一种多效唑人工抗原的合成方法与流程

本发明涉及一种多效唑人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术：

多效唑作为一种抑制类的植物生长调节剂，具有延缓植物生长、抑制茎杆伸长、缩短节间、促进花芽分化、增加植物抗逆性能、提高作物产量等功能，广泛应用于水稻、麦类、花生、果树、烟草、油菜、大豆等农作物生产。多效唑在土壤中易被吸收，残留时间长，可能对非目标物产生危害，许多欧盟国家已经禁用，很多国家对多效唑也作出了严格限量，我国在农产品上对多效唑的最严限量≤0.2mg/kg。因此，建立快速有效的检测多效唑含量的方法具有重要意义及市场价值。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆单体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多效唑人工抗原的合成方法，所制备的产品用于多效唑免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，一种多效唑人工抗原的合成方法，其由多效唑与4-溴丁酸苄酯、氢氧化钾、氢氧化锂反应得到具有羧基的产物，即半抗原PBBA，用碳二亚胺法将半抗原PBBA与载体蛋白偶联，即得到多效唑人工抗原；步骤为：

（1）半抗原PBBA的合成：

合成路线如下：

称取化合物Ⅰ多效唑5g（17.06mmol）和4-溴丁酸苄酯 13.16g（51.19mmol） 溶解于二甲亚砜50mL中，加入氢氧化钾 1.05g（18.77mmol），在90℃下搅拌过夜，然后加水30mL，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。粗品通过制备型-HPLC纯化，得到化合物Ⅱ800mg；

称取化合物Ⅱ600mg（1.25mmol）溶解在四氢呋喃3mL和水2mL混合溶液中，加入氢氧化锂 131.5mg（3.13mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型HPLC纯化粗产物，得到半抗原PBBA 200mg。

（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原PBBA，与KLH偶联得到偶联物完全抗原PBBA-KLH；或与BSA偶联得到偶联物完全抗原PBBA-BSA。

所述完全抗原PBBA-KLH制备方法如下：

a、称取步骤（1）制备的PBBA 4.3mg，二环己基碳二亚胺3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反4-5h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL, PBBA与KLH摩尔比为4500︰1)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PBBA-KLH混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物PBBA-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PBBA-KLH。

所述完全抗原PBBA-BSA制备方法如下：

a、称取步骤（1）制备的PBBA 2mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应4-5h。称取10mg 牛血清蛋白BSA（PBBA与BSA摩尔比为30︰1），溶解于2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液中，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PBBA-BSA混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物PBBA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PBBA-BSA。

多效唑的人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即得到偶联物中蛋白的含量。

偶联物中小分子浓度的测定：浓度为Xμg/mL的小分子在特征峰处的吸光值A1，偶联物在特征峰处的吸光值A2，小分子的分子量为M，所以，偶联物中小分子的浓度= ( A2×X)/ A1

偶联比=（( A2×X)/ A1/M）/（蛋白浓度/蛋白分子量）×（稀释倍数）

本发明的有益效果：本发明成功合成了多效唑的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。

附图说明

图1半抗原PBBA的NMR鉴定图。

图2半抗原PBBA的LC-MS鉴定图。

图3 PBBA-KLH人工抗原的免疫原紫外鉴定图。

图4 PBBA-BSA人工抗原的免疫原紫外鉴定图。

具体实施方式

实施例1 半抗原PBBA的合成

称取化合物Ⅰ多效唑5g，17.06mmol和4-溴丁酸苄酯 13.16g，51.19mmol 溶解于二甲亚砜50mL中，加入氢氧化钾 1.05g，18.77mmol，在90℃下搅拌过夜，然后加水30mL，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。粗品通过制备型-HPLC纯化，得到化合物Ⅱ800mg；

称取化合物Ⅱ600mg，1.25mmol 溶解在四氢呋喃3mL和水2mL混合溶液中，加入氢氧化锂 131.5mg，3.13mmol，并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型HPLC纯化粗产物，得到半抗原PBBA 200mg。

（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原PBBA，与KLH偶联得到偶联物完全抗原PBBA-KLH；或与BSA偶联得到偶联物完全抗原PBBA-BSA。

实施例2所述完全抗原PBBA-KLH制备方法如下：

a、称取实施例1步骤（1）制备的PBBA 4.3mg，二环己基碳二亚胺3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应4-5h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL, PBBA与KLH摩尔比为4500︰1)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PBBA-KLH混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物PBBA-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PBBA-KLH。

实施例3完全抗原PBBA-BSA制备方法如下：

a、称取实施例1步骤（1）制备的PBBA 2mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应4-5h。称取10mg 牛血清蛋白BSA（PBBA与BSA摩尔比为30︰1），溶解于2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液中,加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PBBA-BSA混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物PBBA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PBBA-BSA。

实施例4 多效唑人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶联中蛋白的含量。

实施例2中PBBA-KLH免疫原的紫外鉴定图如图3所示；

实施例3中PBBA-BSA免疫原的紫外鉴定图如图4所示；

PBBA-BSA免疫原偶联物中小分子浓度的测定：浓度为10μg/mL的小分子在特征峰269nm处的吸光值A1= 0.30771，偶联物在269nm处的吸光值A2=0.28649，小分子的分子量为380.2g/mol，所以，偶联物中小分子的浓度 =(0.28649×10μg/mL)/ 0.30771=9.31039μg/mL；BSA浓度2mg/mL，BSA分子量67000。

偶联比=（9.31039μg/mL/380.2）/（2mg/mL /67000）×12（稀释倍数）=9.8。