[0001]
本发明涉及人胚胎干细胞和诱导型多能干细胞分化为增殖心肌细胞的方法设计技术领域，尤其涉及一种组织工程心肌补片制备方法。
背景技术：
[0002]
根据《中国心血管病报告2015》，2014年心血管病死亡率仍居首位，每5例死亡中就有2例死于心血管病。与1990年相比，2013年心血管病死亡的绝对数字增加了46％；其中，缺血性心脏病死亡人数增加了90.9％。冠状动脉堵塞造成的缺血和随后的再灌注会引起不可逆的细胞损伤，造成心肌细胞坏死，心脏收缩功能下降。由于成体心肌细胞缺乏再生能力，无法修复坏死心肌，细胞移植可能成为缺血性心脏病的有效治疗途径。目前，尽管间充质干细胞对心肌梗死病人心功能改善有积极作用，但其在体内分化为心肌细胞的能力有限，长期效果不佳，因此需要更为有效的种子干细胞。胚胎发育过程为干细胞定向分化提供了重要线索，在过去的几年中，通过操控心脏发育关键通路，在心肌定向分化方面取得了重要进展。
[0003]
但是，在现有技术中，对心肌补片的制备方法复杂，不能简单高效的满足医疗制备心肌补片的要求需要。
技术实现要素：
[0004]
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种简单、稳定高效，能有效促进多能干细胞分化，并制备得到组织工程心肌补片的组织工程心肌补片制备方法。
[0005]
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0006]
一种组织工程心肌补片制备方法，包括如下步骤：
[0007]
s1、取成年猪心，分离左心室；
[0008]
s2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；
[0009]
s3、心肌块冻存于-80℃至少16小时；
[0010]
s4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋；
[0011]
s5、用陶瓷叶片振荡切片机，在1mm振幅、速度0.01～0.03mm/秒、100hz振动频率条件下，切割心肌块，获得厚度约为300-500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片；
[0012]
s6、使用sds和trixon x-100液体，洗涤和浸泡心肌组织薄片，制备得到去细胞心肌组织薄片；
[0013]
s7、将hipsc-cm体外定向诱导分化14-16日；
[0014]
s8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2
×
107个细胞/cm2接种量，种植ipsc-cms于s6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hipsc-cm组织工程心肌薄片1-28日得到组织工程心肌补片。
[0015]
在一种优选的实施方式中，对s5得到的心肌组织薄片浸于pbs中，保温4℃过夜。
[0016]
在一种优选的实施方式中，所述步骤s6中，制备去细胞心肌组织薄片的步骤为：
[0017]
s61、对浸于pbs中，保温4℃过夜的心肌组织薄片用1％sds洗涤两次，每次1.5小时；
[0018]
s62、无菌蒸馏水洗涤15分钟；
[0019]
s63、1％trixon x-100洗涤7分钟；
[0020]
s64、pbs洗涤3次，每次15分钟；
[0021]
s65、将心肌组织薄片浸于pbs，置于110rpm摇床室温过夜；
[0022]
s66、心肌组织薄片在14mm无菌塑料玻片上铺开，薄片外缘固定于玻片边缘得到去细胞心肌组织薄片。
[0023]
在一种优选的实施方式中，所述步骤s61、s62、s63和s64均在室温150rpm摇床上进行。
[0024]
在一种优选的实施方式中，所述步骤s7中，将hipsc-cm诱导分化具体步骤为：
[0025]
s71、将ipsc以100,000细胞量种植于geltrex包被6孔板；
[0026]
s72、每日给予2ml essential 8培养基；
[0027]
s73、第4日细胞铺满板底75-85％传代；细胞传至第4代备用；
[0028]
s74、以80,000细胞量种植步骤s73备用的细胞于geltrex包被6孔板单层细胞培养，每日给予2ml essential 8培养基,于第4日更换培养基为b27-insulin，并添加6μmol chir99021；
[0029]
s75、激活wnt途径，诱导分化第3日添加5μmol iwr-1，抑制wnt途径，第5日更换为2ml b27-insulin培养基，以后隔日换液，诱导分化第8-10日观察到跳动的诱导成功的心肌细胞。
[0030]
在一种优选的实施方式中，所述诱导成功的心肌细胞纯度鉴定包括：流式细胞术检测hipsc-cm纯度；
[0031]
具体包括如下步骤：
[0032]
步骤一、心肌细胞经过消化后，4％pfa固定；
[0033]
步骤二、0.3％triton打孔，5％bsa封闭；
[0034]
步骤三、一抗孵育，pbs漂洗2次；
[0035]
步骤四、二抗孵育，pbs漂洗2次；
[0036]
步骤五、流式细胞仪检测hipsc-cm中α-actinin+、ctnt+、mlc2v+及mlc2a+细胞所占比例。
[0037]
在一种优选的实施方式中，所述诱导成功的心肌细胞亚型分析包括：检测hipsc-cm电生理性质和hipsc-cm亚型分析；
[0038]
在一种优选的实施方式中，所述检测hipsc-cm电生理性质包括如下步骤：
[0039]
步骤一、种植hipsc-cm于35mm细胞培养皿；
[0040]
步骤二、加入2ml tyrode's溶液，给予10μmol电压敏感性染料di-4-anepps染色10分钟；
[0041]
步骤三、添加10μmol细胞收缩抑制剂blebbistatin，给予不同频率电刺激及离子通道阻滞或激活剂；
[0042]
步骤四、观察hipsc-cm动作电位变化以及对于药物的反应，100x100像素cmos摄像机记录光学图像，matlab软件处理数据，绘制动作电位波形，计算信号传导速度及动作电位
时程等指标，描绘hipsc-cm的电生理特点；
[0043]
在一种优选的实施方式中，所述hipsc-cm亚型分析具体包括如下步骤：
[0044]
hipsc-cm经电生理性质检测之后立即用4％pfa固定，免疫荧光法检测ctni、mlc2v、kv1.5及hcn4表达，结合电生理学指标，判断各心肌细胞亚型的含量及所占比例。
[0045]
在一种优选的实施方式中，所述去细胞心肌组织薄片指标检测包括：去细胞效率检测、细胞外基质检测和静态力学检测；
[0046]
在一种优选的实施方式中，所述去细胞效率检测包括如下步骤：
[0047]
a.dna定量分析：
[0048]
去细胞心肌薄片经含1％sds及1％proteinase k的tris edta溶液消化后，分离dna，分光光度计法检测残余dna含量；
[0049]
b.细胞免疫荧光：去细胞心肌薄片经dapi及α-actin染色，检测去细胞残余；
[0050]
在一种优选的实施方式中，所述细胞外基质检测包括如下步骤：
[0051]
a.相差显微镜观察，利用二次谐波发生技术，选择在414-436nm波长范围内显示组织标本的胶原shg信号；通过单通道获得心肌胶原蛋白shg图像，观察去细胞心肌薄片细胞外基质胶原蛋白结构及分布；
[0052]
b.原位胶原免疫荧光染色检测去细胞心肌薄片collagen i,collagen iii及laminin细胞外基质蛋白形态及分布；
[0053]
c.液相色谱-串联质谱法检测去细胞心肌薄片细胞外基质蛋白成分。
[0054]
去细胞心肌薄片冷冻干燥，取1mg样本加入200μl溶解液，超声溶解后加入30μl的dtt(1mol/l)，置于57℃水浴1小时后加入30μl碘乙酰胺(1mol/l)，避光反应45分钟后加入800μl tris缓冲液、丙酮沉淀蛋白、干燥后送分析测试中心检测；
[0055]
在一种优选的实施方式中，所述静态力学检测包括如下步骤：
[0056]
去细胞心肌薄片浸泡25℃缓冲液，夹持于instron5848微观力学实验系统，控制钳夹间距1cm，初始40％张力拉伸样本，并以5％增量递增，换能器记录拉伸强度和弹性模量。
[0057]
在一种优选的实施方式中，所述步骤s8中，包括对组织工程心肌补片细胞生物学检测、收缩性能检测和电生理学检测；
[0058]
在一种优选的实施方式中，所述细胞生物学检测包括如下步骤：
[0059]
a.tunel法检测种植细胞存活比例；
[0060]
b.免疫荧光染色法检测dapi、cardiac troponin i、α-actin及connexin-43，观察移植细胞形态及发育情况；
[0061]
c.相差显微镜观察shg成像分析组织工程心肌薄片内hipsc-cm空间分布及排列；
[0062]
在一种优选的实施方式中，所述收缩性能检测包括如下步骤：
[0063]
组织工程心肌薄片浸于tyrode's溶液，1-5hz频率放电刺激，电荷偶联摄像机记录薄片边缘收缩情况，matlab软件计算薄片收缩时边缘平均位移；
[0064]
在一种优选的实施方式中，所述电生理学检测包括如下步骤：
[0065]
采用optical mapping技术，将组织工程心肌薄片浸于tyrode's溶液；
[0066]
给予10μmol电压敏感性染料di-4-anepps染色10分钟后给予10μmol细胞收缩抑制剂blebbistatin；
[0067]
给予不同频率电刺激及离子通道阻滞或激活剂；
[0068]
观察组织工程化心肌薄片对不同频率电刺激及药物反应，100x100像素cmos摄像机记录光学图像，matlab软件处理数据，绘制动作电位波形，计算信号传导速度及动作电位时程等指标。
[0069]
本发明的组织工程心肌补片制备方法，具有如下有益效果：
[0070]
该组织工程心肌补片制备方法，在多能干细胞向心肌细胞分化的过程中，能有效的促进心肌细胞的成熟，肌小节排列整齐，收缩力增强，趋向成熟，更接近于成人样的心肌细胞表型。因此本发明的方法是一种创新性的诱导心肌成熟的方式，能有效的解决心肌细胞成熟度低的问题，同时可以为临床疾病治疗和药物筛选提供有效的成熟的心肌细胞，从而为临床级细胞的获得和细胞移植提供重要参考。
[0071]
该组织工程心肌补片制备方法，制备方法过程简单，可以稳定高效的满足对组织工程心肌补片的培养制备，满足医疗使用要求。
具体实施方式
[0072]
下面结合本发明的实施例对本发明的组织工程心肌补片制备方法作进一步详细的说明。
[0073]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0074]
术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0075]
一种组织工程心肌补片制备方法，包括如下步骤：
[0076]
s1、取成年猪心，分离左心室。
[0077]
s2、冲孔机打孔获取左心室心肌块。
[0078]
s3、心肌块冻存于-80℃至少16小时。
[0079]
s4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋。
[0080]
s5、用陶瓷叶片振荡切片机，在1mm振幅、速度0.01～0.03mm/秒、100hz振动频率条件下，切割心肌块，获得厚度约为300-500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片。
[0081]
s51、心肌组织薄片浸于pbs中，保温4℃过夜。
[0082]
去细胞心肌组织薄片指标检测包括：去细胞效率检测、细胞外基质检测和静态力学检测；
[0083]
所述去细胞效率检测包括如下步骤：
[0084]
a.dna定量分析：
[0085]
去细胞心肌薄片经含1％sds及1％proteinase k的tris edta溶液消化后，分离dna，分光光度计法检测残余dna含量；
[0086]
b.细胞免疫荧光：去细胞心肌薄片经dapi及α-actin染色，检测去细胞残余；
[0087]
所述细胞外基质检测包括如下步骤：
[0088]
a.相差显微镜观察，利用二次谐波发生技术，选择在414-436nm波长范围内显示组织标本的胶原shg信号；通过单通道获得心肌胶原蛋白shg图像，观察去细胞心肌薄片细胞外基质胶原蛋白结构及分布；
[0089]
b.原位胶原免疫荧光染色检测去细胞心肌薄片collagen i,collagen iii及laminin细胞外基质蛋白形态及分布；
[0090]
c.液相色谱-串联质谱法检测去细胞心肌薄片细胞外基质蛋白成分；
[0091]
去细胞心肌薄片冷冻干燥，取1mg样本加入200μl溶解液，超声溶解后加入30μl的dtt(1mol/l)，置于57℃水浴1小时后加入30μl碘乙酰胺(1mol/l)，避光反应45分钟后加入800μl tris缓冲液、丙酮沉淀蛋白、干燥后送分析测试中心检测；
[0092]
所述静态力学检测包括如下步骤：
[0093]
去细胞心肌薄片浸泡25℃缓冲液，夹持于instron5848微观力学实验系统，控制钳夹间距1cm，初始40％张力拉伸样本，并以5％增量递增，换能器记录拉伸强度和弹性模量。
[0094]
s6、(参照并改进ott方法)使用sds和trixon x-100(十二烷基磺酸钠(sds)和triton x-100)液体，洗涤和浸泡心肌组织薄片，制备得到去细胞心肌组织薄片。
[0095]
制备去细胞心肌组织薄片的步骤为：
[0096]
s61、对浸于pbs中，保温4℃过夜的心肌组织薄片用1％sds洗涤两次，每次1.5小时；
[0097]
s62、无菌蒸馏水洗涤15分钟；
[0098]
s63、1％trixon x-100洗涤7分钟；
[0099]
s64、pbs洗涤3次，每次15分钟；
[0100]
s65、将心肌组织薄片浸于pbs，置于110rpm摇床室温过夜；
[0101]
s66、心肌组织薄片在14mm无菌塑料玻片上铺开，薄片外缘固定于玻片边缘得到去细胞心肌组织薄片。
[0102]
优选的，步骤s61、s62、s63和s64均在室温150rpm摇床上进行。
[0103]
s7、将hipsc-cm(人体多能干细胞诱导的心肌细胞)体外定向诱导分化14-16日。
[0104]
将hipsc-cm诱导分化具体步骤为：
[0105]
s71、将ipsc以100,000细胞量种植于geltrex包被6孔板；
[0106]
s72、每日给予2ml essential 8
tm
培养基；
[0107]
s73、第4日细胞铺满板底75-85％传代；细胞传至第4代备用；
[0108]
s74、(参照boheler方法，调控wnt途径(wnt是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用)诱导hipsc分化心肌细胞)以80,000细胞量种植步骤s73备用的细胞于geltrex包被6孔板单层细胞培养，每日给予2ml essential 8
tm
培养基,于第4日更换培养基为b27-insulin，并添加6μmol chir99021(chir99021，gsk3抑制剂)；
[0109]
s75、激活wnt途径，诱导分化第3日添加5μmol iwr-1，抑制wnt途径，第5日更换为2ml b27-insulin(rpmi-1640基础培养基、不含胰岛素的细胞培养添加剂b27)培养基，以后隔日换液，诱导分化第8-10日观察到跳动的诱导成功的心肌细胞。
[0110]
诱导成功的心肌细胞纯度鉴定包括：流式细胞术检测hipsc-cm纯度；
[0111]
具体包括如下步骤：
[0112]
步骤一、心肌细胞经过消化后，4％pfa固定；
[0113]
步骤二、0.3％triton(triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂))打孔，5％bsa(bsa一般指牛血清白蛋白。牛血清白蛋白(bsa)，是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，分子量为66.446kda，等电点为4.7)封闭；
[0114]
步骤三、一抗孵育，pbs(pbs缓冲液)漂洗2次；
[0115]
步骤四、二抗孵育，pbs(pbs缓冲液)漂洗2次；
[0116]
步骤五、流式细胞仪检测hipsc-cm中α-actinin+、ctnt+、mlc2v+及mlc2a+细胞所占比例。
[0117]
诱导成功的心肌细胞亚型分析包括：检测hipsc-cm电生理性质和hipsc-cm亚型分析；optical mapping(optical mapping是利用限制酶去裁切单分子dna，产生单分子dna图谱，然后将许多单分子dna图谱组装起来，以得到全基因体图谱的一种技术。)
[0118]
所述检测hipsc-cm电生理性质包括如下步骤：
[0119]
步骤一、种植hipsc-cm于35mm细胞培养皿；
[0120]
步骤二、加入2ml tyrode's溶液，给予10μmol电压敏感性染料di-4-anepps染色10分钟；
[0121]
步骤三、添加10μmol细胞收缩抑制剂blebbistatin(blebbistatin_非肌肉肌球蛋白ii型atp酶抑制剂)，给予不同频率电刺激及离子通道阻滞或激活剂；
[0122]
步骤四、观察hipsc-cm动作电位变化以及对于药物的反应，100x100像素cmos摄像机记录光学图像，matlab软件处理数据，绘制动作电位波形，计算信号传导速度及动作电位时程等指标，描绘hipsc-cm的电生理特点；
[0123]
所述hipsc-cm亚型分析具体包括如下步骤：
[0124]
hipsc-cm经电生理性质检测之后立即用4％pfa固定，免疫荧光法检测ctni、mlc2v、kv1.5及hcn4表达，结合电生理学指标，判断各心肌细胞亚型的含量及所占比例。
[0125]
s8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2
×
107个细胞/cm2接种量，种植ipsc-cms于s6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hipsc-cm组织工程心肌薄片1-28日得到组织工程心肌补片。
[0126]
对组织工程心肌补片细胞生物学检测、收缩性能检测和电生理学检测；
[0127]
所述细胞生物学检测包括如下步骤：
[0128]
a.tunel法(检测mirna改变与乳腺癌细胞凋亡的关系)检测种植细胞存活比例；
[0129]
b.免疫荧光染色法检测dapi(dapi细胞染色液(dapi staining solution)是适用于常见细胞和组织细胞核染色的染色液。)、cardiac troponin i(探讨心肌肌钙蛋白i(cardiac troponin i,ctni))、α-actin(α-平滑肌肌动蛋白)及connexin-43(间隙连接蛋白基因connexin 43被认为和皮肤损伤修复相关)，观察移植细胞形态及发育情况；
[0130]
c.相差显微镜观察shg成像分析组织工程心肌薄片内hipsc-cm空间分布及排列；
[0131]
所述收缩性能检测包括如下步骤：
[0132]
组织工程心肌薄片浸于tyrode's溶液，1-5hz频率放电刺激，电荷偶联摄像机记录薄片边缘收缩情况，matlab软件计算薄片收缩时边缘平均位移；
[0133]
所述电生理学检测包括如下步骤：
[0134]
采用optical mapping技术，将组织工程心肌薄片浸于tyrode's溶液；
[0135]
给予10μmol电压敏感性染料di-4-anepps染色10分钟后给予10μmol细胞收缩抑制剂blebbistatin；
[0136]
给予不同频率电刺激及离子通道阻滞或激活剂；
[0137]
观察组织工程化心肌薄片对不同频率电刺激及药物反应，100x100像素cmos摄像机记录光学图像，matlab软件处理数据，绘制动作电位波形，计算信号传导速度及动作电位时程等指标。
[0138]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。