一种羊栖菜多糖功能化纳米硒及其制备方法与应用与流程

[0001]
本发明属于纳米硒制备技术领域，特别涉及一种羊栖菜多糖功能化纳米硒及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
硒是人体必需的微量元素，同时，它可以帮助细胞抵抗氧化损伤并且在不同神经退行性疾病中也发挥着重要作用。在体内，硒元素的主要存在形式为各种硒蛋白，从而起到各种细胞氧化还原调控、解毒、免疫系统保护的重要作用。然而，硒的许多有益生理作用往往依赖于较高的摄入量而产生毒性，限制了其应用。纳米硒是一种高效低毒的单质硒形态，选择来源广泛、生物兼容性优良。在用于控制纳米颗粒生长的已报道方法中，多糖，蛋白质和/或脂质已被用作senps的有效纳米载体。越来越多的证据表明，用生物活性多糖作为纳米硒的修饰剂能够明显提高纳米硒的稳定性、生物相容性及多种生物活性。因此，利用天然多糖作为修饰剂制备粒径小、稳定性高的纳米硒已成为当下研究热点。
[0003]
羊栖菜隶属褐藻门墨角藻目马尾藻科，在我国辽东半岛、福建、广东浅海域均有分布，日本韩国也有生长。羊栖菜含有丰富的多糖、食品纤维素、多种维生素、矿物质和微量元素，且有人体所需的18种重要氨基酸。羊栖菜多糖是一种具有多种药理活性的酸性多糖，主要由褐藻酸及褐藻糖胶组成，在干品羊栖菜中含量16％-24％。羊栖菜多糖(sfps)作为主要的有效活性之一，是一种有效、无毒的天然化合物，是作为纳米硒修饰剂的较优选择。
[0004]
中国专利cn111406948a公布了一种纳米硒的制备方法，该方法以亚硒酸钠为硒源，抗坏血酸为还原剂，蜈蚣藻多糖为修饰剂，制备出粒径稳定在60nm左右具有较强抗氧化活性的纳米硒；中国专利cn109650349a公开了一种山茶植物多糖功能化纳米硒的制备方法，揭示了山茶植物多糖对纳米硒功能特性的增强作用；目前，关于羊栖菜多糖作为纳米硒的修饰剂的制备及活性研究尚未见报道。


技术实现要素：

[0005]
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种羊栖菜多糖功能化纳米硒及其制备方法与应用。
[0006]
本发明的目的是提供一种羊栖菜多糖功能化纳米硒及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
[0007]
本发明通过羊栖菜多糖作为修饰剂，配成一定浓度的多糖溶液与亚硒酸钠溶液混合，再缓慢加入抗坏血酸溶液通过化学还原法制备出稳定性高、溶解性好的多糖-纳米硒复合物，然后将羊栖菜多糖纳米硒复合物应用在抗氧化药物中。
[0008]
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
[0009]
本发明提供的利用所述的羊栖菜多糖制备羊栖菜多糖功能化纳米硒(sfps-senps)的方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)将羊栖菜多糖溶液和亚硒酸钠溶液混合均匀，然后缓慢加入抗坏血酸溶液，搅
拌均匀，升温进行水浴反应，得到反应液；
[0011]
(2)将步骤(1)所述反应液进行透析处理，冷冻干燥，得到所述羊栖菜多糖功能化纳米硒(sfps-senps)。
[0012]
进一步地，步骤(1)所述羊栖菜多糖溶液的浓度为0.25-3mg/ml；
[0013]
进一步地，步骤(1)所述亚硒酸钠溶液浓度为0.01mol/l；
[0014]
进一步地，步骤(1)所述抗坏血酸溶液浓度为0.04mol/l；
[0015]
进一步地，步骤(1)所述羊栖菜多糖溶液、亚硒酸钠溶液与抗坏血酸溶液的体积比为1:1:1；
[0016]
进一步地，步骤(1)所述水浴反应的温度为50
±
5℃，水浴反应的时间为4
±
0.5h。
[0017]
优选地，步骤(1)所述亚硒酸钠溶液浓度为0.01mol/l。
[0018]
优选地，步骤(1)所述抗坏血酸溶液浓度为0.04mol/l。
[0019]
优选地，步骤(1)所述羊栖菜多糖溶液、亚硒酸钠溶液与抗坏血酸溶液的体积比为1：1：1。
[0020]
优选地，步骤(1)所述水浴反应的温度为50℃，水浴反应的时间为4h。
[0021]
进一步地，步骤(2)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为3-4kd，所述透析处理的时间为48-72h，透析处理的温度为4℃。
[0022]
优选地，步骤(2)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为3kd，所述透析处理的时间为48h，透析处理的温度为4℃。
[0023]
本发明提供一种由上述的制备方法制得的羊栖菜多糖功能化纳米硒(羊栖菜多糖-纳米硒复合物)。该羊栖菜多糖功能化纳米硒具有抗氧化活性。
[0024]
本发明提供的羊栖菜多糖功能化纳米硒能够应用在制备抗氧化剂、补硒产品中。
[0025]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
[0026]
(1)本发明提供的羊栖菜多糖功能化纳米硒的制备方法，直接以亚硒酸钠和抗坏血酸为原料，羊栖菜多糖为表面修饰剂，其制备过程简单易行，产物体系简单，制备的纳米硒颗粒粒径小，分散度高，4℃储存一个月内粒径无明显变化，能谱分析显示，制备的多糖-纳米硒中硒原子的含量为11.88％；
[0027]
(2)本发明制备的羊栖菜多糖功能化纳米硒，与原纳米硒颗粒相比，抗氧化活性得到提高，羊栖菜多糖在复合了纳米硒后也未降低抗氧化活性，因此羊栖菜多糖功能化纳米硒是一种稳定性好、溶解性高的多糖纳米硒复合物。
附图说明
[0028]
图1a为粗多糖得率-料液比折线图；
[0029]
图1b为粗多糖得率-水浴时间折线图；
[0030]
图1c为粗多糖得率-超声功率折线图；
[0031]
图1d为粗多糖得率-超声时间折线图；
[0032]
图2为不同浓度羊栖菜多糖修饰纳米硒溶液的粒径图；
[0033]
图3a为纳米硒溶液的透射电镜图；
[0034]
图3b为羊栖菜多糖-纳米硒溶液的透射电镜图；
[0035]
图4为羊栖菜多糖-纳米硒的表面元素能谱分析图；
[0036]
图5为纳米硒和羊栖菜多糖-纳米硒的紫外吸收光谱图；
[0037]
图6a为不同浓度的纳米硒、羊栖菜多糖和羊栖菜多糖-纳米硒溶液的dpph自由基清除能力比较图；
[0038]
图6b为不同浓度的纳米硒、羊栖菜多糖和羊栖菜多糖-纳米硒溶液的羟基自由基清除能力比较图；
[0039]
图6c为不同浓度的纳米硒、羊栖菜多糖和羊栖菜多糖-纳米硒溶液的abts自由基清除能力比较图。
具体实施方式
[0040]
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
[0041]
实施例1羊栖菜多糖的提取工艺优化
[0042]
1.单因素实验
[0043]
超声辅助热水提取羊栖菜多糖的实验中，包括以下步骤：
[0044]
(1)将干燥的羊栖菜粉末用粉碎机粉碎后过40目筛，然后用体积百分比浓度为95％的乙醇在温度为70℃的条件下回流3h(m/v＝1:4)，脱色后抽滤收集残渣，并在50℃干燥下干燥12h，得到脱色后的羊栖菜。
[0045]
(2)将脱色后的羊栖菜按1:20-60g/ml的料液比与蒸馏水配成羊栖菜溶液，设置好超声参数(超声功率200-600w；超声时间10-30min)后进行超声，然后再放入95℃水浴提取60-180min，离心后收集提取液。
[0046]
提取条件：料液比1:20-60，水浴时间60-180min，超声功率200-600w，超声时间10-30min。
[0047]
(3)将步骤(2)所得羊栖菜多糖提取液在55℃旋蒸浓缩至原体积的1/4，加入浓缩后提取液体积4倍的无水乙醇,4℃冰箱中沉淀12-24h，8000r离心20min得到羊栖菜粗多糖，加水复溶后冻干称重。
[0048][0049]
式中：w为步骤(3)中冻干后的粗多糖重量(g)；w0为脱色后羊栖菜粉末的重量
[0050]
(4)提取得到的粗多糖经过sevage法除蛋白、透析除盐后冻干保存。
[0051]
羊栖菜多糖的提取率可受多种因素的影响，为了探究相互之间的关系，设定料液比、水浴时间、超声功率和超声时间为四种因素，改变一种因素，其他因素不变，进行单因素试验。
[0052]
1.1料液比
[0053]
为了探究料液比对羊栖菜多糖提取率的影响，本发明设置料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，超声功率300w、超声时间20min、水浴时间20min,并按照上述方法在此条件下提取多糖，测不同条件下的粗多糖得率。
[0054]
结果如图1a所示，羊栖菜多糖的提取率并未随着料液比的增加而持续增加，在料液比为1:40的时候羊栖菜多糖的提取率达到最高为23.2％，继续提高料液比，多糖得率并无显著改变。结果表明，增加水量能够给多糖更多的溶解空间，进而提高多糖的得率，但是随着料液比升高，多糖含量逐渐饱和，得率趋于平缓。另外增加料液比也会增加后续的工作量和成本，因此选择料液比范围选在1:40左右。
[0055]
1.2水浴时间
[0056]
为了探究超声功率对羊栖菜多糖提取率的影响，本发明设置水浴时间60min、90min、120min、150min、180min，料液比1:40、超声功率400w、超声时间20min，在此条件下提取羊栖菜多糖并测多糖得率。
[0057]
结果如图1b所示，水浴时间由60min升至120min的过程中，羊栖菜多糖的得率从18.8％升至最大值22.4％，之后随着水浴时间的延长，多糖得率反而开始下降至20.5％左右。结果表明，提高温度可以提高多糖的提取率，但是温度过高会导致多糖结构的改变甚至失活，因此选择水浴时间在120min左右。
[0058]
1.3超声功率
[0059]
为了探究超声功率对羊栖菜多糖提取率的影响，设置超声功率为：200w、300w、400w、500w、600w，料液比1:40、超声时间20min、水浴时间120min，用同样的方法提取多糖并测粗多糖得率。
[0060]
结果如图1c所示，超声功率上升至300w时，多糖得率最大为23.8％，但是继续增大超声功率，多糖得率出现急剧下降，超声功率为500w时，多糖得率已经降到16％左右。结果表明，适宜强度的超声有助于羊栖菜细胞壁的破碎从而释放出更多的多糖，但是超声强度过高反而会破坏多糖的结构和活性，这可能也与超声屏蔽作用的形成有关。因此选择超声强度为300w左右。
[0061]
1.4超声时间
[0062]
为了探究超声时间对羊栖菜多糖提取率的影响，设置超声时间为10min、15min、20min、25min、30min，料液比1:40(g/ml)，超声功率400w，水浴时间120min,上述方法提取羊栖菜多糖并测定多糖得率。
[0063]
结果如图1d所示，超声时间从10min延长至20min的过程中，羊栖菜多糖得率由17.8％显著上升至23％，超声时间继续延长反而导致多糖得率的显著下降，这一趋势与超声功率对多糖得率的影响趋势相似。结果表明，适当的超声时间有助于羊栖菜多糖的释放和溶解，但是长时间超声产生空化屏蔽作用降低了多糖得率，因此，选择超声时间为20min左右。
[0064]
2.响应面优化实验
[0065]
在单因素实验结果的基础上，利用design-expert软件设计了响应面优化实验：按照4因素3水平的方案共设计了29组实验，按照上述羊栖菜多糖提取方法逐一进行实验，记录并分析每组实验的粗多糖得率，设计与结果如表1所示。
[0066]
表1
[0067][0068][0069]
在表1实验结果的基础上进行显著性及方差分析，结果如表2所示：
[0070]
表2
[0071]
[0072][0073]
由表2可知，线性参数(a，b，c)，二次参数(a2，d2)和交互参数(ac)显着影响sfps的产量，模型的p值非常显著，表示模型的适应度很高，而缺少拟合值则表明拟合度相对于纯误差并不显著。预测出的最佳提取条件为：料液比1:50，超声功率20ow，超声时间15min，水浴时间130min，在此条件下多糖的得率理论值为26％。
[0074]
为了检验计算所得的最优提取条件与真实情况是否一样，进行近似验证性实验。按照羊栖菜多糖的最佳提取条件平行实验3次，得到的羊栖菜多糖的平均得率为25.8％，与理论值误差较小，重复性较好，说明结果可靠。
[0075]
实施例2羊栖菜多糖功能化纳米硒(sfps-senp)的制备
[0076]
采用化学还原法制备羊栖菜多糖-纳米硒。将浓度为0.25,0.5，1,2,3,4mg/ml的羊栖菜多糖溶液(1mg/ml)与0.01mol/l的亚硒酸钠溶液等体积混合，在磁力搅拌的作用下混合均匀20min左右，然后再向混合溶液中加入等体积0.04mol/l的抗坏血酸溶液，在50℃条件下磁力搅拌反应4h，至形成颜色稳定的橘红色溶液。将反应液移至截留分子量为3kd的透析袋中，在4℃冰箱中透析48h后冻干，得到羊栖菜多糖功能化纳米硒复合物粉末，干燥器中保存。与上述操作相同，将羊栖菜溶液换成等体积的去离子水溶液制备纳米硒溶液，透析后冻干得到纳米硒粉末，干燥器中保存。分别采用激光粒度分析仪、透射电镜(tem)，能谱分析图和紫外吸收光谱对纳米硒进行表征。
[0077]
本实施例考察了反应体系中不同浓度的羊栖菜多糖对反应体系中纳米硒颗粒粒径的影响，结果如图2所示，本发明分别选用0.25,0.5,1,2,3,4mg/ml羊栖菜多糖溶液作为纳米硒的修饰剂。当羊栖菜多糖溶液的浓度为0.25-1mg/ml时，纳米硒的粒径逐渐减小；当羊栖菜多糖溶液的浓度超过1mg/ml时，纳米硒粒径几乎不变。因此可以确定羊栖菜多糖修饰纳米硒的最佳浓度为1mg/ml，此时纳米硒的平均粒径为60.9nm。
[0078]
本实施例考察了1mg/ml的羊栖菜多糖-纳米硒和1mg/ml的纳米硒溶液的储存稳定性，两者均以溶液的形式储存在4℃冰箱中30天，观察所得，纳米硒几乎全部聚集沉淀在瓶子底部，上清液澄清；羊栖菜多糖-纳米硒依然均匀地分布在溶液中，溶液保持透亮的红色。
[0079]
图3a为纳米硒溶胶的透射电镜(tem)图，表明无羊栖菜多糖作为稀释剂的纳米硒容易聚集成堆，粒径超过100nm；有羊栖菜多糖修饰的纳米硒(见图3b)粒径均一，均匀分散
在溶液中，粒径均不超过100nm。
[0080]
图4为羊栖菜功能化纳米硒复合物的表面元素能谱分析图，结果表明羊栖菜多糖-纳米硒主要包含se元素(11.88％)，c元素(58.57％)和o元素(29.55％)，这一结果表明se元素已成功地掺入多糖基质中。此外，几乎没有观察到其他元素的明显吸收峰，这证明了羊栖菜多糖纳米硒的纯度。
[0081]
图5为羊栖菜多糖和羊栖菜多糖功能化纳米硒溶液的紫外吸收光谱。与羊栖菜多糖溶液的紫外吸收曲线相比，羊栖菜多糖-纳米硒在200nm处的吸收峰更低，但在267nm处有更明显的新吸收峰。该结果表明了sfps-senps(羊栖菜多糖功能化纳米硒)的形成。
[0082]
实施例3不同样品抗氧化活性的测定
[0083]
3.1不同样品对dpph自由基的清除作用
[0084]
称取纳米硒、羊栖菜多糖、羊栖菜多糖功能化纳米硒粉末分别溶于去离子水中，配成一定浓度梯度的样品溶液(0.1,0.25,0.5,0.75,1,1.5mg/ml)。取150μl样品溶液分别加入150μl的dpph溶液(0.1mm，无水乙醇配制)，混合均匀后室温下避光反应30min，于517nm波长处测定吸光值，用等体积蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，等体积无水乙醇溶液代替dpph溶液作为样品对照。dpph自由基清除率按照以下公式计算：
[0085][0086]
式中：a0是空白对照的吸光值；a
s
是样品溶液的吸光值；a
b
样品对照的吸光值。
[0087]
图6a为不同浓度样品的dpph清除率柱状图，结果表明，在浓度为0.1-1.5mg/ml的范围内，不同样品对dpph自由基的清除率随浓度的增加而增加。其中，sfps(羊栖菜多糖)表现出最强的dpph自由基清除活性，其次是sfps-senps(羊栖菜多糖功能化纳米硒)。senps(纳米硒)的清除率一直低于30％，显示出最低的dpph自由基清除能力。
[0088]
3.2不同样品对羟基自由基的清除作用
[0089]
称取纳米硒、羊栖菜多糖、羊栖菜多糖功能化纳米硒粉末溶于去离子水中，配成一定浓度梯度的样品溶液(0.1,0.25,0.5,0.75,1,1.5mg/ml)。将不同浓度的样品溶液、9mm的硫酸亚铁溶液、无水乙醇配制的9mm的水杨酸溶液以及8.8mm的溶液按照体积比1:1:1:1均匀混合，避光在37℃水浴中反应0.5h，然后在510nm处测吸光值。用等体积蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，等体积蒸馏水溶液代替h2o2溶液作为样品对照。羟基自由基清除率按照以下公式计算：
[0090][0091]
式中：a0是空白对照的吸光值；a
s
是样品溶液的吸光值；a
b
样品对照的吸光值。
[0092]
图6b为不同浓度的样品溶液对abts的清除率图，结果表明，羊栖菜多糖和羊栖菜多糖-纳米硒溶液对ho
·
自由基的清除能力是剂量依赖性的。在1.5mg/ml时羊栖菜多糖的平均清除率达到38％,羊栖菜多糖-纳米硒的平均清除率为30％，纳米硒的清除率仅为11.5％。羊栖菜多糖仍然表现出最强的自由基清除能力，其次是sfps-senps，senps最弱。然而，与dpph的清除率相比，样品对羟基自由基的清除率普遍较低。
[0093]
3.3不同样品对abts自由基的清除作用
[0094]
称取纳米硒、羊栖菜多糖、羊栖菜多糖功能化纳米硒粉末溶于去离子水中，配成一定浓度梯度的样品溶液(0.1,0.25,0.5,0.75,1,1.5mg/ml)。将7mm的abts溶液(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)与2.45mm的过硫酸钾等体积混合后避光反应16h，得到abts工作液。然后用pbs缓冲溶液(5mm,ph7.4)稀释abts工作液使其在734nm处的吸光值为0.7
±
0.02。取50μl样品加入150μlabts溶液，避光反应6min后于734nm处测吸光值。用等体积蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，等体积pbs溶液代替h2o2溶液作为样品对照。abts自由基清除率的计算方法如下：
[0095][0096]
式中：a0是空白对照的吸光值；a
s
是样品溶液的吸光值；a
b
样品对照的吸光值。
[0097]
图6c为不同浓度样品对abts自由基清除率结果图，结果表明，随着浓度的增加，羊栖菜多糖和羊栖菜多糖-纳米硒溶液清除abts
·
的能力增强，当浓度达到0.75mg/ml时，两者的清除率均达到80％以上，这表明表明羊栖菜多糖对abts
·
自由基具有很强的清除作用。单纯的senps仍表现出较差的自由基清除能力，清除率一直低于20％。
[0098]
结果表明，经过羊栖菜多糖修饰后的纳米硒的抗氧化能力明显强于原纳米硒，因此，使用羊栖菜多糖作为载体材料制备纳米硒是提高其稳定性和活性的较优选择。
[0099]
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。