技术特征：
1.一种用于改变宿主细胞dna序列的系统，该系统包含：脱氧核糖核酸(dna)内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸；包含与宿主细胞基因座互补的间隔区序列的向导rna(grna)或编码该grna的核酸；以及包含编码合成fviii蛋白的核酸序列的供体模板，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。2.如权利要求1所述的系统，其中该b结构域替代物包含0至6个n
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连接的糖基化位点。3.如权利要求2所述的系统，其中该b结构域替代物包含0至3个n
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连接的糖基化位点。4.如权利要求1所述的系统，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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369、371和373中任一个的氨基酸序列。5.如权利要求4所述的系统，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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366、371和373中任一个的氨基酸序列或其与seq id no:362
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366、371和373中的任一个具有至少80％同一性的变体。6.如权利要求5所述的系统，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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364、371和373中任一个的氨基酸序列。7.如权利要求1
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6中任一项所述的系统，其中该宿主细胞基因座是在肝脏中表达的基因的基因座。8.如权利要求1
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7中任一项所述的系统，其中该宿主细胞基因座是编码急性期蛋白的基因的基因座。9.如权利要求8所述的系统，其中该急性期蛋白是白蛋白、转铁蛋白或纤维蛋白原。10.如权利要求1
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7中任一项所述的系统，其中该宿主细胞基因座是安全港基因座。11.如权利要求1
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10中任一项所述的系统，其中该dna内切核酸酶选自由以下项组成的组：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cpf1内切核酸酶及其功能衍生物。12.如权利要求11所述的系统，其中该dna内切核酸酶是cas9。13.如权利要求1
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11中任一项所述的系统，其中编码该dna内切核酸酶的核酸经过密码子优化以在该宿主细胞中表达。14.如权利要求1
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13中任一项所述的系统，其中编码该dna内切核酸酶的核酸是脱氧核糖核酸(dna)。15.如权利要求1
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13中任一项所述的系统，其中编码该dna内切核酸酶的核酸是核糖核酸(rna)。16.如权利要求15所述的系统，其中编码该dna内切核酸酶的rna是mrna。17.如权利要求1
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16中任一项所述的系统，其中该供体模板核酸序列经过密码子优化以在该宿主细胞中表达。18.如权利要求1
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17中任一项所述的系统，其中与编码fviii蛋白的野生型核酸序列相比，该供体模板核酸序列包含降低含量的cpg二核苷酸。
19.如权利要求18所述的系统，其中该供体模板核酸序列不含cpg二核苷酸。20.如权利要求1
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19中任一项所述的系统，其中该供体模板在腺相关病毒(aav)载体中编码。21.如权利要求1
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20中任一项所述的系统，其中该供体模板包含供体盒，该供体盒包含编码合成fviii蛋白的核酸序列，并且其中该供体盒在一侧或两侧上侧接有grna靶位点。22.如权利要求21所述的系统，其中该供体盒在两侧上侧接有grna靶位点。23.如权利要求21所述的系统，其中该供体盒在其5’侧上侧接有grna靶位点。24.如权利要求21
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23中任一项所述的系统，其中该grna靶位点是该系统中grna的靶位点。25.如权利要求24所述的系统，其中该供体模板的grna靶位点是该系统中grna的基因组grna靶位点的反向互补序列。26.如权利要求1
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25中任一项所述的系统，其中该dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸包含在脂质体或脂质纳米颗粒中。27.如权利要求26所述的系统，其中该脂质体或脂质纳米颗粒还包含该grna。28.如权利要求1
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27中任一项所述的系统，其中该dna内切核酸酶与该grna复合，从而提供核糖核蛋白(rnp)复合物。29.一种编辑宿主细胞中的基因组的方法，该方法包括向该细胞提供以下物质：(a)包含与宿主细胞基因座互补的间隔区序列的grna或编码该grna的核酸；(b)dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸；以及(c)包含编码合成fviii蛋白的核酸序列的供体模板，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。30.如权利要求29所述的方法，其中该b结构域替代物包含0至6个n
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连接的糖基化位点。31.如权利要求30所述的方法，其中该b结构域替代物包含0至3个n
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连接的糖基化位点。32.如权利要求29所述的方法，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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369、371和373中任一个的氨基酸序列。33.如权利要求32所述的方法，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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366、371和373中任一个的氨基酸序列或其与seq id no:362
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366、371和373中的任一个具有至少80％同一性的变体。34.如权利要求33所述的方法，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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364、371和373中任一个的氨基酸序列。35.如权利要求29
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34中任一项所述的方法，其中该宿主细胞内源基因座是在肝脏中表达的基因的基因座。36.如权利要求29
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35中任一项所述的方法，其中该宿主细胞内源基因座是编码急性期蛋白的基因的基因座。37.如权利要求36所述的方法，其中该急性期蛋白是白蛋白、转铁蛋白或纤维蛋白原。38.如权利要求29
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34中任一项所述的方法，其中该宿主细胞内源基因座是安全港基因
座。39.如权利要求29
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38中任一项所述的方法，其中该dna内切核酸酶选自由以下项组成的组：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cpf1内切核酸酶；或其功能衍生物。40.如权利要求39所述的方法，其中该dna内切核酸酶是cas9。41.如权利要求29
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40中任一项所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的核酸经过密码子优化以在该宿主细胞中表达。42.如权利要求29
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41中任一项所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的核酸是dna。43.如权利要求29
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41中任一项所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的核酸是核糖核酸(rna)。44.如权利要求43所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的rna是mrna。45.如权利要求29所述的方法，其中该供体模板在aav载体中编码。46.如权利要求29
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45中任一项所述的方法，其中该供体模板核酸序列经过密码子优化以在该宿主细胞中表达。47.如权利要求29
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46中任一项所述的方法，其中与编码fviii的野生型核酸序列相比，该供体模板核酸序列包含降低含量的cpg二核苷酸。48.如权利要求47所述的方法，其中该供体模板核酸序列不含cpg二核苷酸。49.如权利要求29
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48中任一项所述的方法，其中该供体模板包含供体盒，该供体盒包含编码合成fviii蛋白的核酸序列，并且其中该供体盒在一侧或两侧上侧接有grna靶位点。50.如权利要求49所述的方法，其中该供体盒在两侧上侧接有grna靶位点。51.如权利要求49所述的方法，其中该供体盒在其5’侧上侧接有grna靶位点。52.如权利要求49
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51中任一项所述的方法，其中该grna靶位点是(a)的grna的靶位点。53.如权利要求52所述的方法，其中该供体模板的grna靶位点是该细胞基因组中针对(a)的grna的grna靶位点的反向互补序列。54.如权利要求29
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53中任一项所述的方法，其中该dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。55.如权利要求54所述的方法，其中该脂质体或脂质纳米颗粒还包含该grna。56.如权利要求29
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55中任一项所述的方法，其中该dna内切核酸酶和该grna作为rnp复合物提供给宿主细胞，该rnp复合物包含与该grna预复合的dna内切核酸酶。57.如权利要求29
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56中任一项所述的方法，其中在将(c)的供体模板提供给该细胞后超过四天，将(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸提供给该细胞。58.如权利要求29
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57中任一项所述的方法，其中在将(c)的供体模板提供给该细胞后至少14天，将(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸提供给该细胞。59.如权利要求57或58所述的方法，其中在第一剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸后，向该细胞提供一个或多个附加
剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸。60.如权利要求59所述的方法，其中在第一剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸后，向该细胞提供一个或多个附加剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸，直至达到编码合成fviii蛋白的核酸序列的目标靶向整合水平，或达到编码合成fviii蛋白的核酸序列的目标表达水平。61.如权利要求29
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60中任一项所述的方法，其中该细胞是肝脏细胞。62.如权利要求61所述的方法，其中该细胞是人肝脏细胞或人肝窦上皮细胞。63.一种细胞，其中该细胞的基因组包含编码合成fviii蛋白的dna，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。64.如权利要求63所述的细胞，其中该合成fviii蛋白与内源性白蛋白启动子、内源性转铁蛋白启动子或内源性纤维蛋白原α启动子可操作地连接。65.如权利要求63所述的细胞，其中编码该合成fviii蛋白的核酸序列经过密码子优化以在该细胞中表达。66.如权利要求63所述的细胞，其中该细胞是人肝脏细胞。67.如权利要求66所述的细胞，其中该细胞是人肝脏细胞或人肝窦上皮细胞。68.如权利要求67所述的细胞，其中该细胞通过如权利要求29
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62中任一项所述的方法制备，或是通过如权利要求29
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62中任一项所述的方法制备的细胞的后代。69.一种治疗受试者的血友病a的方法，该方法包括：向该受试者中的细胞提供以下物质：(a)包含与宿主细胞基因座互补的间隔区序列的grna或编码该grna的核酸；(b)dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸；以及(c)包含编码合成fviii蛋白的核酸序列的供体模板，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。70.如权利要求69所述的方法，其中该b结构域替代物包含0至6个n
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连接的糖基化位点。71.如权利要求70所述的方法，其中该b结构域替代物包含0至3个n
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连接的糖基化位点。72.如权利要求69所述的方法，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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369、371和373中任一个的氨基酸序列。73.如权利要求72所述的方法，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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366、371和373中任一个的氨基酸序列或其与seq id no:362
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366、371和373中的任一个具有至少80％同一性的变体。74.如权利要求73所述的方法，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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364、371和373中任一个的氨基酸序列。75.如权利要求69
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74中任一项所述的方法，其中该宿主细胞基因座是在肝脏中表达的
基因的基因座。76.如权利要求69
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75中任一项所述的方法，其中该宿主细胞基因座是编码急性期蛋白的基因的基因座。77.如权利要求76所述的方法，其中该急性期蛋白是白蛋白、转铁蛋白或纤维蛋白原。78.如权利要求69
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74中任一项所述的方法，其中该宿主细胞基因座是安全港基因座。79.如权利要求69
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78中任一项所述的方法，其中该dna内切核酸酶选自由以下项组成的组：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cpf1内切核酸酶；或其功能衍生物。80.如权利要求79所述的方法，其中该dna内切核酸酶是cas9。81.如权利要求80所述的方法，其中该cas9是spcas9或slucas9。82.如权利要求69
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81中任一项所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的核酸经过密码子优化以在该细胞中表达。83.如权利要求69
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82中任一项所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的核酸是dna。84.如权利要求69
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82中任一项所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的核酸是rna。85.如权利要求84所述的方法，其中编码该dna内切核酸酶的rna是mrna。86.如权利要求69
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85中任一项所述的方法，其中将(a)的grna或编码该grna的核酸、(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸以及(c)的供体模板中的一种或多种配制在脂质体或lnp中。87.如权利要求69
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86中任一项所述的方法，其中该供体模板在aav载体中编码。88.如权利要求69
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87中任一项所述的方法，其中该供体模板核酸序列经过密码子优化以在该宿主细胞中表达。89.如权利要求69
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88中任一项所述的方法，其中与编码fviii的野生型核酸序列相比，该供体模板核酸序列包含降低含量的cpg二核苷酸。90.如权利要求89所述的方法，其中该供体模板核酸序列不含cpg二核苷酸。91.如权利要求69
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90中任一项所述的方法，其中该供体模板包含供体盒，该供体盒包含编码合成fviii蛋白的核酸序列，并且其中该供体盒在一侧或两侧上侧接有grna靶位点。92.如权利要求91所述的方法，其中该供体盒在两侧上侧接有grna靶位点。93.如权利要求91所述的方法，其中该供体盒在其5’侧上侧接有grna靶位点。94.如权利要求91
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93中任一项所述的方法，其中该grna靶位点是该grna的靶位点。95.如权利要求94所述的方法，其中该供体模板的grna靶位点是该细胞基因组中针对(a)的grna的grna靶位点的反向互补序列。96.如权利要求69
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95中任一项所述的方法，其中向该细胞提供该供体模板包括向该受试者静脉内施用该供体模板。97.如权利要求69
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96中任一项所述的方法，其中该dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸配制在脂质体或lnp中。98.如权利要求97所述的方法，其中该脂质体或lnp还包含该grna。99.如权利要求98所述的方法，其中向该细胞提供该grna或编码该grna的核酸和该dna
内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸包括向该受试者静脉内施用该脂质体或脂质纳米颗粒。100.如权利要求69
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99中任一项所述的方法，其中该dna内切核酸酶和该grna作为核糖核蛋白(rnp)复合物提供给该宿主细胞，该rnp复合物包含与该grna复合的dna内切核酸酶。101.如权利要求69
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100中任一项所述的方法，其中在将(c)的供体模板提供给该细胞后超过四天，将(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸提供给该细胞。102.如权利要求69
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101中任一项所述的方法，其中在将(c)的供体模板提供给该细胞后至少14天，将(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸提供给该细胞。103.如权利要求101或102所述的方法，其中在第一剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸后，向该细胞提供一个或多个附加剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸。104.如权利要求103所述的方法，其中在第一剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸后，向该细胞提供一个或多个附加剂量的(a)的grna或编码该grna的核酸和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸，直至达到该编码合成fviii蛋白的核酸序列的目标靶向整合水平和/或该编码合成fviii蛋白的核酸序列的目标表达水平。105.如权利要求101
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104中任一项所述的方法，其中向该细胞提供(a)的grna和(b)的dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸包括向该受试者施用包含编码该dna内切核酸酶的核酸和该grna的脂质纳米颗粒。106.如权利要求101
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105中任一项所述的方法，其中向该细胞提供(c)的供体模板包括向该受试者施用在aav载体中编码的供体模板。107.如权利要求69
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106中任一项所述的方法，其中该细胞是肝细胞。108.如权利要求69
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107中任一项所述的方法，其中该编码合成fviii蛋白的核酸序列在该受试者的肝脏中表达。109.一种治疗受试者的血友病a的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求63
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68中任一项所述的细胞。110.如权利要求109所述的方法，其中该细胞对该受试者来说是自体的。111.如权利要求110所述的方法，该方法进一步包括从该受试者获得生物样品，其中该生物样品包含肝脏细胞，并且其中该细胞由该肝脏细胞制备。112.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1
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28中任一项所述的系统的一种或多种要素，该试剂盒进一步包含使用说明书。113.一种包含编码合成fviii蛋白的多核苷酸序列的核酸，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。114.如权利要求113所述的核酸，其中该b结构域替代物包含0至6个n
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连接的糖基化位点。
115.如权利要求113所述的核酸，其中该b结构域替代物包含0至3个n
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连接的糖基化位点。116.如权利要求113所述的核酸，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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369、371和373中任一个的氨基酸序列。117.如权利要求116所述的核酸，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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364、371和373中任一个的氨基酸序列或其与seq id no:362
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364、371和373中的任一个具有至少80％同一性的变体。118.如权利要求116所述的核酸，其中该b结构域替代物包含seq id no:362
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363、371和373中任一个的氨基酸序列。119.如权利要求113
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118中任一项所述的核酸，其中该编码合成fviii蛋白的多核苷酸序列经过密码子优化以在宿主细胞中表达。120.如权利要求113
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119中任一项所述的核酸，其中与编码fviii的野生型核酸序列相比，该编码合成fviii蛋白的多核苷酸序列包含降低含量的cpg二核苷酸。121.如权利要求120所述的核酸，其中该编码合成fviii蛋白的多核苷酸序列不含cpg二核苷酸。122.如权利要求113
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121中任一项所述的核酸，其中该核酸是病毒载体。123.如权利要求122所述的核酸，其中该病毒载体是aav载体。124.一种增加受试者中的fviii量的方法，该方法包括：向该受试者中的细胞提供以下物质，其中该受试者具有第一fviii血清水平：(a)包含与宿主细胞基因座互补的间隔区序列的grna或编码该grna的核酸；(b)dna内切核酸酶或编码该dna内切核酸酶的核酸；以及(c)包含编码合成fviii蛋白的核酸序列的供体模板，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。125.如权利要求124所述的方法，其中该第一fviii血清水平低于约0.40iu/ml。126.如权利要求125所述的方法，其中该第一fviii血清水平低于约0.05iu/ml。127.如权利要求125所述的方法，其中该第一fviii血清水平低于约0.01iu/ml。128.如权利要求1
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28中任一项所述的系统用于治疗血友病a的用途。129.如权利要求1
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28中任一项所述的系统用于制造用于治疗血友病a的药物的用途。130.如权利要求63
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68中任一项所述的细胞用于治疗血友病a的用途。131.如权利要求63
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68中任一项所述的细胞用于制造用于治疗血友病a的药物的用途。132.如权利要求112所述的试剂盒用于治疗血友病a的用途。133.如权利要求112所述的试剂盒用于制造用于治疗血友病a的药物的用途。134.如权利要求113
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123中任一项所述的核酸用于治疗血友病a的用途。135.如权利要求113
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123中任一项所述的核酸用于制造用于治疗血友病a的药物的用途。136.一种合成fviii蛋白，其中该合成fviii蛋白包含b结构域替代物，其中该b结构域替代物包含0至9个n
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连接的糖基化位点且长度为3至约40个氨基酸。
技术总结
本文在一些实施例中提供了用于离体或体内治疗受试者的血友病A的材料和方法。本文在一些实施例中还提供了用于将编码具有B结构域替代物的合成FVIII的编码序列敲入基因组中的材料和方法。材料和方法。
技术研发人员：A.R.布鲁克斯
受保护的技术使用者：拜耳医药保健有限责任公司
技术研发日：2020.04.15
技术公布日：2021/11/26