一种基于I型胶原质冻胶的软骨诱导方法与流程

本发明涉及I型胶原质冻胶的用途，具体地说是以I型胶原质冻胶制备组织工程化软骨的应用。

背景技术：

软骨缺损是临床上常见的疾病。目前，临床对软骨缺损的治疗仍没有较好的质量方案。近些年来，组织工程学和再生医学的发展给软骨缺损的治疗带来了契机。I型胶原因其良好的组织相容性和降解性被广泛应用到临床中。虽然软骨组织的主要成分是II型胶原，但是理化性能没有I型胶原好。而I型胶原与II型胶原有相似的组成结构，同时能够提供细胞生长的微环境，而开发成为冻胶，包含结合水成分，与软骨组织更为接近，是软骨组织修复的理想材料。因此采用组织工程技术从小牛皮中提取开发软骨诱导型I型胶原质冻胶具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是研究开发软骨诱导型I型胶原质冻胶做为诱导软骨和软骨修复的材料，开发I型胶原质冻胶的新用途，以I型胶原质冻胶制备组织工程化软骨的应用。

本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分：

一、I型胶原质冻胶的制备

提取方法：将去毛的小牛皮洗净，沥干，剪碎，粉碎后，Tris-HCl 4℃浸泡过夜，0.1%的醋酸溶液溶解2小时后，用2%的胃蛋白酶4℃消化24小时至48小时。

纯化方法： 将胃蛋白酶消化的产物加入0.1%的醋酸中，反复洗涤离心3次；加入0.5M的NaOH调节PH至7.2左右，放置于-20℃，即获得高纯度的I型胶原质冻胶；即时使用时放置于4℃。

鉴定方法：I型胶原质冻胶溶液均匀地涂覆在石英片上,在180~420nm处进行检测其紫外光谱。

二、I型胶原体外诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）成软骨实验

提取新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，然后用I型胶原质冻胶诱导骨髓间充质干细胞成软骨。细胞活力检测表明骨髓间充质干细胞在I型胶原质冻胶中能够较好的生长，且在不断地增殖。

番红O染色检测结果显示，I型胶原质冻胶的诱导下可以形成类似软骨陷窝的结构，且骨髓间充质干细胞在I型胶原质冻胶得诱导下可以促使软骨相关多糖蛋白的表达增高。

定量PCR检测软骨相关基因：II型胶原（COL2A1）, 蛋白聚糖（ACAN）和SOX9均有所上调，而纤维软骨相关基因——I型胶原（COL1A1）和软骨肥大化相关基因（COL10）表达量均较低。以上结果说明I型胶原水凝胶有诱导骨髓间充质干细胞成软骨的作用。

I型胶原质冻胶作为诱导软骨和软骨修复材料开辟了新用途。

I型胶原质冻胶在软骨诱导性能上的应用，是按照以下方法实现的：

将海绵状的I型胶原质冻胶以15mg/mL的浓度溶解于0.1%得醋酸溶液中，并在4摄氏度下用0.5M的NaOH调节PH至7.2左右，用于后续实验；实验分为：1）对照组，BMSCs小球（10⁷个细胞/团）；2）诱导组，BMSCs + I型胶原质冻胶（10⁷个细胞/团）。实验组采用涡流的方法，将15mg/mL I型胶原质冻胶与骨髓间充质干细胞混合，放在培养箱中15分钟后成凝胶，加入正常的完全培养基，分别培养7天，14天和21天。

总之，本发明首次对I型胶原质冻胶的软骨诱导性能进行了研究，实验表明I型胶原质冻胶可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和生长。与此同时，I型胶原质冻胶还有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用。因此，软骨诱导型I型胶原质冻胶可以作为诱导软骨和软骨修复的材料，开发了I型胶原质冻胶的新用途，应用I型胶原质冻胶构建软骨诱导性胶原水凝胶在软骨缺损的治疗上有重要意义。

附图说明

图1A是标准 Sigma I型胶原紫外光谱图；

图1B是所提取的I型胶原质冻胶紫外光谱图；

图2是I型胶原质冻胶诱导BMSCs成软骨细胞的番红O染色图。

具体实施方式

一、I型胶原质冻胶的制备和鉴定

提取方法：将去毛的小牛皮洗净，沥干，剪碎，粉碎后，用0.05M的Tris-HCl 在4℃浸泡过夜，弃缓冲液后，用超纯水洗涤3次。室温下将沉淀物溶于0.1%的醋酸溶液中，2小时后用匀浆机将沉淀物打匀，用2%的胃蛋白酶在4℃消化24至48小时。此时即可获得粗提的I型胶原质冻胶。

纯化方法：将粗提的产物以每克50ml 0.1% 醋酸的比例洗涤，4摄氏度下10000rpm离心30分钟，重复3次后即可获得高纯度的I型胶原质冻胶。并将I型胶原质冻胶用冻干机冻干48小时后形成海绵状备用。

鉴定方法：将I型胶原质冻胶溶液均匀地涂覆在石英片上, 在180~420nm处进行检测其紫外光谱。胶原的肽链中含有CO、COOH和CONH₂等生色基团, 可在近紫外区检测其吸收峰值。图1A是标准 Sigma I型胶原紫外光谱图，图1B是所提取的I型胶原质冻胶紫外光谱图。所提取的I型胶原质冻最大吸收在230nm附近，而Sigma I型胶原也是在230nm处。证明所提取的样品含有I型胶原蛋白的结构特征。

二、I型胶原体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨实验

实验方案：

（1）实验分组及处理

选取2月新西兰大白兔，用骨髓穿刺针于股骨处抽取骨髓10毫升，利用梯度密度离心法分离出骨髓间充质干细胞，用alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) 培养基在37摄氏度，5%CO₂培养箱中培养。并用第三代骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导实验。将海绵状的I型胶原质冻胶以15mg/mL的浓度溶解于0.1%得醋酸溶液中，并在4摄氏度下用0.5M的NaOH调节PH至7.2左右，用于后续实验。实验分为：1）对照组，BMSCs小球（10⁷个细胞/团）；2）诱导组，BMSCs + 15mg/mL I型胶原质冻胶（10⁷个细胞/团）。实验组采用涡流的方法I型胶原质冻胶成凝胶之前与细胞混合，放在培养箱中15分钟后成凝胶。两组加入正常完全培养基后分别培养7天，14天和21天。

（2）检测指标

①细胞增殖；

②软骨相关蛋白GAG检测；

③番红O染色；

④RT-PCR检测COL2A1，COL1A1，SOX9，COL10，ACAN mRNA的表达。

（3）实验结果：

①细胞增殖情况

运用DNA法检测细胞的增殖情况，细胞增殖情况约佳，OD值约高。随着时间的增长两组细胞均有所增长，其中，诱导组细胞增殖比对照组更高（P<0.05）。

结果见表1。

*代表P<0.05

②软骨相关蛋白GAG检测

与对照组比较，经过I型胶原质冻胶诱导后，骨髓间充质干细胞有像软骨细胞分化的倾向，且软骨相关蛋白明显提高（P < 0. 05）。

结果见表2。

*代表P<0.05

③番红O染色

番红O染色可以间接反应软骨相关多糖蛋白的表达量。骨髓间充质干细胞在经过I型胶原质冻胶诱导后，出现深染的阳性表达区，见图2，表明I型胶原质冻胶有诱导软骨形成的能力。

④RT-PCR检测COL2A1，COL1A1，SOX9，COL10，ACAN mRNA的表达

诱导组中COL2A1，SOX9和ACAN表达量随着时间的增加而增高，且均高于对照组（p<0.05），而COL1A1和COL10并无较高的表达且结果与对照组无明显的差异。

结果见表3。

*代表P<0.05

结论：

I型胶原质冻胶可以在不加任何生长因子和诱导液的情况下，有诱导间充质干细胞向软骨分化的能力，可做为诱导软骨和软骨修复的材料。