctcgccctt’3溶解与适量水中，在T4DNA连接酶作用下，连接成双链DNA分子，并克隆进酵母表达载体pICZα，经酶切验证、测序验证后，采用以下程序将表达载体导入毕赤酵母细胞中。
首先，用Sacl切酵母表达载体pICZαDNA 1小时以上，使之线性化。补水至300ul，加300ul酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)颠倒混匀。离心12000rpm，5分。取上清，加750ml乙醇，30ul NaAc，-20℃，30分钟。离心，12000rpm，10分。80％乙醇清洗，吹干，溶于10ul水。
再准备对数生长期酵母菌(1挑单菌落接种于5ml YPD液体培养基30℃培养过夜。(2)取过夜培养的菌液0.1-0.5ml接种于50ml新鲜YPD液体培养基，再30℃培养至OD600＝1.3-1.5。(3)在+4℃，1500Xg离心5分钟，用50ml 0℃无菌水重悬菌体。(4)离心同上，再重悬于25ml 0℃无菌水。(5)离心同上，重悬于20ml 0℃ 1M山梨醇溶液。(6)离心同上，再重悬于1ml 0℃ 1M山梨醇溶液，置于冰上(当天使用)。
最后通过电击方法将表达载体导入酵母细胞(1)将制备的细胞80μl和5-90μg线性化DNA注入0℃电击池，混匀，置冰上5分钟。(2)据酵母脉冲参数处理细胞。(电压1500V；电容25μF；电阻400Ω；次数1次；时间8.9s)。后即加1ml 0℃ 1M山梨醇溶液到电击池内，混匀。(3)再将池内液体转置1.5ml EP管，30℃培养1-2小时。(4)取100μl菌液涂布于含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，剩余菌液全涂布于另一含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，30℃培养3-4天。
挑取酵母转化子单菌落接种于2.5mlBMGY中，置于50ml锥形瓶中，在28-30℃，250-300rpm摇瓶培养至OD600＝2-6(大约16-18个小时)，酵母细胞达到对数生长期。3000rpm，室温下，离心菌体5分钟，去上清，菌体重悬于10-20mlBMMY中，至OD600＝1。置于100ml锥形瓶中盖两层纱布，继续摇瓶培养。每隔24小时加入100％甲醇至终浓度0.5％，保持诱导。每次加甲醇之前收集一次培养物(即在培养的不同时间段24，48，72，96小时，分别取样)，每次取培养物2ml，12000rpm离心3分钟，取上清贮于-20℃，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量和分子量。采用Invitrogen公司的纯化试剂盒进行纯化，其过程如下1树脂处理(1)取2毫升亲和树脂，1000转离心1分钟，去上清液；(2)加入6毫升水混匀，1000转离心1分钟，去上清液；(3)加入6毫升Binding buffer混匀，1000转离心1分钟，去上清液；2蛋白纯化(1)8毫升左右的发酵液与树脂混合，室温放置1小时；
(2)1000转离心1分钟，去上清液；(3)加入8毫升Wash buffer混匀，1000转离心1分钟，去上清液；(4)加入2毫升Elution buffer混匀，1000转离心1分钟，收集上清液。
冷冻干燥后得到纯化的蛋白。
实施例2分枝型核酸结合多肽的制备。
分枝型多肽合成可在ABI431A固相自动肽合成仪上进行也可通过手工合成，序列结构见图1。采用标准的Fmoc方法，选用0.125mmolFmoc-MAP-Branch-PSC树脂，按照序列使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸的用量为0.5mmol，氨基酸∶树脂＝4∶1，第一个氨基酸连接到树脂上用DMAP，氨基酸的活化用HOBt和DCC偶联后用20％哌啶溶液去除Fmoc保护基团。多肽合成后按照PE公司推荐的步骤，将冰浴后合成物加入处于冰浴条件，下的10ml切割液中采用切割液B其成份为结晶苯酚0.75mg EDT0.25ml，苯甲硫醚0.5ml去离子水0.5ml TFA10ml待切割混合液温度上升至室温后，室温条件下持续搅拌反应1.5小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团.将反应混合液G4玻沙漏斗过滤以滤掉树脂，先后用1mlTFA 5 10mlDCM冲洗反应瓶、树脂和漏斗。滤液在常温下低压蒸发至1-2ml加入至少50ml预冷后的乙醚沉淀多肽，4度放置过夜，经G6玻璃漏斗过滤，真空抽干至少3小时，所得便是多肽粗产品-20℃储存备用。将MAP粗品溶解浓度为15mg/ml经0.45 m纤维滤膜过滤后explore100型中压液相色谱仪上纯化，根据其溶解特性为脂溶性采用POROS-50-R1，填充料的纯化柱，流动相为A(10％乙醇+0.1％TFA)，(90％乙醇+0.1％TFA)。洗脱梯度为100％流动相A平衡柱子1.5个柱体积；100％A-100％B10个柱体积；100％B 0.5个柱体积，上样量为2ml，在主峰处收集多肽溶液。使用树脂柱脱盐，冷冻干燥后待用。
实施例3；乳糖化或半乳糖化核酸结合多肽的制备。
取上述制备的多肽200mg，α-乳糖800mg，氰硼酸钠500mg共溶于200ml水中，37℃反应24小时后，用5mol/L KOH溶液将反应液调至pH8.5，37℃继续反应6小时。反应液室温下用水透析终止反应去除未反应的乳糖，硫酸一葱酮法定性检测，直至透析液中乳糖含量为阴性，产物真空干燥备用。
实施例4乳糖化或半乳糖化核酸结合多肽高效介导siRNA转染肝细胞。
荧光标记的siRNA与乳糖化或半乳糖化核酸结合多肽按照实施例4中所述的方法制备成复合物。在转染的前一天，4-5 104细胞接种在24孔板上，0.5mL含FBS和抗生素的细胞培养基，应能在24小时内使细胞密度达到最终密度的40-70％。在100μl的无血清的培养基中稀释靶向蛋白/核酸结合蛋白/siRNA制剂，充分混合，加入到细胞培养基中，轻轻混匀。细胞在37℃温育24h-120h后，在荧光显微镜下观察细胞的荧光状况图1。
实施例5乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制剂敲低肝组织中外源基因的表达。
设计了HBV S基因序列和萤火虫荧光素酶基因(Luc基因)的融合基因，并将融合基因克隆到哺乳动物表达载体pCI，够建成pCI-HBV-Luc重组质粒，该质粒转录出的mRNA含有HBV S基因的mRNA并且能够翻译出有活性的萤火虫荧光素酶，如果HBV S特异的siRNA能够降解该融合基因的mRNA，就检测不到萤火虫荧光素酶。按照实施例4中所述的方法制备HBV S基因特异的乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制剂，通过静脉注射导入到体内，3天后将动物安乐死，分离肝组织，提取总RNA，通过RT-PCR定量分析HBV S和Luc融合基因的表达水平。从图3、4中可知，HBV特异的siRNA能有效抑制萤火虫荧光素酶的表达。
实施例6应用转基因鼠评价siRNA抑制HBV病毒感染与复制的的药效。
(一)建立乙型病毒性肝炎的动物模型。
可使用裸鼠肝内移植瘤及腹水瘤乙型肝炎动物模型选用2月龄的BALB/c裸鼠，雌雄不拘。以6-7/ml的HepG 2.2.15细胞接种于2月龄BALB/c裸鼠，在剖腹直视下肝内和腹腔内联合注射，接种细胞数目为1.4-3.4×104/ml。接种量肝脏0.2ml-0.5ml。腹腔0.3-0.5ml，肿瘤出现后2-11周分批处死动物。具有肝移植瘤出现早，出瘤率高，实验周期短，带瘤裸鼠血清和肝肿瘤组织内有HBV标志物的高效表达。
或采用树鼩HBV感染模型。
(二)实验动物的安排尽量选择性别、年龄一致的纯种动物，对实验动物进行随机分组。实验和动物分组情况见表1。
将制备的乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制剂通过静脉注射或腹腔注射或肝脏直接注射或肌注导入到肝细胞中。
(三)乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制剂抑制HBV病毒复制和感染及对肝组织的保护作用。分别在不同时期(第1、4、7、10、14、21天)取肝组织细胞和血液样品提取RNA，进行RT-PCR检验。检测血清中HBsAg及HbeAg颗粒的含量；通过肝组织的病理指标评价siRNA分子对肝的保护作用，结果表明本发明的siRNA及制备的siRNA制剂在体内能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制与感染，并有效保护了肝组织。
HBV-siRNA.WorkFileOrganization Applicant----------------------Street广州经济技术开发区宝石路11号8楼805室City广州State广东Country中国PostalCode510730PhoneNumber(0)13302207795FaxNumber020-37617478EmailAddresschengducd@21cn.com<110>OrganizationName广州拓谱基因技术有限公司Application Project-------------------<120>Title治疗乙型病毒性肝炎的小干扰RNA制剂及其制备方法<130>AppFileReference0<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate___-__-__Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgaagaaccaa caagaagaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA1SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA1Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgaugaagagg aauaugauat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA2SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA2Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringaggacaaauu ggaggacaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA3SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA3Sequence---------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgcucaaggaa ccucuaugut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA4SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA4
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权利要求
1.一种治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂，其特征在于小干扰RNA制剂由小干扰RNA、肝细胞靶向分子和核酸结合分子组成，能将小干扰RNA高效导入肝细胞或肝组织，使乙肝病毒(HBV)病毒的反转录酶失活，使HBV的Enhancer I核心区的功能丧失，降解HBV前基因组RNA，从而达到调控HBV基因及其表达的作用；也可抑制宿主细胞上HBV病毒的受体基因及肝损伤相关基因的表达。
2.根据权利要求1所述的用于治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂，其特征在于所述的小干扰RNA可以是化学合成的21-23碱基对的双链RNA；也可以是表达载体或表达框架表达的21-23碱基对的双链RNA，所述的表达载体或表达框架为RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子。
3.根据权利要求1所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂，其特征在于所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述的靶序列是乙型肝炎病毒的RNA基因组序列，或发病宿主自身基因的序列包括人肝细胞的乙型肝炎病毒的受体去唾液酸糖蛋白或Fas基因；小干扰RNA的序列可以由序列表中至少一个序列组成。
4.根据权利要求1所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂及其制备方法，其特征在于所述的肝细胞靶向分子为乳糖或半乳糖、乳糖或半乳糖化蛋白或去唾液酸糖蛋白；可以是聚乙二醇(PEG)修饰的聚乙烯亚胺(PEI)。
5.根据权利要求1所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂及其制备方法，其特征在于所述的核酸结合分子可以是富含碱性氨基酸和两性氨基酸分子，可以是线性分子，其序列特征为KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA，CCKKHHHKKHKKHGGLLALALHHLALLAHHLALAL；也可以是分枝型的分子(序列特征见图1)；所述的核酸结合分子核酸结合分子可以是通过化学方法合成的，也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞或昆虫杆状病毒中表达。
6.根据权利要求5所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂，其特征在于所述的在酵母细胞中表达生产体系包括酵母细胞和酵母表达载体，其中酵母细胞可以是毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞，酵母表达载体是pICZα或pYES2/CT或其它酵母表达载体；哺乳动物细胞表达生产体系包括人的CHO细胞和哺乳动物细胞外源基因表达载体；昆虫表达生产体系包括昆虫细胞和杆状病毒表达载体。
7.权利要求1所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂的制备方法，其特征在于重组生产的核酸结合分子经超速离心或柱纯化后，透析后冻干，取适量多肽与α-乳糖按照1∶3-9的比例，与氰硼酸钠共溶于500-3000ml水中，37℃反应6-72小时后，用KOH溶液将反应液调至pH7.5-8.5，37℃继续反应6小时。反应液室温下用水透析终止反应去除未反应的乳糖，硫酸一葱酮法定性检测，直至透析液中乳糖含量为阴性，产物真空干燥。制备的乳糖化的肝靶向核酸结合分子溶于pH5-7的PBS溶液中与5-20∶1的比例的siRNA混合，使siRNA与融合分子形成复合物。
8.权利要求1所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂的制备方法，其特征在于化学合成的分枝型核酸结合分子与α-乳糖按照1∶3-9的比例，与氰硼酸钠共溶于500-3000ml水中，37℃反应6-24小时后，用KOH溶液将反应液调至pH7.5-8.5，37℃继续反应6小时。反应液室温下用水透析终止反应去除未反应的乳糖，硫酸一葱酮法定性检测，直至透析液中乳糖含量为阴性，真空干燥，与siRNA按10∶1的比例混合，静置一定时间后，形成复合物，最终形成靶向分子/分枝型核酸结合分子/siRNA复合物。
9.权利要求1所述的治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂的制备方法，其特征在于取适量乳糖化或半乳糖化蛋白溶于二甲基亚砜(DMSO)加入TEA，在氮的保护下搅拌1分钟，PEG(PEG3400-N-hydroxy succinimide)以2-5∶1的重量比例加入，在室温下搅拌4小时，后使有机溶剂挥发完，获得乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG；乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG溶于DMSO，加入4-8倍体积的TEA，搅拌均匀，并在搅拌的条件下加入PEI，加入PEI的质量为PEG的20-40倍，搅拌条件下过夜反应。乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG-PEI和PEI按1∶1的比例混合溶于pH为8的5mM HEPES缓冲液。合成的siRNA也溶于pH为8的5mM HEPES缓冲液；两者按2∶1的比例混合，振荡混匀30秒，获得治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗病毒性乙型肝炎的靶向小干扰RNA制剂及其制备方法，由小干扰RNA、肝细胞靶向分子和核酸结合分子组成，能将小干扰RNA高效导入肝细胞或肝组织，能够提高肝脏的药物浓度，提高药物乙型肝炎疾病的治疗效果，使乙肝病毒(HBV)病毒的反转录酶失活，使HBV的Enhancer I核心区的功能丧失，降解HBV前基因组RNA，从而达到调控HBV基因及其表达的作用；也可抑制宿主细胞上HBV病毒的受体基因及肝损伤相关基因的表达，没有明显的毒副作用。
文档编号A61P31/12GK1631442SQ20041005156
公开日2005年6月29日 申请日期2004年9月22日 优先权日2004年9月22日
发明者程度, 李宝健 申请人:广州拓谱基因技术有限公司