一种抗癌前药及其制备方法和抗癌药物与流程

[0001]
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗癌前药，本发明还涉及一种抗癌前药的制备方法，本发明一种包括上述抗癌前药的抗癌药物。


背景技术：

[0002]
放射疗法(radiation therapy，rt)是用于治疗人类患者各种局部实体癌的最常用治疗方式之一，在放射疗法中，x射线、γ射线、电子、中子和带电粒子通过与关键靶标直接相互作用或通过自由基(例如羟基)间接诱导细胞损伤。然而，放射疗法同时损害肿瘤细胞和正常组织细胞，具有较大的副作用。因此，针对该情况，出现了靶向治疗，即设计相应的靶向治疗药物，靶向药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。
[0003]
尽管靶向治疗在癌症治疗中有效，但由于几乎所有实体肿瘤中都存在的肿瘤缺氧，经常会遇到耐药性的问题。在缺氧的环境下，无法有效产生可杀死癌症的自由基，例如活性氧(ros)，因此，缺氧严重影响了放射线的治疗效果。另外，抗癌气体正在不断应用于局部肿瘤微环境(tumor micro-environment，tme)中，例如一氧化碳(co)、氢(h2)、一氧化氮(no)等。与其他抗癌药物相比，抗癌气体由于其高度扩散的特性而可能表现出更广泛的抗癌作用。据报道，no能通过线粒体ros信号通路促进癌细胞死亡。增加tme中no产生，在一定程度上有利于治疗各种癌症。常规的no输送方法主要有吸入和口服吸收no供体，但通常由于产生低循环浓度而导致no供应不足。no的低产量仍然是一个具有挑战性的问题，目前还没有任何策略可以解决这一挑战。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提供了一种抗癌前药，本发明还提供了一种抗癌前药的制备方法，本发明还提供了一种抗癌药物，以解决现有no型抗肿瘤药物存在的no供应不足、靶向效果差、无法控制no释放等诸多问题。
[0005]
第一方面，本发明提供了一种抗癌前药，包括血小板膜衍生囊泡(pm)、peg修饰的金纳米簇(auncs-peg)以及亚硝基铁氰化钠(snp)，所述peg修饰的金纳米簇及亚硝基铁氰化钠包覆于所述血小板膜衍生囊泡中。
[0006]
优选的，所述peg修饰的金纳米簇为cy5-peg-sh修饰的金纳米簇。在其它实施方式中，peg修饰的金纳米簇还可以是nh
2-peg-sh。
[0007]
优选的，所述cy5-peg-sh的分子量为1～3kda。更优选的，所述cy5-peg-sh的分子量为2kda。
[0008]
本发明抗癌前药(auncs-peg-pm-snp，aps)包括血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠，peg修饰的金纳米簇及亚硝基铁氰化钠包覆于血小板膜衍生囊泡中。本发明抗癌前药(auncs-peg-pm-snp，aps)具有以下优点：(1)auncs-peg-pm-snp在辐射下通过snp(亚硝基铁氰化钠)与l-gsh(谷胱甘肽)反应释放出高含量的抗癌一氧化氮
(no)，no通过下调缺氧因子抑制细胞呼吸和o2消耗，o2浓度的增加促进在肿瘤微环境中有效产生ros改善放射治疗效果，通过光控释放一氧化氮的过程实现精准医疗。(2)auncs-peg-pm-snp(aps)被肿瘤细胞摄取的能力强，还可以逃避生物体的免疫系统，顺利进入癌细胞，发挥抗肿瘤作用。(3)auncs-peg-pm-snp(aps)有多种抗癌作用，还包括：改善放射疗法诱导的癌细胞死亡，no诱导的特异性癌细胞杀伤，抑制肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)中的基质细胞成分，破坏肿瘤生长。(4)auncs-peg-pm-snp(aps)可以抑制肿瘤细胞的增殖，还可以增强放射治疗的效果。
[0009]
第二方面，本发明还提供了一种抗癌前药的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
提供血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠，将血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠混合并通过多孔膜挤出，挤出物经离心后收集沉淀，得到抗癌前药。
[0011]
优选的，所述血小板膜衍生囊泡采用如下方法制备：
[0012]
提供血小板的pbs悬浮液并冷冻在-70℃以下，所述血小板的pbs悬浮液在室温下解冻后离心收集沉淀，用混合有蛋白酶抑制剂的pbs洗涤沉淀，再将沉淀转移至去离子水中进行水浴超声，超声后的溶液通过多孔膜挤出；
[0013]
所述水浴超声的功率为70～150w，所述水浴超声的时间为3～10min，所述多孔膜的孔径为50～500nm。
[0014]
优选的，所述血小板的pbs悬浮液在室温下解冻后4000g下离心3min以收集沉淀，所述水浴超声的功率为100w，所述水浴超声的时间为5min；
[0015]
所述超声后的溶液依次通过100nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出。
[0016]
优选的，所述peg修饰的金纳米簇采用如下方法制备：
[0017]
提供peg水溶液和金纳米簇分散液，搅拌金纳米簇分散液的同时向金纳米簇分散液中滴加peg水溶液，反应1～5h，制得peg修饰的金纳米簇；
[0018]
所述peg的一端为巯基，所述peg的另一端为cy5，所述peg水溶液的浓度与金纳米簇分散液的浓度相同。
[0019]
优选的，所述血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠的质量之比为1:1:10。
[0020]
本发明抗癌前药的制备方法具有步骤简单，成本低，可用于大规模工业化生产等优点。
[0021]
第三方面，本发明还提供了一种抗癌药物，包括第一方面所述的抗癌前药及药学上可接受的辅料。该抗癌药物具有前述抗癌前药的诸多优点，能够有效改善放射治疗的效果。
[0022]
优选的，所述抗癌药物为片剂、注射剂、酊剂、栓剂、胶囊剂、软膏剂、眼用制剂、丸剂、植入剂、糖浆剂、气雾剂、膜剂、颗粒剂、口服溶液剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、洗剂、搽剂、凝胶剂或贴剂。
[0023]
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
[0024]
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
[0025]
图1为本发明一实施方式提供的aps的tem图；
[0026]
图2为图1所示aps的uv-vis-nir吸收光谱图；
[0027]
图3为实施例1制备的物质的直径对比图；
[0028]
图4为不同物质对细胞中o2消耗试验结果图；
[0029]
图5为不同条件下snp和aps释放no的结果图；
[0030]
图6为不同浓度的raw 264.7中进行的试样摄取测试结果图；
[0031]
图7为不同浓度的ct26细胞中进行的试样摄取测试结果图；
[0032]
图8为对ct26细胞进行克隆存活分析的结果图。
具体实施方式
[0033]
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0034]
第一方面，本发明提供了一种抗癌前药，包括血小板膜衍生囊泡(pm)、peg修饰的金纳米簇(auncs-peg)以及亚硝基铁氰化钠(snp)，所述peg修饰的金纳米簇及亚硝基铁氰化钠包覆于所述血小板膜衍生囊泡中。
[0035]
优选的，所述peg修饰的金纳米簇为cy5-peg-sh修饰的金纳米簇。
[0036]
优选的，所述cy5-peg-sh的分子量为1～3kda，更优选的，所述cy5-peg-sh的分子量为2kda。
[0037]
第二方面，本发明还提供了一种抗癌前药的制备方法，包括以下步骤：
[0038]
提供血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠，将血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠混合并通过多孔膜挤出，挤出物经离心后收集沉淀，得到抗癌前药。
[0039]
优选的，所述血小板膜衍生囊泡采用如下方法制备：
[0040]
提供血小板的pbs悬浮液并冷冻在-70℃以下，所述血小板的pbs悬浮液在室温下解冻后离心收集沉淀，用混合有蛋白酶抑制剂的pbs洗涤沉淀，再将沉淀转移至去离子水中进行水浴超声，超声后的溶液通过多孔膜挤出；
[0041]
所述水浴超声的功率为70～150w，所述水浴超声的时间为3～10min，所述多孔膜的孔径为50～500nm。
[0042]
优选的，所述血小板的pbs悬浮液在室温下解冻后4000g下离心3min以收集沉淀。
[0043]
优选的，所述水浴超声的功率为100w，所述水浴超声的频率为53khz，所述水浴超声的时间为5min。
[0044]
优选的，所述超声后的溶液依次通过100nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出。
[0045]
优选的，所述peg修饰的金纳米簇采用如下方法制备：
[0046]
提供peg水溶液和金纳米簇分散液，搅拌金纳米簇分散液的同时向金纳米簇分散液中滴加peg水溶液，反应1～5h，制得peg修饰的金纳米簇(auncs-peg)；
[0047]
所述peg的一端为巯基，所述peg的另一端为cy5，所述peg水溶液的浓度与金纳米簇分散液的浓度相同。
[0048]
优选的，所述peg水溶液的浓度与金纳米簇分散液的浓度均为1mg/ml。
[0049]
优选的，金纳米簇分散液中滴加peg水溶液并反应2h，反应后的分散系在4℃的去离子水中洗涤两次。
[0050]
优选的，所述血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠的质量之比为1:1:10。
[0051]
优选的，所述多孔膜挤出为通过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出，再通过离心去除多余的血小板膜衍生囊泡及亚硝基铁氰化钠，得到抗癌前药(auncs-peg-pm-snp)。
[0052]
第三方面，本发明还提供了一种抗癌药物，包括第一方面所述的抗癌前药及药学上可接受的辅料。
[0053]
优选的，所述抗癌药物为片剂、注射剂、酊剂、栓剂、胶囊剂、软膏剂、眼用制剂、丸剂、植入剂、糖浆剂、气雾剂、膜剂、颗粒剂、口服溶液剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、洗剂、搽剂、凝胶剂或贴剂。
[0054]
以下通过具体的实施例详细阐述抗癌前药的制备方法以及制备的抗癌前药。
[0055]
实施例1
[0056]
制备血小板膜衍生囊泡(pm)：
[0057]
(1)将来自c57bl/6的全血中的血小板(plt)通过梯度离心分离。具体而言：将10ml小鼠全血在无制动下以100
×
g离心20分钟，然后以800
×
g进一步离心上清液20min，获得血小板。将获得的血小板通过pbs洗涤并离心几次，备用。
[0058]
(2)将等分试样的plt悬浮液冷冻在-80℃冰箱中，然后转移至室温下解冻，并通过在4000
×
g下离心3分钟沉淀，收集沉淀。将沉淀的血小板膜衍生囊泡(pm)用混合蛋白酶抑制剂片剂的pbs洗涤3次后转移至去离子水中，在加盖的玻璃小瓶中，使用水浴超声仪在53khz和100w下超声处理5分钟，最后依次在100纳米和200纳米聚碳酸酯多孔膜的小型挤出机上挤出，得到血小板膜衍生囊泡。
[0059]
制备peg修饰的金纳米簇(auncs-peg)
[0060]
取1ml浓度为1mg/ml的cy5-peg-sh(平均分子量为2kda)的水溶液和1ml浓度为1mg/ml的auncs分散液，在剧烈搅拌下将cy5-peg-sh水溶液滴加到auncs分散液中，反应2小时。将反应后的分散系在4℃的去离子水中洗涤两次，以形成peg修饰的纳米复合材料(auncs-peg)。
[0061]
制备抗癌前药(auncs-peg-pm-snp，aps)
[0062]
取1ml含有200μg peg修饰的金纳米簇(auncs-peg)的pbs溶液、2mg亚硝基铁氰化钠(snp)与200μg血小板膜衍生囊泡(pm)混合，使用avanti小型挤出机将前述步骤的混合物通过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出11次，再通过离心去除多余的pm和snp，得到aps。将新制备的aps在1
×
pbs缓冲液中于4℃放置过夜，备用。
[0063]
实施例2
[0064]
实施例2与实施例1的区别仅在于：制备血小板膜衍生囊泡(pm)步骤中，水浴超声的频率为40khz，水浴超声的功率150w，水浴超声的时间为10分钟，最后通过200纳米聚碳酸酯多孔膜的小型挤出机上挤出两次，得到血小板膜衍生囊泡。
[0065]
实施例3
[0066]
实施例3与实施例1的区别在于：血小板膜衍生囊泡、peg修饰的金纳米簇以及亚硝基铁氰化钠的质量之比为1:1:5。
[0067]
效果实施例：
[0068]
以下采用实施例1制备的抗癌前药(auncs-peg-pm-snp，aps)为样品进行以下测试。
[0069]
如图1所示，为实施例1中抗癌前药auncs-peg-pm-snp(aps)的tem图。图1显示，装载snp、auncs-peg的纳米颗粒(aps)的直径约为100nm。如图2(400nm波长处从上往下四条曲线分别对应aps、snp、auncs和sh-peg-cy5)所示，为实施例1制备的aps的uv-vis-nir吸收光谱图，制备的aps的uv-vis-nir吸收光谱为snp、sh-peg-cy5以及aps的吸收光谱之和，通过uv-vis-nir吸收光谱验证了抗癌前药中snp负载和pm涂层的存在。如图3所示，为pm、auncs-peg以及aps的直径对比图，aps(110
±
3.6nm)略大于auncs-peg np(100
±
5.6nm)，表明np是封装到pm中的状态。
[0070]
基于no分解和o2气泡的产生，本发明还进一步验证了snp的过氧化氢酶样性质。如图4(25min时，从上往下四条曲线依次对应control组、aps+cell组、cell组和ap+cell组)所示，细胞中的o2被消耗，然后在25分钟后减少约50％。添加ap(auncs-peg-pm)不会改变细胞中的o2消耗，但aps可以减少o2的消耗，25分钟后细胞中的剩余o2约为75％。aps+cell组与没有aps的正常细胞组(cell)相比，增加了50％。在不同条件下snp和aps释放no的情况如图5(72h时从上往下依次对应三条曲线分别是：snp+5mm gsh组、aps+5mm gsh组以及aps组)所示，在存在l-谷胱甘肽(gsh)的情况下，no从snp和aps中迅速释放。由此表明，aps在有gsh的情况下促进no的释放，并且能降低o2的消耗。
[0071]
图6(并排的三组从左至右分别是：auncs-peg组、ap组和aps组)和图7(并排的三组从左至右分别是：aps组、ap组和auncs-peg组)分别是在不同浓度的raw 264.7(小鼠巨噬细胞样细胞系)和ct26(小鼠结肠癌细胞系)细胞中进行了auncs-peg、ap、aps纳米颗粒摄取测试结果，在不同浓度的ct26细胞处理中，aps组比其它组具有最强的摄取能力。最重要的是，ct26细胞的aps组的摄取能力远高于raw 264.7巨噬细胞样细胞对aps组的摄取能力。这些结果表明，aps纳米粒子可以逃避生物体的免疫系统，顺利进入癌细胞，发挥靶向抗肿瘤的作用。
[0072]
图8是对ct26细胞进行了克隆存活分析的结果，四条曲线的最右端从上往下依次对应control组、auncs-peg组、ap组和aps组，其中aps组是抑制肿瘤细胞增殖最明显的一组。
[0073]
综上所述，本发明的抗癌前药aps不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖，而且可以增强放射治疗的效果。
[0074]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。