Mb1961c蛋白的新用途
【专利摘要】本发明提供了Mb1961c蛋白用于制备外周血γ-干扰素体外释放试验刺激剂的新用途。本发明的Mb1961c蛋白作为外周血γ-干扰素体外释放试验刺激剂的检查效果好于其它25种分枝杆菌抗原蛋白，与Prionics公司牛IFN-γ试剂盒的阳性和阴性符合率分别为79.4%和92.3%，总符合率为88.8%，显示出其作为牛结核病外周血γ-干扰素体外释放试验刺激剂的极高应用价值。
【专利说明】Mb1961c蛋白的新用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种牛分枝杆菌Mbl961c蛋白的新用途。
【背景技术】
[0002]牛结核病主要由牛型分枝杆菌感染牛引起的一种慢性细菌性疾病，也可感染人类和其他一些动物引起相应疾病，被国际动物卫生组织(OIE)列为需通报的动物疫病。牛结核病直接影响牛的生产力及产品的国际贸易，造成巨大经济损失，同时其作为一种重要的人兽共患病，也是公共卫生的重大威胁。虽然大部分发达国家由于采取“检疫-扑杀”的根除策略和强大的经济支撑，牛结核病的流行率已降至很低水平，但至今尚无任何国家获得OIE “无结核”认可。另外，牛结核病在许多发展中国家仍十分流行，近年来随着养牛业突飞猛进的发展，我国一些地区的发病率也呈上升趋势。因此，如何有效预防和检测牛结核具有重要的经济和社会意义。
[0003]鉴于分枝杆菌感染初期机体的免疫应答主要以细胞免疫为主，故牛结核病的检疫主要通过细胞免疫应答为基础的检测手段，包括结核菌素皮内变态试验(TST)和牛结核外周血Y -干扰素体外释放试验(简称IFN- Y法)。其中TST是OIE指定也是应用最普遍的牛结核病检测方法，但其敏感性和特异性受限。IFN-Y法主要检测特异性抗原体外刺激全血后产生的IFN-Y水平，已被OIE认可。这两种方法均使用到结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD), PPD由分枝杆菌培养物灭活提纯得到，成分复杂，其特异性易受交叉反应影响，经常造成诊断结果的假阳性， 给生产带来一些不必要的损失。因此，探索特异、敏感的检测抗原对控制牛结核有重要意义。
[0004]Mbl961c蛋白是牛分枝杆菌一种主要分泌蛋白，是由毒力相关基因Mbl961c编码的低分子量蛋白质，为牛分枝杆菌静息期分泌的主要膜蛋白。该蛋白分子量为16kDa，其基因共编码159个氨基酸，其中前29个氨基酸为信号肽，130个为成熟蛋白。该蛋白存在于结核分枝杆菌复合群中，且高度保守，在环境分枝杆菌等非致病菌中则不存在该抗原的基因。
[0005]目前，尚未有研究将Mbl961c蛋白作为外周血Y -干扰素体外释放试验的刺激剂，用于牛结核病的诊断。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，针对牛型pro存在的非特异性及pro制备繁琐等不足，提供一种高特异性和高敏感性的pro替代的重组蛋白牛分枝杆菌Mbl961c蛋白，作为牛结核病外周血Y -干扰素体外释放试验的刺激剂，提高检测结果的灵敏度和特异性。
[0007]本发明的第一方面公开了一种外周血Y-干扰素体外释放试验刺激剂，所述刺激剂含有Mbl961c蛋白。
[0008]本发明的第二方面公开了 Mbl961c蛋白在制备牛结核外周血Y-干扰素体外释放试验的刺激剂中的新用途。
[0009]进一步的，所述Mbl961c蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]进一步的，所述Mbl961c蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0011]本发明的第三方面公开了 Mbl961c蛋白的制备方法。所述Mbl961c蛋白可利用常规的基因工程的制备方法获得。例如:通过PCR扩增相应的编码基因序列，经克隆筛选和测序鉴定正确后，利用pET30a质粒构建原核表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选获得阳性转化子，再以IPTG诱导表达，对以胞内可溶性表达的Mbl961c蛋白进行亲和层析纯化，即得。
[0012]进一步的，所述制备方法为:提取牛分枝杆菌基因组DNA作为模板，PCR扩增Mbl961c基因片段，将Mbl961c片段插入pCR2.1载体转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性克隆；酶切、回收和连接Mbl961c与pET30a(+)片段，构建重组质粒pET_Mbl961c，转化大肠杆菌BL21(DE3) ;IPTG诱导表达，超声裂解，上清经N1-NTA柱纯化；收集洗脱液于PBS中透析24h，进行浓度和纯度定量，即得。
[0013]本发明的有益效果为:
[0014](I)本发明首次公开了 Mbl961c蛋白用于制备外周血Y-干扰素体外释放试验刺激剂的新用途。将本发明的Mbl961c蛋白和其它25种分枝杆菌抗原蛋白作为候选刺激剂，与牛型 PF1D 和禽型 PPD 同步依照 Pr1nics 公司 BOVIGAM?Mycobacterium bovis GammaInterferon Test Kit for cattle (简称Pr1nics公司牛IFN-Y试剂盒)说明书检测奶牛全血样品中IFN-Y水平。结果发现，本发明的Mbl961c蛋白作为外周血Y -干扰素体外释放试验刺激剂的检查效果好于其它25种分枝杆菌抗原蛋白，与Pr1nics公司牛IFN-Y试剂盒的阳性和阴性符合率分别为79.4%和92.3%，总符合率为88.8%，显示出其作为牛结核病外周血Y-干扰素体外释放试验刺激剂的极高应用价值。
[0015] (2)经典的TST试验中需要使用牛型PPD，其制备时需要牛结核强毒株，增加了生物安全控制成本；而本发明只需要用无致病性的大肠杆菌发酵即可获得大量的靶蛋白。因此，使用本发明提供的Mbl961c蛋白作为刺激剂诊断奶牛结核病成本低、速度快、敏感性和特异性高。(3)本发明中所用的诊断抗原Mbl961c蛋白为牛分枝杆菌主要优势抗原之一，病原感染后该抗原在体内能持续存在，但禽结核、副结核等极易干扰牛结核诊断的环境分枝杆菌中不含有该基因。因此，该试剂不仅能及时诊断出牛结核的感染，而且在鉴别诊断上也有较大的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图l.Mbl961c 基因的 PCR 扩增(a)、重组质粒 pCR2.1-Mbl961c (b)和pET-Mbl961c(c)的PCR和酶切鉴定图，其中M:DL2000 DNA marker ；1:目的基因Mbl961c 的PCR产物；2和4:重组质粒的PCR鉴定；3和5:重组质粒的双酶切鉴定。
[0017]图 2.Mbl961c 蛋白的 SDS-PAGE 分析，其中 M:蛋白 marker ;1:BL21 (DE3) -pET30a (+)空载体菌对照；2:BL21 (DE3)-pET_Mbl961c 重组菌未诱导；3:BL21 (DE3)-pET-Mbl961c重组菌诱导上清；4:纯化后的Mbl961c重组蛋白。
[0018]图 3.Mbl961c 蛋白的 western blotting 分析，其中 I:BL21 (DE3) -pET30a(+)空载体对照；2:纯化的Mbl961c蛋白。
【具体实施方式】
[0019]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0020]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本【技术领域】常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Samb10k等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edit1n, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edit1n,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR B1LOGY, John ffiley&Sons, New York,1987 and per1dic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCT1N, Third edit1n, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSIN ENZYM0L0GY, Vol.304, Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR B1LOGY, Vol.119， ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0021]实施例1:基因工程菌的构建
[0022]1、引物和目的基因扩增
[0023]选择GenBank公布的Mbl961c基因序列(基因ID: 1093510)，设计PCR扩增引物，序列如下:
[0024]Pl (上游引物):5’ -GGGATCCATGAAGCTCACCACAATGATC-3’ (SEQ ID N0.1)(划线碱基为BamH I酶切位点);
[0025]P2(下游引物):5’ -TAGAGCTCCTACGGCTCCCAAATCAG-3，(SEQ ID N0.2)(划线碱基为Sac I酶切位点)。
[0026]以牛分枝杆菌基因组DNA作模版，经过条件优化建立如下PCR扩增体系:
[0027]
【权利要求】
1.一种外周血Y-干扰素体外释放试验刺激剂，其特征在于，所述刺激剂含有Mbl961c蛋白。
2.Mbl961c蛋白用于制备外周血Y -干扰素体外释放试验刺激剂的新用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述Mbl961c蛋白的核苷酸序列为SEQIDN0:3。
4.根据权利 要求2所述的用途，其特征在于，所述Mbl961c蛋白的氨基酸序列为SEQIDN0:4。
【文档编号】C07K14/35GK104163859SQ201410368059
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】焦新安, 陈祥, 孟闯, 万婷, 徐正中, 殷月兰, 潘志明, 耿士忠, 黄金林, 李求春, 孙林 申请人:扬州大学