本发明涉及植物发酵领域，尤其是一种蔬莓果发酵物的制备方法及其用途。
背景技术：
：：自由基(freeradical)泛指外围轨域包含不成对电子的反应物，常见于活性氧类(reactiveoxygenspecies,ros)、活性氮类(reactivenitrogenspecies,rns)等物质中；其中，ros是指具有高反应性的含氧物质，包含过氧化物(peroxide)、超氧化物(superoxide)、氢氧自由基(hydroxylradical)及单重态氧(singletoxygen)等。在人体中，自由基的产生多源自于粒线体，当粒线体进行有氧呼吸时，少部分由粒线体内层膜的电子传递链逃脱的电子，会与氧气反应形成超氧化物、过氧化物等自由基。自由基在人体中参与许多生理机制，包括受精、成熟、细胞素的产生、排除有毒物质等，且在对抗细菌、病毒入侵及抵抗癌症上扮演重要角色；然而相反的，过多的自由基会对个体产生氧化压力，且已知自由基与许多疾病的发生相关，其会影响身体的正常功能，可能导致身体的老化及死亡。且随着生活习惯改变，现代人体内容易产生过多的自由基，对健康造成莫大的威胁。天然蔬菜水果中含有许多的抗氧化物，然而要实际达到人体抗氧化的功效，必须摄食大量的蔬果，且经过烹调及消化的过程，其中的抗氧化物质往往大量的流失，导致其抗氧化的功效大打折扣；因此，研发一种能提高蔬果中抗氧化物质含量，并提升其抗氧化活性的方法，着实有其必要性。技术实现要素：缘此，本发明的一目的在提供一种蔬莓果发酵物的制备方法，包含将一蔬果汁及一莓果汁的混合物以一三段式萃取的制程得出该蔬莓果发酵物；其中该三段式萃取包含一第一段水相萃取步骤、一第二段醇相萃取步骤、及一第三段有机酸相萃取步骤。本发明的又一目的在提供一种蔬莓果发酵物，其中该蔬莓果发酵物是将一蔬果汁及莓果汁的混合物由如前所述的制备方法制备所得。本发明的另一目的在提供一种如前所述的蔬莓果发酵物用于制备一提高抗氧化活性的组合物的用途。在本发明的一实施例中，该第一段水相萃取步骤是将该蔬果汁及莓果汁的混合物以水为溶剂，在50-100℃下进行萃取0.5-3小时以得到一第一段水相萃取步骤的产物，且该蔬果汁及莓果汁的混合物与水是以1:1-5(w/w)的比例混合；该第二段醇相萃取步骤及该第三段有机酸相萃取步骤，是将该第一段水相萃取步骤的产物以一酵母菌(saccharomycescerevisiae)以及一乳酸菌(streptococcusthermophilus)于25-35℃下进行发酵1-10天，且该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(w/w)；该乳酸菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)。在本发明的又一实施例中，前所述的本发明三段式萃取方法是提升本发明的蔬莓果发酵物中总多酚含量。在本发明的另一实施例中，前所述的本发明三段式萃取方法是提升本发明的蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶的活性。本发明的三段式萃取方法，其中第一段水相萃取步骤，是先将原料中水溶性微量元素、矿物质分离出来；第二段醇相萃取步骤，是进一步提取具有挥发性、低极性的物质；最后，第三段有机酸相的发酵步骤，是通过酵母菌及乳酸菌发酵，以产生的乳酸等有机酸相进行萃取，将其中有机酸、弱电解质物质分离出来。透过该三段式的萃取，将蔬果汁及莓果汁的混合物原料中的精华完全地萃取出来，以达到增加有效成分，以及提升原料功效的目的。将蔬果汁及莓果汁的混合物以本发明的三段式萃取方法制备，可显著的提高该蔬果汁及莓果汁的混合物中总多酚的含量、以及其中超氧化物歧化酶的活性，可有效萃取出该蔬果汁及莓果汁的混合物原料中水溶性矿物质、微量元素、低极性物质、及有机化合物，以同时达到细化分子、及提升功效成分的目的，能增强原料的保健抗氧化的功效。另外，以本发明的三段式萃取方法所得的本发明的蔬莓果发酵物，可用于制备提高抗氧化活性的组合物的用途，且该组合物是一医药品、一保养品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。具体实施方式本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，个此之间的差异以学生t检验(student'st-test)分析。如本文中所使用的，用语「蔬果汁及莓果汁的混合物」意为蔬果汁及莓果汁的混合果汁，其中该蔬果汁及该莓果汁以重量比例1:1进行混合。如本文中所使用的，用语「蔬莓果发酵物」意为将蔬果汁及莓果汁的混合物与水的萃取溶剂以1:1-5(w/w)的比例均匀混合后，经一特定时间与温度进行第一段水相萃取，再以酵母菌及乳酸菌进行第二段醇相萃取及第三段有机酸相的发酵步骤，经该三段式萃取方法而获得。其中该酵母菌为bcrc20271的菌株、且该胚芽乳杆菌为bcrc910636的菌株。依据本发明，有关萃取的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，有关微生物发酵反应的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)以及类似物。依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)以及它们的组合。依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(whitepetrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preservingagents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorptionenhancers)、安定剂(stabilizingagents)、胶凝剂(gellingagents)[诸如卡波普微结晶纤维素(microcrystallinecellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(activeagents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odorabsorbers)、香料(fragrances)、ph调整剂(phadjustingagents)、螯合剂(chelatingagents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusiveagents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizingagents)、渗透增强剂(penetrationenhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptableadjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screeningagent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloringagent)、增稠剂(thickeningagent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueoussolution)、水-醇溶液(aqueous-alcoholsolution)或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-watertype)、油包水型(water-in-oiltype)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonicwater)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeupremoverproducts)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(bodycleansingproducts)等。依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluseagents)一起合并使用：美白剂(whiteningagents)[诸如维生素a酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素c]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)、植物萃取物(plantextracts)[诸如芦荟萃取物(aloeextract)]、皮肤营养剂(skinnutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acneagents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitisagents)、抗过角化剂(antihyperkeratolyticagents)、抗干皮肤剂(anti-dryskinagents)、抗汗剂(antipsoriaticagents)、抗老化剂(antiagingagents)、抗皱剂(antiwrinkleagents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheicagents)、伤口治疗剂(wound-healingagents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(foodadditive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。本发明提供一种能同时达到细化分子、及提升功效成分的三段式萃取方法、及以该方法所得的蔬莓果发酵物用于提高抗氧化活性的用途，本发明的蔬莓果发酵物是将蔬果汁及莓果汁的混合物与水的萃取溶剂以1:1-5(w/w)的比例均匀混合后，经一特定时间与温度进行第一段水相萃取，再以酵母菌及乳酸菌进行第二段醇相萃取及第三段有机酸相的发酵步骤，经该三段式萃取方法而获得。其中该酵母菌为bcrc20271的菌株、且该胚芽乳杆菌为bcrc910636的菌株。本发明的蔬莓果发酵物可显著提高蔬果汁及莓果汁的混合物中总多酚的含量、以及其中超氧化物歧化酶的活性。同时，本发明用于用于提高抗氧化活性的组合物，亦可包含一有效量的本发明蔬莓果发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一保养品、或一食品。以下将详细说明本发明蔬莓果发酵物的详细三段式萃取制备方法、该三段式萃取方法提升本发明的蔬莓果发酵物中总多酚的功效的测试、及三段式萃取方法提升本发明的蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶活性的功效的测试，以证实以本发明的三段式萃取方法，可显著提高所得的本发明的蔬莓果发酵物中总多酚含量、以及其中超氧化物歧化酶的活性。实施例1本发明的蔬莓果发酵物的三段式萃取制备方法在本发明一实施例中，将一蔬果汁及一莓果汁的混合物(以重量比1:1混合)与水的萃取溶剂以1:1-5(w/w)的比例均匀混合进行第一段水相萃取，将其于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，将该粗萃取溶液冷却至室温供后，供后续第二段醇相萃取及第三段有机酸相萃取的发酵步骤使用，于该粗萃取溶液中同时植入0.01-0.5％(w/w)的酵母菌(saccharomycescerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为bcrc20271)、及0.01-0.25％(w/w)的乳酸菌，其中本发明实施例是使用嗜热链球菌(streptococcusthermophilustci125，寄存于中国台湾食品工业发展研究所，2014年6月23日，编号bcrc910636；该菌株已于中国台湾专利公告号第i519644号完成专利寄存)，于25-35℃下进行发酵1-10天，实际时间视发酵状态而异；其中，利用酵母菌产生的代谢产物(醇类化合物)进行醇相萃取，及乳酸菌产生的代谢产物(有机酸类化合物)进行有机酸相萃取。最后在不移除此二种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-4°、ph<4、酒精>5％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液。接着，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400mesh网筛过滤，再添加20-40％的异麦芽寡糖调整规格后，于95-105℃下加热60-90分钟进行灭菌，即得到本发明的蔬莓果发酵物；其中，该蔬果汁及莓果汁皆是购买自扬雅营销有限公司，品名分别为综合蔬果浓缩汁、及综合莓类浓缩汁，产品编号则分别为mx-ac134-fl及、mx-ac130-fc；且该市售综合蔬果浓缩汁为白葡萄、苹果、胡萝卜、甘蔗、百香果、菠萝、柠檬、绿花椰菜、芹菜、及芦笋的浓缩果汁，不额外添加水；而该市售综合莓类浓缩汁为蓝莓、红葡萄、白葡萄、杨梅、蔓越莓、及桑葚的浓缩果汁，不额外添加水。本发明的三段式萃取方法，其中第一段水相萃取步骤，是先将原料中水溶性微量元素、矿物质分离出来；第二段醇相萃取步骤，是进一步提取具有挥发性、低极性的物质；最后，第三段有机酸相的发酵步骤，是透过酵母菌及乳酸菌发酵，以产生的乳酸等有机酸相进行萃取，将其中有机酸、弱电解质物质分离出来。透过该三段式的萃取，将蔬果汁及莓果汁的混合物原料中的精华完全地萃取出来，以达到增加有效成分，以及提升原料功效的目的。实施例2本发明三段式萃取方法提升本发明蔬莓果发酵物中总多酚的功效本发明的一实施例为进行本发明的三段式萃取方法提升本发明的蔬莓果发酵物中总多酚的功效的测试实验，因此使用folin-ciocalteu比色法测定代测物中的总多酚含量，并与市售的他厂牌的蔬莓果发酵物(购自蝶理株式会社的野草酵素液，日本，编号lot#160314)进行比较；该测定法是利用多酚的抗氧化特性来进行，试剂中磷钨酸(phosphotungsticacid)及磷钼酸(phosphomolybdicacid)被多酚类还原(由mo6+变为mo5+)后会生成蓝色化合物(750nm的吸光值)，而该蓝色化合物的深浅与总多酚含量呈正比，因此可用于定量代测物中总多酚的含量。首先，将没食子酸(gallicacid，购自sigma，美国，编号为g7384)作为标准品以制作标准曲线，精密秤取10.0g的没食子酸置于10ml的容量瓶中，再加入ddh2o至总体积达10ml，并完成没食子酸的标准品(gallicacidstock,1000μg/ml)，接着先将该标准品稀释10倍至浓度为100μg/ml(100μl的gallicacidstock+900μl的ddh2o，未使用完的gallicacidstock储存于-20℃下)，接着将该100μg/ml的没食子酸进行是列稀释成0、20、40、60、80、及100μl/ml的没食子酸(如表一所示)，并分别取100μl的各浓度的标准溶液至10ml的玻璃试管中，再加入500μl的folin-ciocalteu的酚试剂(购自merck，德国，编号为1.09001.0100)混合均匀并静置3分钟后，加入400μl的7.5％的碳酸钠(sodiumcarbonate，将7.5g的无水碳酸钠定量至100ml的ddh2o中，其中该无水碳酸钠是购自sigma，美国，编号为31432，)均匀混合后静置反应30-60分钟，较佳为30分钟，再以震荡(vortex)混合静置至确定无气泡后，取出200μl的各管反应溶液置于96孔培养板中，并测量其于750nm的吸光值，以绘制标准溶液的回归曲线公式。表一、系列稀释没食子酸标准品的配方接着，分别取100μl的他厂牌的蔬莓果发酵物、及本发明的蔬莓果发酵物于10ml的玻璃试管中，再分别加入500μl的folin-ciocalteu的酚试剂混合均匀并静置3分钟后，加入400μl的7.5％的碳酸钠均匀混合后静置反应30-60分钟，较佳为30分钟，再以震荡(vortex)混合静置至确定无气泡后，取出200μl的各管反应溶液置于96孔培养板中，测量其于750nm的吸光值，并以上述的标准溶液的回归曲线公式，以内差法算出浓度后，再回乘稀释倍数以取得原本他厂牌的蔬莓果发酵物、及本发明的蔬莓果发酵物中总多酚的浓度。本发明的三段式萃取方法提升本发明的蔬莓果发酵物中总多酚的功效的测试结果如表二所示。他厂牌的蔬莓果发酵物中仅含有52.5μg/ml的总多酚含量，本发明的蔬莓果发酵物中总多分含量却高达395.3μg/ml，为他厂牌的7.5倍。此结果显示，本发明的三段式萃取方法可显著提高蔬果汁及莓果汁的混合物中总多酚的含量，以达到提升功效成分，增强保健抗氧化功效的目的。表二、本发明的蔬莓果发酵物及他厂牌的蔬莓果发酵物中总多酚含总多酚(μg/ml)本发明的蔬莓果发酵物395.3他厂牌的蔬莓果发酵物52.5实施例3本发明三段式萃取方法提升本发明蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶活性的功效本发明的一实施例为进行本发明的三段式萃取方法提升本发明的蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活性的功效的测试实验，其中参考gb/t5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶活性测定的准则进行测试，并同样以前述市售的他厂牌的蔬莓果发酵物进行比较，其中是以待测物抑制邻苯三酚(pyrogallol)自氧化反应的效率，来进行其中sod活性的定量。sod是一种能够催化超氧化物通过歧化反应，并使其转化为氧气和过氧化氢的酵素，其广泛存在于各种动物、植物、及微生物中，是生物体内一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。首先，配置用于测定的a溶液与b溶液，其中a溶液为将1.2114g的三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,tris)和37.2mg的乙二胺四乙酸(edta-2na)溶于62.4ml浓度为0.1mole/l的盐酸(hcl)溶液中，并待溶解后以蒸馏水定容至100ml，b溶液则为将56.7mg的邻苯三酚溶于少量浓度为10mmole/l的盐酸且待溶解后，以纯水定容至100ml。处理待测样品，其中固体样品以下列方法制备：秤取1g的固体样品置于研钵中，加入9ml的纯水研磨溶解后，将全部液体移入离心管内，并以少量纯水冲洗研钵后，将该剩余液体并入离心管中，并以纯水定量至总体积为10ml，再以4000rpm离心15分钟后，取上清液进行测定。液态样品则以下列方法制备：澄清的液体样品可以原液直接测定；混浊的液体样品先以4000rpm离心5分钟后，取上清液进行测定。液体样品可以纯水进行适当稀释，最后再回乘稀释倍数以计算原本浓度。接着，进行控制组的空白测定：于离心管中依序加入2.35ml的a溶液、2ml的纯水、及0.15ml的b溶液，加入b溶液混合后，快速地轻轻摇晃混合均匀，并立即倒入比色管中测定其于325nm波长下的吸光值，反应1分钟后再检测一次其于325nm波长下的吸光值，两数值的差值即为δa235；而待测样品则分别于离心管中依序加入2.35ml的a溶液、1.8ml的纯水、0.2ml的待测样品(他厂牌的蔬莓果发酵物、或本发明的蔬莓果发酵物)及0.15ml的b溶液，加入b溶液混合后，快速地震荡混合均匀，并立即倒入比色管中测定其于325nm波长下的吸光值，反应1分钟后再检测一次其于325nm波长下的吸光值，两数值的差值即为δa235(如下表三所示)。表三、sod活性测定取量表试剂空白样品a溶液2.35ml2.35ml纯水2ml1.8ml待测样品－0.2mlb溶液0.15ml0.15ml最后，再以下列公式计算他厂牌的蔬莓果发酵物、及本发明的蔬莓果发酵物中的sod活性，其中v为4.5、d为0.2。δa325：邻苯三酚自氧化速度δa′325：样品抑制邻苯三酚自氧化速度v：样品的体积d：样品的稀释倍数本发明的三段式萃取方法提升本发明的蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶活性的功效的测试结果如表四所示。他厂牌的蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶活性为1153u/ml的总多酚含量，本发明的蔬莓果发酵物中超氧化物歧化酶活性为1657u/ml，为他厂牌的1.4倍。此结果显示，本发明的三段式萃取方法可显著提高蔬果汁及莓果汁的混合物中超氧化物歧化酶的活性，以达到提升功效成分，增强保健抗氧化功效的目的。表四、本发明的蔬莓果发酵物及他厂牌的蔬莓果发酵物中sod活性sod(u/ml)本发明的蔬莓果发酵物1657他厂牌的蔬莓果发酵物1153综上所述，将蔬果汁及莓果汁的混合物以本发明的三段式萃取方法制备，可显著的提高该蔬果汁及莓果汁的混合物中总多酚的含量、以及其中超氧化物歧化酶的活性，可有效萃取出该蔬果汁及莓果汁的混合物原料中水溶性矿物质、微量元素、低极性物质、及有机化合物，以同时达到细化分子、及提升功效成分的目的，能增强原料的保健抗氧化的功效。另外，以本发明的三段式萃取方法所得的本发明的蔬莓果发酵物，可用于制备提高抗氧化活性的组合物的用途，且该组合物是一医药品、一保养品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。当前第1页12当前第1页12