一种用于抗皱紧致眼部护肤品的组合物、抗皱紧致眼部护肤品及其制备方法与流程

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种用于抗皱紧致眼部护肤品的组合物、抗皱紧致眼部护肤品及其制备方法。

背景技术：

人体最外层的组织便是皮肤，而眼部又是人体最直观、最暴露，同样也是最易引起衰老的部位。怎样更有效地延缓皮肤衰老向来受到抗衰老科学界、生物学界、医学、美容以及其它相关学科领域专家学者的高度重视和关注，研发更多效果显著的皮肤抗衰老产品，成为当今社会最活跃的领域和最热门的话题。

眼睛是心灵的窗户，也最能泄露女性的年龄。随着年龄的增长，眼部肌肤的烦恼会比脸上任何一个地方都多。眼部皮肤的特点有：①眼部皮肤厚度为0.6～4.0mm，是面部皮肤厚度的1/3～1/5；②每天眨眼时肌肤受到不断的拉伸；③眼部周围只有皮脂腺和变态汗腺，故水脂膜对眼部皮肤保护作用小；④眼部皮肤脂肪含量少，缺乏弹性纤维和胶原结构，故眼部皮肤容易失去弹性，甚至出现提前衰老现象；⑤眼部周围的神经纤维及毛细血管分布密度高，血液循环不畅导致眼部暗淡、疲劳。生活作息不规律、用眼不当等容易造成眼部皮肤暗淡、皮肤松弛等现象，就会出现黑眼圈、眼袋、鱼尾纹、脂肪粒等问题。所以无论年纪大小，女性都不能忽视眼部肌肤的保养和护理。现代生活的紧张节奏，使得眼部肌肤开始衰老的年龄有逐渐提前的趋势。每一种不同的肤质都有不同的状况。眼霜主要针对干性皮肤者，因为眼部通常是皮肤干燥的"重灾区"，即使已经使用了保湿滋润的面霜，但是对于眼部肌肤来说往往效果不大，如果不用眼霜来加以重点照顾，很容易出现黑眼圈、眼袋、鱼尾纹及松弛现象。

眼部肌肤是人体皮肤中最薄的部位，又是活动最频繁的部位，同时还是化妆中拉扯次数最多的地方，非常容易长出皱纹。眼霜除应具有对抗黑眼圈、干燥、眼袋的问题外，更应具备改善皱纹、细纹，紧致眼周肌肤的功效。而改善皱纹最根本的途径就是抗氧化、抗糖化、防止胶原蛋白断裂。

皮肤衰老是由内源性因素(自然衰老)和外源性因素共同作用的结果。内源性因素主要有：

(1)基因因素。由于基因遗传产生的染色体调聚反应顺序将随年龄而发生改变；(2)自由基说。该学说认为在机体代谢过程中产生的具有高度化学活性的自由基是衰老的重要启动因素，对组织细胞的损伤反应缓慢、反复、渐进地进行，逐渐出现生理性衰老；(3)神经内分泌功能减退学说。该学说认为随着年龄增加，激素的分泌异常，机体靶组织对某些激素或活性物质的反应明显降低，可造成机体内稳态严重破坏，导致衰老；(4)其他学说，主要包括交联学说、体细胞突变学说、蛋白质合成差误成灾说、环境中毒学说以及免疫功能下降学说等，从不同水平和角度对衰老机理做了种种推测。外源性因素主要有：环境压力，包括空气污染、光谱辐射以及日常压力；环境压力导致胶原蛋白流失、皮肤弹性下降，皮肤屏障受损、氧化，皮肤敏感度增加，肤色异常，皮肤变得暗沉长斑。

目前公认的抗衰老的解决方法主要有：(1)增强细胞的增殖、代谢能力。衰老的实质是组织细胞功能的衰退。因此，促进细胞的活性即增殖代谢能力，从而延缓皮肤的衰老是关键的根本对策。(2)增强保湿。人的皮肤有天然的保湿系统，由水-天然保湿因子(nmf)-脂类3种物质组成。皮肤老化时水分丢失增多，从而导致细胞皱缩、老化，组织萎缩，出现组织学结构和形态学改变而使皮肤逐渐出现细小皱纹。保湿剂对保持皮肤水分和修复皮肤屏障功能有重要作用，一旦皮肤表皮、真皮水分大量丢失，就会造成表皮细胞层变薄，真皮内胶原纤维减少，排列紊乱，皮肤缺少水的滋润，皮肤干燥、萎瘪，导致皮肤老化、缺乏弹性、出现皱纹，进而皮肤灰暗、色素沉着和发生各种老年疣。保湿就是修复表皮屏障功能，增加表皮的含水量，确切地说主要还是增加角质细胞的含水量。保湿化妆品具有抗炎作用，抗细胞分裂作用和止痒作用，增强保湿也是皮肤延缓衰老的重要对策之一。(3)抗紫外线辐射。促进皮肤衰老的众多外界因素中，紫外线引起的光性老化已被证明是最为主要的因素。因此，防晒是延缓衰老的重要的措施。(4)抗自由基。指对抗离子和低能辐射产生的活性氧自由基对皮肤脂质、蛋白质、生物膜的损害作用。目前，对抗和消除自由基、防止自由基的损伤作用，往往通过抗氧化剂得以实现。(5)抗糖化。皮肤的糖化反应是指皮肤因为新陈代谢过慢，导致多余的糖分整日在血液中游离，过多的糖分会附着在胶原蛋白上，使胶原蛋白断裂或紊乱，肌肤便会出现皱纹、粗糙。对此可在产品中添加能够减缓皮肤糖化的有效活性成分。(6)抗交联。真皮中胶原或弹性纤维的交联，是造成皮肤皱缩和弹性下降等衰老表现的重要原因之一。许多金属离子是一种交联剂，因此使用柠檬酸盐、酒石酸钠、edta(乙二胺四乙酸)等，通过对金属离子的络合而抑制交联反应。(7)抗降解。是指对抗各种水解酶对皮肤细胞外基质的降解作用。如对抗胶原酶、弹性蛋白酶和透明质酸酶等分别对胶原、弹性蛋白和透明质酸的降解，降解造成的后果是使皮肤结构破坏和衰老加速，尤其是弹性蛋白受其弹性蛋白酶降解，会令皮肤失去弹性、松弛、出现皱纹。因此，通过在化妆品中加入该酶的抑制剂，可以防止弹性蛋白酶降解，保持皮肤的弹性，预防皱纹的形成。(8)抗过敏炎症。环境污染引起的皮肤损害很普遍，污染空气中的有害尘埃沉积在皮肤上，表现往往是皮肤过敏炎症反应，但又不像阳光辐射造成的皮肤灼伤和红斑易被觉察。因此，抗过敏炎症亦是延缓皮肤衰老的重要对策之一。

目前眼部护理产品功效性有一定局限，一些眼部衰老问题依旧无法解决；眼部抗衰老护理需求年龄提前，25岁以下人群也开始关注眼部护理；现售一些眼部产品使用后效果不佳，且会伴随脂肪粒产生。

眼部产品的开发除了注重高安全性、低刺激性外，更要注重功效，要能真正解决眼部衰老肌肤问题，添加天然植物草本成分成为趋势。现代日化产业发展的趋势，逐步体现出天人合一、返璞归真的自然特点，利用各种中草药和植物资源制作的化妆品，具有温和的疗效性或营养性。但是目前保湿、抗氧化、抗糖化、祛皱、祛眼袋、淡化黑眼圈等综合功效较好的天然植物眼部护理产品较少。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，针对可以有效延缓衰老的举措，从不同角度挑选功效原料，根据协同增效原理将多种具有保湿、抗氧化、抗糖化、祛皱等功效的活性成分进行科学配伍，提供一种用于抗皱紧致眼部护肤品的组合物，眼部护肤品及其制备方法，方案具体如下：

一种用于抗皱紧致眼部护肤品的组合物，其特征在于，包含如下重量份配比的原料：桦褐孔菌提取物4.0-8.0份，三乙醇胺0.18-0.22份；

优选所述桦褐孔菌提取物为桦褐孔菌醇提液，以原药材用量计，每升提取液含100g原药材。

优选地，还包含透明质酸钠0.08-0.12重量份、泛醇0.4-0.6重量份、维生素c乙基醚0.4-0.6份、维生素e醋酸酯0.4-0.6份、烟酰胺0.4-0.6份。

优选地，还包含聚多糖紧肤剂4.5-5.5份。

优选地，还包含可可提取物1.5-2.5份；

优选所述可可提取物为质量百分含量为3.3％的可可提取物水溶液。

优选地，还包含眼丝氨肽4.5-5.5份；

优选所述眼丝氨肽为质量百分含量为0.1％的眼丝氨肽溶液。

优选地，还包含pcg0.9-1.1重量份。

本发明还提供上述用于抗皱紧致眼部护肤品的组合物在制备眼部护肤品中的应用；

在所述护肤产品中上述组合物的重量百分比为4.18-26.5％。

一种抗皱紧致的眼部护肤品，其特征在于，包含前述的组合物，以及a相原料、b相原料、d相原料；其中

所述眼部护肤品中，所述组合物的重量百分比为17.26-26.5％；优选21.3％。

所述组合物中的原料用于组成c相原料和f相原料，或用于组成c相原料、e相原料和f相原料；在所述眼部护肤品中：

所述a相原料的重量百分比为13-17％，含有聚二甲基硅氧烷、辛酸/癸酸甘油三酯、氢化聚异丁烯、乳化剂、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；优选所述乳化剂为甘油硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇、硬脂酰乳酰乳酸钠的复配物；

所述b相原料的重量百分比为7-11％，包含甘油、甜菜碱、卡波姆2020、乙二胺四乙酸二钠、丙二醇；

所述c相原料的重量百分比为4.18-8.22％，含有桦褐孔菌提取物和三乙醇胺；

所述d相原料的重量百分比为4.3-5.7％，包含聚二甲基硅氧烷及c16-18烷基聚二甲基硅氧烷交联聚合物、环五聚二甲基硅氧烷；

所述e相原料的重量百分比为1.68-2.52％，含有透明质酸钠、泛醇、维生素c乙基醚、维生素e醋酸酯、烟酰胺；

所述f相原料的重量百分比为11.4-14.6％，含有聚多糖紧肤剂、可可提取物、眼丝氨肽、pcg；

余量为水。

优选地，所述a相原料中含聚二甲基硅氧烷3.0-4.0重量份、辛酸/癸酸甘油三酯1.8-2.2重量份、氢化聚异丁烯4.0-5.0重量份、乳化剂4.5-5.5重量份、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.015-0.025重量份；

所述b相原料中含有甘油4-6重量份、甜菜碱0.8-1.2重量份、卡波姆20200.18-0.22重量份、乙二胺四乙酸二钠0.04-0.06重量份、丙二醇2.5-3.5重量份；

所述d相原料中含有聚二甲基硅氧烷及c16-18烷基聚二甲基硅氧烷交联聚合物1.8-2.2重量份、环五聚二甲基硅氧烷2.5-3.5重量份。

本发明还提供一种上述的眼部护肤品的制备方法，其特征在于，所述眼部护肤品由a相原料、b相原料、c相原料、d相原料、f相原料制成；包括如下步骤：

(1)将a相各组分置于75-80℃水浴锅中搅拌25-30min，使固状物溶解，得到混合料a；将b相中的卡波姆2020在水中预先分散均匀后再加入b相其它原料，然后置于75-80℃水浴锅中搅拌25-30min，使固状物溶解，得到混合料b；将d、f相各原料混合搅拌均匀分别得到混合料d、f；

(2)将所述用于抗皱紧致多效护肤产品的组合物的原料桦褐孔菌提取物和三乙醇胺混合得混合料c；

(3)将混合料b、c、d加到混合料a中，在75-80℃下快速搅拌乳化25-30min，随后开始减速降温，降温至40-45℃时加入混合料f，搅拌均匀，继续降温至30-35℃时停止搅拌，出料，即得。

本发明还提供另一种上述的抗皱紧致眼部护肤品的制备方法，其特征在于，所述眼部护肤品由a相原料、b相原料、c相原料、d相原料、e相原料、f相原料制成，包括如下步骤：

(1)将a相各组分置于75-80℃水浴锅中搅拌25-30min，使固状物溶解，得到混合料a；将b相中的卡波姆2020在水中预先分散均匀后再加入b相其它原料，然后置于75-80℃水浴锅中搅拌25-30min，使固状物溶解，得到混合料b；将d、e、f相各原料混合搅拌均匀分别得到混合料d、e、f；

(2)将所述用于抗皱紧致多效护肤产品的组合物的原料桦褐孔菌提取物和三乙醇胺混合得混合料c；

(3)将混合料b、c、d加到混合料a中，在75-80℃下快速搅拌乳化25-30min，随后开始减速降温，降温至40-45℃时加入混合料e、f，搅拌均匀，继续降温至30-35℃时停止搅拌，出料，即得。

本发明产品为水包油型乳化体系，采用温和的biobases乳化剂(甘油硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇和硬脂酰乳酰乳酸钠)，该乳化剂中甘油硬脂酸脂50-70％、鲸蜡硬脂醇20-30％、硬脂酰乳酰乳酸钠5-15％，所含成分与皮肤相似，硬脂酰乳酰乳酸钠在化学上是模仿皮肤中高hlb的溶胀剂，如胆固醇硫酸盐和磷脂，而鲸蜡硬脂醇和甘油硬脂酸酯模仿疏水的游离脂肪酸、胆固醇和神经酰胺。由于以适当的比例结合，有重建皮肤角质层功能，提高皮肤的保湿性、抗水性，可赋予产品极佳的使用感觉。biobases乳化剂极为有效，易于配方，仅用2％至5％的用量就可以配制出在45℃稳定的产品，且温和，无刺激。biobases具有高的液晶相转化温度，可以生产出高稳定性的乳液和膏霜，乳化体系形成一种多层的液晶结构，脂质双分子层类似于皮肤脂质膜。

本发明产品以产自双鸭山的桦褐孔菌醇提液作为功效成分，增强产品的抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、抗糖化功效，复配聚多糖紧肤剂、眼丝氨肽、可可提取物、泛醇、烟酰胺、维生素c乙基醚、维生素e醋酸酯、透明质酸钠等功效成分，以提升产品的保湿、抗皱、紧致、淡化黑眼圈、祛眼袋的功效。

桦褐孔菌又称桦树茸、白桦茸，是一种生长在白桦树上的食药两用型真菌。桦褐孔菌在俄罗斯民间作为治疗疾病的药用真菌，无任何毒副作用，可以显著降低血清和肝中胆固醇和血脂的含量，抑制血小板聚集、软化血管，增进血液的携氧量，调节荷尔蒙正常分泌、提高内源性雌激素分泌、改善睡眠、润肠通便、分解脂肪、降低胆固醇储量、缓解焦虑、抑郁。桦褐孔菌还可以有效地清除体内的自由基，保护细胞，延长传代细胞的分裂代数，增进细胞寿命，促进代谢，因而能有效地延缓衰老。本发明产品中选择加入产自双鸭山的桦褐孔菌醇提液，是通过实验测试从三种不同产地的桦褐孔菌中筛选出来的，该桦褐孔菌醇提液色泽浅淡，对dpph·自由基和酪氨酸酶有非常好的抑制作用，对非酶糖基化早期糖化产物和高级糖化终末产物都有较好的抑制作用。

聚多糖紧肤剂含有糖膜保护剂可以有效阻隔污染物和uv对皮肤的损伤，其含有的α-葡聚糖寡糖可以促进有益菌的生长，抑制有害菌的生长。聚多糖混合物能够获得最佳的紧肤效果而不会产生任何的黏腻感，具有瞬时平滑肌肤的效果和可感知的紧实效果，可抑制眼部松弛让眼部肌肤塑型紧致。

可可提取物富含咖啡因、烟酸、可可多酚、类黄酮、花青素、微量元素锌、镁等，其中咖啡因具有收缩小血管，减少炎症的能力，加入在眼霜中，可以通过促进皮肤组织的血液循环，来消除疲惫眼睛下的浮肿。

眼丝氨肽能够抑制糖化作用、消除水肿，祛除眼袋和黑眼圈，提高皮肤弹性和光滑度。

泛醇在皮肤上的护理作用表现为深入渗透的保湿剂，刺激上皮细胞的生长，促进伤口愈合，起消炎作用；烟酰胺(维生素b3)能有效抑制黑色素细胞的生成，美白肌肤。透明质酸钠被称为最理想的保湿剂，它可以持久保湿，使皮肤柔嫩、光滑；此外，透明质酸还可促进其他活性成分和营养物质的吸收，改善皮肤的营养代谢，为真皮胶原蛋白和弹性纤维的合成提供良好的环境，减轻老化皱纹痕迹，防止衰老。

维生素c乙基醚在化妆品中有卓越的抗氧化效果，抑制黑色素的形成，并还原黑色素，既确保维生素c的利用度，又非常稳定。进入真皮层后直接参与胶原蛋白的合成，修复皮肤细胞活性，从而使皮肤变得充盈富有弹性，使肌肤细腻光滑。

维生素e对皮肤起滋润作用，并可保持皮肤水份，对刀伤、烫伤、粉刺、老年斑、冻疮、皮肤干燥及紫外线损伤的保护，减少脂质过氧化反应和光滑皮肤等方面均有很好的效果。

本发明的有益效果是：采用传统中草药，运用中医的辨证思维方法，按照传统中医药理论进行创造性的组方遣药，以桦褐孔菌醇提液作为功效成分，增强产品的抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、抗糖化功效，复配聚多糖紧肤剂、眼丝氨肽、可可提取物、泛醇、烟酰胺、维生素c乙基醚、维生素e醋酸酯、透明质酸钠等功效成分，显著地提升产品的保湿、抗皱、紧致功效，尤其适合用于眼部护肤，同时具备优良的淡化黑眼圈、祛眼袋的功效。

附图说明

图1是两名女性志愿者使用本发明产品ys7一个月前后采用面部图像分析仪visiacr拍摄的眼部照片，其中，(a1)、(a2)为45岁的志愿者右眼使用前、使用后，(a3)、(a4)为该志愿者左眼使用前、使用后；(b1)、(b2)为39岁的志愿者右眼使用前、使用后，(b3)、(b4)为该志愿者左眼使用前、使用后。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实验原料来源：

a相中的biobases乳化剂是由甘油硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇和硬脂酰乳酰乳酸钠中各组分按质量百分比构成如下：甘油硬脂酸脂50-70％，鲸蜡硬脂醇20-30％，硬脂酰乳酰乳酸钠5-15％；生产厂家为科莱恩化工(中国)有限公司，货号317059。

a相中的氢化聚异丁烯(cas#:68937-10-0)，生产厂家为日本油脂株式会社；聚二甲基硅氧烷(cas#:63148-62-9)，生产厂家为陶氏化学(张家港)投资有限公司；辛酸/癸酸甘油三酯(cas#:73398-61-5)，生产厂家为法国迪博公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(cas#:128-37-0)。

b相中的甜菜碱(cas#:107-43-7)，生产厂家为杜邦(中国)集团有限公司；卡波姆2020(cas#:176429-87-1)，生产厂家为路博润(美国)公司；甘油cas#:56-81-5；乙二胺四乙酸二钠cas#:139-33-3；丙二醇cas#:57-55-6；c相中的三乙醇胺cas#:102-71-6。

桦褐孔菌醇提液是通过包括如下步骤的方法制备获得：

称取10g的桦褐孔菌干燥粉末装入无纺布滤袋，置于脂肪提取器中，加入95ml95vt％乙醇水溶液，在95℃以上水浴加热索氏提取3h，提取液冷却至室温后定容至100ml容量瓶中，即制得原药材含量为100g/l的桦褐孔菌醇提液。桦褐孔菌，产地黑龙江省双鸭山市。

d相中的环五聚二甲基硅氧烷(cas#:541-02-6)，生产厂家为韩国kcc集团；聚二甲基硅氧烷及c16-18烷基聚二甲基硅氧烷交联聚合物，商品名：velvesil*dmsilicone(cas#:756876-51-4)，生产厂家为momentiveperformancematerialsjapanllc。

e相中的透明质酸钠(cas#:9067-32-7)，泛醇(cas#:81-13-0)，维生素c乙基醚(cas#:86404-04-8)，维生素e醋酸酯(cas#:7695-91-2)，烟酰胺(cas#:98-92-0)，均购自北京贝丽莱斯生物科技股份有限公司。

f相中的聚多糖紧肤剂按质量百分比由如下组分构成：生物糖胶-445％-70％，1,3丙二醇5％-15％，α-葡聚糖寡糖5％-15％，藻酸钠1-2％，苯氧乙醇1.5％；购自法国素莱碧雅公司，货号300-glyclf1。

f相中的可可提取物(cas#:84649-99-0)是活性物质量浓度为3.3％的水溶液，购自法国素莱碧雅公司。

f相中的眼丝氨肽购自南京斯拜科生化实业有限公司，cas#:820959-17-9，其质量浓度为0.1％。

f相中的pcg为1,2-辛二醇和2-苯氧基乙醇的混合物，购自南京斯拜科生化实业有限公司，货号:150003。

一、制备产品

按照如下步骤制备表1中的护肤品：

步骤1：将a相各组分置于75-80℃水浴锅中搅拌25-30min，使固状物溶解，得到混合料a；将b相中的卡波姆2020在水中预先分散均匀后再加入b相其它原料，然后置于75-80℃水浴锅中搅拌25-30min，使固状物溶解，得到混合料b；将c、d、e、f相各原料混合搅拌均匀分别得到混合料c、d、e、f；

步骤2：将混合料b、c、d加到混合料a中，在75-80℃下快速搅拌乳化25-30min，随后开始减速降温，降温至40-45℃时加入混合料e、f，搅拌均匀，继续降温至30-35℃时停止搅拌，出料，即得抗皱紧致眼霜。

在制备过程中为使制成品总量保持为100g，在加入各个相的同时再加入适量的蒸馏水。

按照以上步骤制备了表1中ys1至ys7的7个实验样品，具体组分和配比如表1：

表1

二、产品性能测试

1感官性能评定

取少量样品放置在室温和非阳光直射下目测观察膏体是否细腻，色泽是否均匀一致，用嗅觉鉴别气味是否纯正。

2酸碱度(ph)测试

称取样品各3g，用30ml蒸馏水在40±1℃下分散均匀。用校正好的ph计室温测定其水溶液的ph值。

3稳定性测试

分别将样品置于-10℃的冰箱冷冻室和40℃的恒温烘箱中，24h取出，恢复室温后观察是否出现油水分离现象。

4体外功效测试

4.1对dpph·清除率测试

桦褐孔菌醇提液分别逐级稀释至10.0、5.0、3.0、1.0、0.5、0.25g/l作为待测液。

称取ys1至ys7及对照品z1(市售某中国品牌抗衰老眼霜)、z2(市售某知名欧洲品牌抗衰老眼霜)各0.5g，用蒸馏水分散后分别定容至10ml容量瓶中得各待测液。

配置浓度为0.2mmol/l的dpph·乙醇溶液，配置a0试管：将2mldpph·乙醇溶液和2ml溶剂加入同一试管，配置ai试管：将2mldpph·乙醇溶液和2ml待测液加入同一试管，配置aj试管：将2ml无水乙醇和2ml溶剂加入同一试管。分别摇匀后，室温下置于阴暗处30min后测定其在517nm处的吸光度，按式(1)计算dpph·清除率p:

p＝[1－(ai－aj)/a0]×100％(1)

4.2酪氨酸酶抑制率实验

桦褐孔菌醇提液分别逐级稀释至10.0、5.0、2.5、1.0、0.75、0.5g/l作为待测液。

称取ys1至ys7及对照品z1、z2各0.5g，用蒸馏水分散后分别定容至10ml容量瓶中得各待测液。

分别配制ph＝6.8的磷酸盐缓冲液(pbs)，1g/l的l-酪氨酸溶液，0.07g/l的酪氨酸酶溶液。取四支试管，分别标记为a、b、c、d，其中a加入0.5ml的l-酪氨酸溶液和2ml的缓冲液以及2.0ml酪氨酸酶溶液，b中加入2.5ml缓冲液和2.0ml-酪氨酸酶溶液；c中加入1.5ml缓冲液和0.5ml待测液以及0.5mll-酪氨酸溶液和2.0ml酪氨酸酶溶液；d中加入:2.0ml缓冲液和0.5ml待测液以及2.0ml酪氨酸酶溶液。分别摇匀各试管后将其置于37℃水浴中保温30min后立即于475nm处测其吸光度(a)。按式(2)计算酪氨酸酶抑制率i1:

i1＝[1－(c－d)/(a－b)]×100％(2)

式(2)中a、b、c、d为测试样在475nm处的吸光度值。

4.3非酶糖基化测试

桦褐孔菌醇提液分别逐级稀释至10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25g/l作为待测液。

称取ys1至ys7及对照品z1、z2各0.5g，用蒸馏水分散后分别定容至10ml容量瓶中得各待测液。

对蛋白质非酶糖化抑制作用的测定

配置缓冲液含有8mmol/ledta、100u/ml青霉素和100mg/l链霉素的0.1mol/l的pbs缓冲液(ph＝7.4)，并进行灭菌。在无菌操作台中，配置20g/l的牛血清白蛋白和400mmol/l葡萄糖溶液。取五支试管，分别标记为f1、f2、f3、f4、f5。f1中添加5ml牛血清蛋白和2ml葡萄糖，f2中添加5ml牛血清蛋白，f3中2ml葡萄糖和1ml待测样，f4中添加5ml牛血清蛋白和1ml待测样，f5中添加5ml牛血清蛋白和2ml葡萄糖以及1ml待测样，上述体系分别用缓冲液定容到10ml。

对早期糖化产物(amadori)抑制率的测定

上述反应体系在避光的条件下孵育20天，然后取出进行amadori产物抑制作用的测试。首先，每种反应液取200μl后置于具塞试管中，再加入8ml0.1g/lnbt溶液(0.1mol/l、ph＝10.8的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液配置)，两者充分混合后置于37℃恒温干燥箱中反应，15min后取出，再加入0.4ml15％乙酸并用冷水浴终止反应，约30min后用紫外-可见分光光度计测试各反应液在530nm处的吸光度a。根据下列公式计算出对amadori产物的抑制率i2。

i2＝[1-(a药5-a对3-a对4)/(a对1-a对2)]×100％(3)

对高级糖化终末产物(ages产物)抑制作用的测定：

在反应体系避光孵育40天后，用荧光分光光度计测试其高级糖化终末产物抑制作用。在激发波长为370nm、发射波长为440nm、狭缝在5nm条件下测定各组反应液的荧光强度f。根据下列公式计算出对ages产物的抑制率i3。

i3＝[1-(f药5-f对3-f对4)/(f对1-f对2)]×100％(4)

5人体测试

5.1测试人员的选择

根据产品测试需求，实验研究对象为30名35～60岁健康女性(妊娠哺乳期除外)。实验前一个月内未参加其他临床实验；且无活性过敏史；无炎症等皮肤病未愈者。且根据实验需求选取眼部皮肤有明显细纹及色斑等衰老现象者。

5.2测试安排

测试方案如下：

1.测试者清洁后，取适量样品轻柔涂抹于眼部，在房间内静坐至少15min。

2.使用皮肤弹性测定仪cutometerdualmpa580检测每次使用前后眼部皮肤的弹性指标r2，测量3次取平均值。r2值是指无负压时皮肤的回弹量与有负压时的最大拉伸量之比。r2值越接近1，说明皮肤弹性越好。

3.使用皮肤光泽度测定探头probeskin-glossymetergl200检测每次使用前后眼部皮肤光泽度，测量3次取平均值。光泽度值越高，说明皮肤光泽度越好。

4.使用皮肤水分测定探头probecorneometercm825检测每次使用前后眼部皮肤的水分，测量10次取平均值。

5.使用visiacr面部分析仪，记录志愿者使用前后左、右眼照片，分析比较使用前后眼部的色泽、毛孔、皱纹平滑度、眼袋等。

三、性能测试结果

1.桦褐孔菌醇提液的测试结果

表2桦褐孔菌醇提液(ioe)对dpph·自由基的清除率(p)及ic50值

dpph·自由基的乙醇溶液呈深紫红色，在517nm处有最大吸收，吸光度与其浓度呈线性关系。当向其中加入抗氧化剂时，抗氧化剂可结合dpph·自由基的孤对电子，被还原成黄色的dpph-h分子而褪色，褪色程度与所接受的电子数量有定量关系。因此可以根据吸光度的变化来评价抗氧化剂清除dpph·自由基的能力。表2列出了产地为双鸭山的桦褐孔菌醇提液和阳性对照维生素c(vc)对dpph·自由基的清除率p及半抑制率浓度ic50值。从表中数据可以看出，其ic50值为0.28g/l；原药材含量为3g/l时，其p值已超过90％。说明该醇提液对dpph·自由基具有较好的清除作用。

酪氨酸酶是黑色素合成中的限速酶。酪氨酸酶在ph为6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化为多巴醌，然后经过一系列的反应生成黑色素，其生成量与酶的活力成正比。黑色素物质在475nm处有最大吸收。添加具有抑制酪氨酸酶作用的原料可以减少多巴转化为多巴醌，从而降低吸光度。因此可以根据吸光度变化程度来检测体系中酶的活力大小。表3列出了产地为双鸭山的桦褐孔菌醇提液和阳性对照(vc)对酪氨酸酶的抑制率i1及半抑制率浓度ic50值。从表中数据可以看出，其ic50为0.73g/l；含量为5g/l时，其抑制率i1已达90％。说明该醇提液对酪氨酸酶具有较好的抑制作用。

表3桦褐孔菌醇提液(ioe)对酪氨酸酶的抑制率(i1)及ic50值

表4桦褐孔菌醇提液(ioe)对amadori产物的抑制率(i2)

表5桦褐孔菌提取液(ioe)对ages产物的抑制率(i3)及ic50值

在无酶催化条件下，蛋白质和葡萄糖在体内发生反应形成schiff碱和amadori产物等早期糖化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化的高级糖化终末产物ages。ages进一步与体内组织中蛋白、核酸、脂类等生物大分子发生交联且不可逆转，最终导致其功能受损。当ages结合人体皮肤中的胶原蛋白或弹力蛋白，将会导致皮肤松弛，失去弹性等老化现象。而采用体外非酶糖化反应，通过测定样品对amadori产物和ages产物的抑制率，可以评价活性成分的抗糖化功效。桦褐孔菌醇提液及阳性对照硫酸氨基胍对amadori产物抑制率i2和ages产物的抑制率i3见表4、表5。由表中的数据可知：桦褐孔菌醇提液在5g/l时，对amadori产物抑制率i2为22.6％；对ages产物的抑制率i3为83.9％、ic50为0.51g/l。说明桦褐孔菌醇提液对非酶糖化的早期产物具有一定的抑制作用，对高级糖化终末产物具有较好的抑制作用。

2.发明产品测试结果

本发明产品ys7膏体均匀、细腻，性质稳定；为淡褐色；略有中草药气味；ph为6.71；在-10℃、40℃放置24h恢复室温后无油水分离现象；符合我国润肤膏霜行业标准qb/t1857-2013要求。

3.功效评价

表6列出了7种抗衰老眼霜和对照品z1、z2体外功效测试结果。功效测试包括对dpph·自由基清除率p、酪氨酸酶抑制率i1、对非酶糖基化反应的amadori产物抑制率i2和ages产物的抑制率i3。

表6七种抗衰老眼霜及对照品功效测试结果

七种抗衰老眼霜ys1至ys7对dpph·自由基清除率p和酪氨酸酶抑制率i1测试结果见表6。为了比较各活性成分对发明产品的贡献，分别将各活性成分单独加入ys1基质配方中并与ys7(加入9种功效成分)进行比较，表中ys2在ys1基质配方基础上只添加聚多糖紧肤剂，ys2对dpph·自由基的清除率和酪氨酸酶抑制率分别增加了10.5％、4.5％，说明只添加聚多糖紧肤剂有一定的抗氧化作用，也可以抑制酪氨酸酶活性；ys3在ys1基础上单独添加可可提取物，p值由5.6％增至29.0％，i1值由5.3％增至12.0％，分别增加了23.4％，6.7％，可见只加入可可提取物有较好的抗氧化作用，以及抑制酪氨酸酶的活性；ys4在ys1基础上只添加眼丝氨肽，其对dpph·自由基的清除率和酪氨酸酶抑制率分别增加了14.1％、8.1％，较ys2略有提高；ys5与ys1比较p值增加了34.6％，i1值增加了14.5％，可见单独加入桦褐孔菌醇提液可明显提升产品对dpph·的清除率，也增大对酪氨酸酶活性的抑制；ys6的p值、i1值分别增加了34.7％、10.3％，其对dpph·的清除率与ys5相当，说明只加入维生素类功效成分抗氧化作用与加入桦褐孔菌醇提液相当，同时也可以抑制酪氨酸酶活性；ys7在ys1基础上添加了9种功效成分，对dpph·自由基的清除率和酪氨酸酶抑制率分别增加了82.2％、46.7％，可见ys7产品与ys1-ys6比较有明显的抗氧化作用和抑制酪氨酸酶活性。对照品z1的p、i1值分别为7.6％、7.6％，介于ys1和ys2之间，z2的p值为19.0％，接近于ys4，i1值为11.2％，接近于ys3。

七种抗衰老眼霜ys1至ys7及对照品z1、z2对非酶糖化反应amadori产物抑制率i2和ages产物抑制率i3结果仍见表6。从表中看出ys2至ys7产品对amadori产物和ages产物的均有抑制作用，而添加了9种功效成分的ys7号样品的抑制效果最好。通过数据发现，ys5在ys1基质配方基础上只添加桦褐孔菌醇提液对amadori产物和ages产物抑制率分别增加了32.7％、35.1％，相比ys1-ys4、ys6具有更好的抗糖化作用；对照组z1的i2为19.4％，与ys2接近；i3为35.0％，介于ys6和ys3之间；z2的i2为15.0％，与ys4接近，i3为30.5％，介于ys4和ys6之间。

由表中可见：发明产品ys7对dpph·清除率为87.8％，对酪氨酸酶抑制率为52.0％，对非酶糖基化反应的amadori产物和ages产物的抑制率分别为46.1％及86.7％，所测多项指标均远高于对照样品。

由表中可见，加入提拉、紧致、祛眼袋等成分也可适当增强产品的抗氧化、美白、抗糖化功效。

4人体测试结果

4.1皮肤测试仪测试结果

30名志愿者使用ys7多效抗衰老眼霜1个月前后眼周皮肤的弹性、光亮度、水分含量数值变化的平均值列于表7。从表中数据可以看出，使用产品后，皮肤弹性、光泽度、水分含量的评分均值都有一定增长。其中弹性数值r2增加了0.118，肤色光泽度增加了0.74，水分含量增加了8.3％。说明使用多效抗衰老眼霜可在短期内改善眼部暗沉、增加皮肤含水量及皮肤弹性。

表7皮肤弹性、光泽度、水分含量数值变化

4.2志愿者眼部皱纹改善情况

图1为45岁干性肤质、39岁中性皮肤的两名女性志愿者左、右眼使用ys7多效抗衰老眼霜一个月前后采用面部图像分析仪visiacr拍摄的眼部照片。对比使用产品前后眼部状况可以看出，使用1个月后，志愿者眼部细纹基本消失，深层皱纹也有明显淡化现象，眼袋明显减小、黑眼圈淡化，眼周皮肤变得光泽、细腻、有弹性。