作为止血剂的自组装纳米纤维

1.本文描述的主题总体上涉及聚电解质领域，并且具体涉及一种用于抑制从出血部位过度失血的组合物。


背景技术：

2.过度失血是士兵和平民死亡的主要原因之一。除了主要器官损伤外，许多人仅仅因为过度失血而死亡。据医生说，几乎80％的军人在受伤后半小时内因大量失血而死亡。平民也是这样的情况。大约50％的事故受害者在接受适当治疗前仅因巨量失血而死亡(heiskell等人，blood clotters,police maagzine,2004)。因此，促进在更短时间内抑制过度失血的研究工作是解决这一相关问题的福音。
3.血液有其自身的复杂凝结过程，所述复杂凝结过程由独特的外在和内在途径组成。因此，每当有小切口时，血液会自行凝块并防止进一步出血，但是在深度切口的情况下，血液不会自行凝块。由于这个问题，应该有一种外部组分，所述外部组分可帮助血液的自凝块机制并促进快速止血，从而防止失血。
4.已经研究了几种不同形式的材料来有效控制出血。事实上，市场上已经有各种各样的材料可用，但是这些材料中的大多数材料在其效率和价格方面都有其自身的缺陷。例如，quickclot
tm
在应用时诱发温度升高，hemcon
tm
的成本非常高，而xstat如果留在体内会引起异物反应。此外，这些凝血剂中的大多数凝血剂的高成本是阻碍它们广泛使用的另一个缺点。
5.吸收性生物材料仅通过吸收血液和渗出物来赋予部分止血。纤维素、氧化纤维素、氧化再生纤维素和基于淀粉的绷带都属于这一类。已经开发了各种基于吸收机制的产品，例如haemocer
tm plus
tm
、arista
tm
、perclot
tm
和starsil hemostatic powders
tm
。基于淀粉的快速溶胀多孔高吸水性水凝胶(fspsh)也有报道(j biomater sci polym ed.2015；26:1439
‑
1451)。revmedx
tm
的x
‑
stat
tm
是基于吸收机制的(j spec oper med.2016；16:19
‑
28)。它已被开发用于深伤口，例如枪伤。然而，由于它是基于木浆的，所以如果留在体内，则它可能会引起严重的异物反应。
6.由于纤维蛋白在稳定凝块的形成中起着至关重要的作用，所以纤维蛋白、纤维蛋白原和凝血酶已被用于止血效应。与吸收性敷料相比，基于纤维蛋白的敷料已表现出优异的止血性能(j trauma inj infect crit care.2008；64:75
‑
80)。像tachocomb
tm
和tachosil
tm
的产品是基于纤维蛋白的止血剂的几个示例。
7.近年来，也努力开发这种凝血蛋白的重组形式(clin ther.2009；31:32
‑
41)。一个这类实例是临床批准的recothrom
tm
，其为完全重组的人凝血酶(nat biotechnol.2008；26:250
‑
250)。纤维蛋白敷料具有降低死亡率的巨大潜力。
8.考虑到目前的情况，存在与容易获得的成本有效的凝血剂相关联的挑战。此外，来源于动物(牛、猪)或人类混合血液的纤维蛋白带来了免疫原性和病毒污染的附加风险。此外，由于在应用前需要重构，所以这些绷带不能在紧急情况下使用。
9.因此，迫切需要一种成本有效、容易获得、免疫原性风险较小、没有病毒污染并且可以在紧急情况下使用的出血控制剂。


技术实现要素：

10.在本公开的一个方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。
11.在本公开的第二方面中，提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包含：(i)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(ii)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，所述方法包括：(a)使所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分的第一水溶液与所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分的第二水溶液接触，以获得水性混合物；(b)处理所述水性混合物以获得悬浮粒子；(c)使所述悬浮粒子与去溶剂化剂接触，以获得悬浮液；以及(d)干燥所述悬浮液以获得所述组合物。
12.在本公开的第三方面中，提供了一种包含组合物的止血制品，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。
13.在本公开的第四方面中，提供了一种抑制从出血部位失血的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物或如本文所述的止血制品；以及(b)将所述组合物施加至出血部位以抑制从所述出血部位失血。
14.在本公开的第五方面中，提供了所述组合物用于抑制从出血部位失血的用途，所述组合物包含：(i)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(ii)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。
15.在本公开的第六方面中，提供了包含组合物的止血制品用于抑制从出血部位失血的用途，所述组合物包含：(i)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(ii)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。
16.参考以下描述和所附权利要求书，将更好地理解本发明主题的这些和其他特征、方面和优点。提供此发明内容是为了以简化形式介绍一些概念。该发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
附图说明
17.参考附图描述了详细描述。在整个说明书中相同的数字用于指代不同附图的类似特征和部件。
18.图1示出了根据本公开的实施方案制备组合物的工艺步骤。
19.图2示出了根据本公开的实施方案的本公开的组合物分别在较低和较高放大倍数下的fe
‑
sem图像，指示了纳米纤维的直径，其中所述组合物分别具有重量比为30:70的酪蛋白和壳聚糖(ca30ch70 pec粉末)(a、b)、重量比为50:50的酪蛋白和壳聚糖(ca50ch50粉末)(c、d)和重量比为70:30的酪蛋白和壳聚糖(ca70ch30粉末)(e、f)。
20.图3示出了根据本公开的实施方案的ca30 ch70、ca50ch50和ca70ch30的表面电荷。
21.图4示出了根据本公开的一个实施方案，分别用较低和较高放大倍率的ca30ch70(a、b)、ca50ch50(c、d)、ca70ch30(e、f)和celox(g、h)的pec粉末样品处理的血凝块的fe
‑
sem图像。
22.图5示出了根据本公开的实施方案的ca30ch70、ca50ch50、ca70ch30和celox的ldh活性。
23.图6示出了根据本公开的实施方案的ca30ch70、ca50ch50、ca70ch30和celox的凝血酶原时间。
具体实施方式
24.本领域的技术人员将会意识到，本公开还可以进行除了具体描述的变化和修改之外的变化和修改。应当理解的是，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有此类步骤、特征、组合物和化合物，以及任何或更多此类步骤或特征的任何和所有组合。
25.为了方便起见，在进一步描述本公开之前，本文描述了说明书和示例中采用的某些术语。这些定义应该根据本公开的其余部分来阅读，并被本领域的技术人员理解。本文所用的术语具有本领域的技术人员认可和已知的含义，然而，为了方便和完整性，下面阐述特定术语及其含义。
26.冠词“一”和“一个(种)”用于指代一个或多个(即，至少一个(种))该冠词的语法对象。
27.术语“包括”和“包含”以包含性的、开放的意义使用，意味着可以包括附加的元件。它并非旨在被解释为“仅由
……
组成”。
28.在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包含”的变体将被理解为暗示包括所叙述的元件或步骤或元件或步骤组，但不排除任何其他元件或步骤或元件或步骤组。
29.术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
30.比率、浓度、量和其他数字数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解的是，此类范围格式仅为了方便和简洁起见而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括作为范围的上下限而明确叙述的数值，而且还包括包含在该范围内的所有单独数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，20
‑
200的直径范围应解释为包括30和76，并且还包括子范围，例如35
‑
93、21
‑
64、35
‑
90等等。
31.术语“至少一个(种)”用于表示一个(种)或多个(种)，并且因此包括单独的组分以及混合物/组合。
32.术语“纳米纤维”表示直径在纳米范围内的纤维。
33.术语“聚电解质复合物(polyelectrolyte complex)”或“pec”描述了两种聚合物之间形成的复合物，其中至少一种聚合物是聚阳离子的，并且另一种聚合物是聚阴离子的。
34.术语“伤口部位”或“伤口”描述了任何动物或人类身体上受伤或已经经历导致失血的物理创伤的任何部位。本公开旨在涵盖如本文所述的组合物(纳米纤维)在任何动物或
人或任何活生物体的需要任何种类的干预以阻止失血的伤口部位上的施加。
35.术语“血液相容性”描述了红细胞或血液与任何底物的相容性，或者在目前情况中与pec的相容性。
36.术语“抗微生物剂、生长因子、抗炎剂、抗组胺剂、含铜或银离子的化合物”用于描述本领域的技术人员已知的广泛类别的众所周知的组分。
37.术语“出血(haemorrhaging)”是指过度失血。如果一个部位上发生了过度失血，则该部位被称为出血部位。
38.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文中所描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。本文提到的所有出版物都以引用方式并入本文。
39.本公开的范围不受本文所述的特定实施方案的限制，所述特定实施方案仅旨在用于例示目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
40.为了解决与现有止血剂相关联的问题，本公开提供了一种组合物，所述组合物是包含酪蛋白和壳聚糖的纳米纤维聚电解质复合物。该组合物是促进有效止血的自组装重构纳米纤维聚电解质复合物。根据本公开，组合物(纳米纤维pec)已经通过自组装过程制造，所述组合物已被确定为合适的止血剂。纳米纤维通常使用相分离、自组装和电纺丝来制造。在这些技术中，电纺丝已成为最优选的方法，因为各种聚合物阵列可用于制造纳米纤维。然而，电纺丝的垫的缠结纤维结构限制了它们以粉末形式用于止血应用。静电纺丝法的另一个挑战是实现高通量。在本公开中，已经使用自组装方法制造了具有不同表面电荷的短纳米纤维。这种方法允许生产纳米纤维粉末，所述纳米纤维粉末可以很容易地放大规模以用于商业目的。
41.本公开提供了由聚阳离子聚合物和蛋白质(聚阴离子形式)组成的出血控制剂的开发，所述出血控制剂导致形成平均纤维直径小于200纳米的纳米纤维，其中这些纳米纤维已经通过自组装方法开发，所述自组装方法产生非常高的产量并且易于转化成工业生产。如本公开中所公开的组合物具有几种应用，即，控制由任何种类的事故、手术或身体自身生理引起的出血。所述组合物在枪伤、刀伤、临床伤口、手术后切口、伤口敷料等情况下也非常有效，直接作为粉末、贴剂、凝胶或绷带。除此之外，所述组合物可用作伤口敷料材料，用于医疗植入物和装置的涂层，并与绷带结合使用。
42.如本公开中所公开的组合物提供了纤维直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维粉末。它能够使致命伤害在20秒内凝血和几乎瞬间停止表面撕裂、畸变、切口等中的出血。本公开还提供了已经通过自组装方法完成的上述生物材料的制造方法。
43.所公开的组合物(纳米纤维聚电解质复合物)可以通过在室温(例如20
‑
25℃)下制备聚阳离子生物材料(例如明胶、葡聚糖、去乙酰化形式的几丁质或环糊精)和聚阴离子生物材料(例如透明质酸、藻酸盐、酪蛋白、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、硫酸软骨素、果胶、多聚半乳糖醛酸、黄原胶、肝素或它们的钠盐或钾盐或钙盐或衍生物)的储备溶液来制造。将主要组分的储备溶液以所需的重量比混合在一起。用具有低表面张力的有机溶剂，诸如甲醇、乙醇、叔丁烯醇、丙酮或己烷代替水来洗涤主要成分的混合物。然后通过在热表面上快速干燥来蒸发有机溶剂，以产生直径在20
‑
200纳米范围内的纳米纤维聚阳离子复合物。聚阳离子
生物材料和聚阴离子生物材料可以以8:2至2:8范围内的重量比混合。聚阳离子生物材料，例如明胶、葡聚糖、去乙酰化形式的几丁质或环糊精或它们的衍生物，可以从各种商业来源获得，所述各种商业来源包括但不限于例如以下来源：sigma
‑
aldrich(mo,usa)、hi
‑
media(mumbai,india)和loba chemie(mumbai,india)。明胶、葡聚糖、去乙酰化形式的几丁质或环糊精或它们的衍生物可以用作聚阳离子，例如其中出于改变溶解度或其他物理化学性质的目的而改变了乙酰化百分比或缩短了聚合物长度的衍生物。可以使用天然聚阴离子，例如酪蛋白、透明质酸、藻酸盐、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、硫酸软骨素、果胶、多聚半乳糖醛酸、黄原胶、肝素或它们的钠盐或钾盐或钙盐。抗微生物剂、生长因子、清创剂等也可以加入制备的纳米纤维聚电解质复合物以开发具有止血性质的伤口敷料。因此，应该很好地理解，本文提到的一些特征可以与现有技术的任何其他特征组合使用。然而，本文所公开的具体实施方案实际上是本发明的优选实施方案。这些特征是不可或缺或必不可少的。
44.本公开涵盖组合物(纳米纤维聚电解质复合物粉末)的制备，所述组合物具有小于100纳米的直径，并且在从浅到深伤口和轻微到严重损伤范围内的任何种类的致命损伤的情况下能够在不到20秒内快速凝血，并且在由于医疗原因而上升的情况下几乎是瞬间的。在因枪击、刀刺、意外创伤、车祸等造成的外伤的情况下，本公开有助于受害者有机会到达护理点而不损失致命量的血液。在导致严重出血的损伤情况下，使用如本文所述的此类出血控制剂(止血剂)将是高度有益的。
45.所公开的组合物(纳米纤维聚电解质复合物)是生物相容的、可生物降解的，并且当施加至出血表面(例如伤口)时，它吸收大量流体并导致血液凝块，而不会导致伤口部位过度脱水。聚电解质是大分子，所述大分子当溶于特定ph的极性溶剂如水中时会呈现净正电荷或负电荷。当带相反电荷的聚电解质与彼此接触时，它们形成聚电解质复合物或以其他方式称为聚盐。用于形成聚电解质复合物的驱动力是带相反电荷的聚合物之间的熵和强静电引力。当带负电的基团接近带正电的基团时，它们开始彼此吸引，并且形成了离子交联的材料。交联是指将一条聚合物链连接至另一个聚合物的键。在一些交联剂的存在下，来自相同或不同链的负官能团被朝向带正电荷的官能团吸引。这种交联现象也取决于ph。例如，在本实施方案中，只有当复合物的ph保持在适合纳米纤维形成的范围内时，才能形成纳米纤维。超过特定ph值，则纤维形成变少并且更多的粒子形成发生。当这种交联化合物与血液接触时，它迫使血细胞结合或被捕获到基底的表面上，从而帮助它们形成网，所述网导致了强斑块形成。
46.根据实施方案中的一个实施方案，将两种生物材料储备溶液混合在一起。聚阳离子，例如去乙酰化形式的几丁质和聚阴离子，例如酪蛋白，被用作用于形成纳米纤维聚电解质复合物的主要组分。复合物的形成是自发的，并伴随着抗衡离子的释放。所述处理是完全基于水的，并且不需要任何有毒溶剂。
47.一旦形成聚电解质复合物，就在制造方法的下一步骤中引入水替代剂(water replacing agent)(去溶剂化剂)。这种水替代剂在开发干燥的纳米纤维聚电解质复合物粉末中起着关键作用。在优选实施方案中，它允许纳米纤维不聚集在一起形成团聚物。当水分子被所述试剂完全替代并被加热时，上述试剂蒸发，留下纳米孔和纤维结构，此继而增加了纳米纤维的表面体积比。这种增加的表面体积比(urface
‑
to
‑
volume ratio)导致了纳米纤维样品的更高吸收性质。在本文中，用具有低表面张力的有机溶剂(去溶剂化剂)例如甲醇、
乙醇、丁醇、丙酮或己烷洗涤所制备的聚电解质复合物(本公开的组合物)以取代水分子，这稍后有助于在干燥过程期间产生孔和纤维结构。根据本公开，叔丁醇提供了最佳结果，并且所得的最终纤维复合物显示出纤维直径小于200nm的纳米结构。
48.可以使用聚阳离子生物材料，包括但不限于明胶、葡聚糖、去乙酰化形式的几丁质、环糊精或聚l
‑
赖氨酸。在本公开中，脱乙酰化形式的几丁质(壳聚糖)给出了最佳结果。
49.可以使用聚阴离子生物材料，包括但不限于酪蛋白、透明质酸、藻酸盐、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、硫酸软骨素、果胶、多聚半乳糖醛酸、黄原胶、肝素或它们的钠盐或钾盐或钙盐。在本公开中，已经使用了酪蛋白，并且它给出了最佳结果。
50.所公开的组合物(纳米纤维聚电解质复合物)可以制成粉末形式、凝胶形式或液体形式。此外，本公开不限于仅由多糖和蛋白质组成的聚电解质复合物，此外，其他止血剂例如生物止血剂、生物活性玻璃、分子筛材料、凝血酶、纤维蛋白、其他类似材料或前述与本实施方案的组合也在本公开的范围内。
51.一些实施方案的任何其他黏粒或其他凝血剂或材料可以与本实施方案一起加入，或者可以结合使用，这可以导致本公开的组合物的功效提高。实施方案中的一些实施方案可涉及将几种材料添加或整合到本公开中，以用于维持或改善受伤区域处的无菌环境。例如，可以使用抗炎剂、抗真菌剂、抗生素、抗组胺、抗微生物剂、银离子或含铜化合物、上述和类似其他材料的组合。此外，一些不同的材料可以与本实施方案合并，以向本实施方案并入疼痛缓解性质。根据损伤的性质，生物止血材料，例如人血清白蛋白、牛凝血酶、钙、人凝血酶(h凝血酶)、rh凝血酶、因子xiii、因子viia、重组因子xiii(r因子xiii)、前列腺素
‑
2a、血栓素a2、表皮生长因子、肿瘤坏死因子(tnf)、血小板衍化生长因子、tnf
‑
α、转化生长因子(transforming growth factor，tgf)、冯
·
维勒布兰德因子(von willebrand factor)、tgf
‑
α、tgf
‑
β、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、角化细胞生长因子、青霉素、甲氧西林、氨苄西林、阿莫西林、克拉维酸、clavamox、氨曲南、链霉素、亚胺培南、卡那霉素、杆菌肽、妥布霉素、万古霉素、多粘菌素、庆大霉素、克林霉素、红霉素、两性霉素、利福平、制霉菌素、四环素、多西环素、强力霉素、氯霉素、纤维蛋白、凝血酶、抗坏血酸、芦丁、氨甲环酸、上述或类似材料的组合可用于本实施方案，以提供附加止血功能。此外，在创伤部位具有所需效应的植物来源的试剂可用于本实施方案，可以使用例如光果甘草(glycyrrhiza glabra)、百里香(thymus vulgaris)、高良姜(alpinia officinarum)、葡萄(vitis vinifera)和大荨麻(urtica dioica)、非洲紫葳(newbouldia laevis)(叶)、塞内加尔番荔枝(annona senegalensis)(叶)、心叶藤(cissampelos mucronata)(地上部分)、无根藤(cassytha filiformis)(地上部分)等。
52.在本公开中用于水替换的材料，也可以是一些其他不同的醇。水替代材料可以是任何其他单一醇、多于一种醇的混合物、水和醇的混合物、或上述物质的组合。在用乙醇反复洗涤后，将聚电解质复合物和乙醇悬浮液于70℃至110℃内的温度干燥，这导致了纳米纤维材料形成。本公开不限于此方面，此外，平均纤维直径在100纳米内的其他纳米纤维制备方法也在本实施方案的范围内。
53.几种类型的材料及其不同的组合可用于实现本公开的组合物。材料可以是由单根或多根纤维组成的纤维状的，所述纤维如：缝线或绳；网格；带(gaze)；织造或非织造的；吸收性或非吸收性的；紧密织造的纺织品；多孔或实心的；海绵等。在一些实施方案中，可以使
用前述的合并，并且它们可以以不同的方式彼此联接。在一些实施方案中，纤维也可以涂有一种或多种添加剂以进行改进。
54.在一些实施方案中，几种盐可以与聚电解质复合物(例如氯化钙、三聚磷酸钠、相同类型的盐或上述的组合)合并。
55.最后，为了获得产物，可以获取不同的方式。在一些实施方案中，专用干燥器可用于干燥，以获得最终产物。专用干燥机是指市场上可购得的干燥机，例如喷雾干燥机、真空干燥机、滚筒干燥机或类似类型的机器，以解决干燥目的或上述的组合。在一些实施方案中，最终产物可以分两步实现，即干燥基底，和在干燥后将干燥的基底转化成所需的形式。干燥可以通过几种方式实现：这包括提高基底周围空气的温度，使得水替代剂完全蒸发。在一些实施方案中，可以通过任何手段直接加热基底。在一些实施方案中，冻干过程可用于干燥目的。可以改变或调节干燥参数，例如温度、真空水平、持续时间和/或压力来生产产物。将干燥的基底转化成所需的形式可以通过不同的方式实现。在一些实施方案中，可以执行干燥基底的粉碎或研磨，或者可以获取不会明显降低基底的功效的类似种类的其他方法。在一些实施方案中，加热和研磨可以同时进行。
56.在本公开中，所公开的止血剂对一种或多种液体如水、血液等具有非常高的吸收能力。在一些实施方案中，基底可具有其初始干重的至少4倍至10倍或甚至更多倍的吸收能力。
57.为了证明本公开中所述的组合物的能力，使用fesem(field emission scanning electrom microscope)表征所述组合物。使用全血凝血测定对本实施方案中描述的基底的凝血能力进行评估。在本实施方案中为了确保基底的细胞粘附能力，通过使用fesem来查询具有基底的血液。本公开还包括基底承受损伤部位处的血压的能力。这是指基底在施加后将留在受伤区域的施加处，并且不会被血流冲走。它将在那里形成坚硬的斑块，从而导致没有进一步的出血。
58.所公开的纳米纤维聚电解质复合物通常可以放置在合适的密封包装(例如由合适的材料制成的小袋或小瓶，或者包含这种包装并任选包含印刷的使用说明的套件)中，并且在进一步包装之前进行灭菌，如果需要的话还可以带有描述材料或套件在出血治疗中的正确使用的印刷的使用说明。合适的灭菌方法包括电离辐射(例如γ辐射)或乙醇处理。
59.所公开的纳米纤维聚电解质复合物可以直接施加(例如对于干净的伤口)或作为多步骤治疗方案的一部分(例如对于感染的伤口)。多步骤处理方案可包括或之后是清洁和消毒步骤，之后是所公开的纳米纤维聚电解质复合物的施加。
60.在本公开的实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。在另一个实施方案中，组合物是直径在30
‑
175nm范围内的纳米纤维的形式。在又一个实施方案中，组合物是直径在20
‑
150nm范围内的纳米纤维的形式。在替代实施方案中，组合物是直径在20
‑
100nm范围内的纳米纤维的形式。在又一个实施方案中，组合物是直径在20
‑
80nm范围内的纳米纤维的形式。
61.在本公开的实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且其中所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴
离子组分具有相对于所述组合物重量百分比在20
‑
80％范围内的酪蛋白。在另一个实施方案中，所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分具有相对于组合物重量百分比在30
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70％范围内的酪蛋白。
62.在本公开的实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且其中所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分具有相对于所述组合物重量百分比在20
‑
80％范围内的壳聚糖。在另一个实施方案中，所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分具有相对于组合物重量百分比在30
‑
70％范围内的壳聚糖。
63.在本公开的一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且其中所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分和所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分的重量比是2:8至8:2。在另一个实施方案中，包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分和包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分的重量比在3:7至7:3的范围内。
64.在本公开的一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且其中所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分还包含至少一种选自以下的材料：透明质酸、藻酸盐、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、硫酸软骨素、果胶、多聚半乳糖醛酸、黄原胶、肝素、它们的衍生物和它们的组合。
65.在本公开的一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且其中所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分还包含至少一种选自以下的材料：明胶、葡聚糖、环糊精、它们的衍生物和它们的组合。
66.在本公开的一个实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分具有相对于所述组合物重量百分比在20
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80％范围内的酪蛋白，并且所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分具有相对于所述组合物重量百分比在20
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80％范围内的壳聚糖，并且所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分还包含至少一种选自以下的材料：透明质酸、藻酸盐、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、硫酸软骨素、果胶、多聚半乳糖醛酸、黄原胶、肝素、它们的衍生物和它们的组合，并且所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分还包含至少一种选自以下的材料：明胶、葡聚糖、环糊精、它们的衍生物和它们的组合。
67.在本公开的一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且所述组合物还包含至少一种选自以下的添加剂：抗微生物剂、生长因子、清创剂、抗组胺剂、抗炎剂、铜盐、银盐，以及它们的组合。
68.在本公开的一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包含酪蛋
白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，并且所述组合物还包含至少一种选自以下的添加剂：人血清白蛋白、牛凝血酶、钙、人凝血酶(h凝血酶)、rh凝血酶、因子xiii、因子viia、重组因子xiii(r因子xiii)、前列腺素
‑
2a、血栓素a2、表皮生长因子、肿瘤坏死因子(tnf)、血小板衍化生长因子、tnf
‑
α、转化生长因子(tgf)、冯
·
维勒布兰德因子、tgf
‑
α、tgf
‑
β、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、角化细胞生长因子、青霉素、甲氧西林、氨苄西林、阿莫西林、克拉维酸、clavamox、氨曲南、链霉素、亚胺培南、卡那霉素、杆菌肽、妥布霉素、万古霉素、多粘菌素、庆大霉素、克林霉素、红霉素、两性霉素、利福平、制霉菌素、四环素、多西环素、强力霉素、氯霉素、纤维蛋白、凝血酶、抗坏血酸、芦丁、氨甲环酸、光果甘草提取物、百里香提取物、高良姜提取物、葡萄提取物和大荨麻提取物、非洲紫葳(叶)提取物、塞内加尔番荔枝(叶)提取物、心叶藤(地上部分)提取物、无根藤(地上部分)提取物、以及它们的组合。
69.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包含：(i)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(ii)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式，所述方法包括：(a)使所述包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分的第一水溶液与所述包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分的第二水溶液接触，以获得水性混合物；(b)处理所述水性混合物以获得悬浮粒子；(c)使所述悬浮粒子与去溶剂化剂接触，以获得悬浮液；以及(d)干燥所述悬浮液以获得所述组合物。
70.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中第一水溶液包含相对于所述第一水溶液在0.5
‑
4％w/v范围内的酪蛋白，并且第二水溶液包含相对于所述第二水溶液在0.5
‑
3.5％w/v范围内的壳聚糖。在另一个实施方案中，第一水溶液包含相对于所述第一水溶液在1
‑
3.5％w/v范围内的酪蛋白，并且第二水溶液包含相对于所述第二水溶液在1
‑
3％w/v范围内的壳聚糖。
71.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中去溶剂化剂选自：叔丁醇、乙醇、丙酮以及它们的组合。
72.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中第一水溶液和第二水溶液在水中制备。
73.在本发明的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中悬浮粒子的ph在4至10的范围中。
74.在本发明的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中处理水性混合物包括均质化步骤。
75.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中使包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分的第一水溶液与包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分的第二水溶液接触是以滴加方式进行的。
76.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分还包含至少一种选自以下的材料：透明质酸、藻酸盐、硫酸葡聚糖、角叉菜胶、硫酸软骨素、果胶、多聚半乳糖醛酸、黄原胶、肝素、它们的衍生物和它们的组合，并且包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分还包含至少一种选自以下的
材料：明胶、葡聚糖、环糊精、它们的衍生物和它们的组合。
77.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中所述方法还包括加入至少一种选自以下的添加剂：抗微生物剂、生长因子、清创剂、抗组胺剂、抗炎剂、铜盐、银盐、和它们的组合。
78.在本公开的一个实施方案中，提供了一种制备如本文所述的组合物的方法，其中所述方法还包括加入至少一种选自以下的添加剂：人血清白蛋白、牛凝血酶、钙、人凝血酶(h凝血酶)、rh凝血酶、因子xiii、因子viia、重组因子xiii(r因子xiii)、前列腺素
‑
2a、血栓素a2、表皮生长因子、肿瘤坏死因子(tnf)、血小板衍化生长因子、tnf
‑
α、转化生长因子(tgf)、冯
·
维勒布兰德因子、tgf
‑
α、tgf
‑
β、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、角化细胞生长因子、青霉素、甲氧西林、氨苄西林、阿莫西林、克拉维酸、clavamox、氨曲南、链霉素、亚胺培南、卡那霉素、杆菌肽、妥布霉素、万古霉素、多粘菌素、庆大霉素、克林霉素、红霉素、两性霉素、利福平、制霉菌素、四环素、多西环素、强力霉素、氯霉素、纤维蛋白、凝血酶、抗坏血酸、芦丁、氨甲环酸、光果甘草提取物、百里香提取物、高良姜提取物、葡萄提取物和大荨麻提取物、非洲紫葳(叶)提取物、塞内加尔番荔枝(叶)提取物、心叶藤(地上部分)提取物、无根藤(地上部分)提取物、以及它们的组合。
79.在本公开的一个实施方案中，提供了一种包含组合物的止血制品，所述组合物包含：：(a)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(b)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。在另一个实施方案中，止血制品是选自以下的形式：绷带、喷雾剂、粉末、糊剂和泡沫。
80.在本发明的一个实施方案中，提供了一种抑制从出血部位失血的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物或如本文所述的止血制品；以及(b)将所述组合物或所述止血制品施加至出血部位以抑制从所述出血部位失血。
81.在本发明的一个实施方案中，提供了一种抑制从出血部位失血的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物或如本文所述的止血制品；以及(b)将所述组合物或所述止血制品施加至出血部位以抑制从所述出血部位失血，其中所述组合物在施加后不到50秒内抑制失血。在另一个实施方案中，所述组合物在施加的12
‑
30秒内抑制失血。
82.在本发明的一个实施方案中，提供了一种抑制从出血部位失血的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；以及(b)将所述组合物施加至出血部位以抑制从所述出血部位失血。
83.在本公开的一个实施方案中，提供了一种抑制从出血部位失血的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的止血制品；以及(b)将所述止血制品施加至出血部位以抑制从所述出血部位失血。
84.在本公开的一个实施方案中，提供了所述组合物用于抑制从出血部位失血的用途，所述组合物包含：(i)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(ii)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。
85.在本公开的一个实施方案中，提供了包含组合物的止血制品用于抑制从出血部位失血的用途，所述组合物包含：(i)包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和(ii)包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。
86.尽管已经参考特定实施方案描述了主题，但是这种描述不意味着以限制的意义来解释。参考主题的描述时，所公开的实施方案的各种修改以及主题的替代实施方案对于本领域的技术人员来说将变得显而易见。因此设想，在不脱离如所定义的本主题的精神或范围的情况下，可以进行此类修改。
87.实施例
88.现在将使用工作实施例来说明本公开，所述工作实施例旨在说明本公开的工作，而并非旨在限制性地暗示对本公开范围的任何限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实践所公开的方法和组合物，但是本文描述了示例性的方法、装置和材料。应当理解的是，本公开不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以适用。
89.本部分举例说明了本公开的各种实施方案。它明确地提供了实施方案的优点。
90.实施例1
91.本公开中所公开的组合物的制备
92.使用壳聚糖(聚阳离子组分)和酪蛋白(聚阴离子组分)来制备本公开中所公开的组合物。壳聚糖(>75％的去乙酰化，分子量是3800
‑
20000gmol
‑1)和酪蛋白(分子量是4,23,644gmol
‑1)是从himedia laboratories获得的。在水中制备0.5％(w/v)至3.5％(w/v)的壳聚糖溶液(第二水溶液)，并且在水中制备0.5％(w/v)至4％(w/v)的酪蛋白溶液(第一水溶液)。然后将第二水溶液加入到第一水溶液中，以获得水性混合物。出于实验目的，制备了三种不同比率的混合物。所制备的样品被称为：ca30ch70(重量比为30:70的酪蛋白:壳聚糖)；ca50ch50(重量比为50:50的酪蛋白:壳聚糖)；和ca70ch30(重量比为70:30的酪蛋白:壳聚糖)。上述样品的三种组合物的细节描述于下表1中。
93.独立地处理针对三种不同比率获得的水性混合物。所述处理涉及均质化过程，并将ph调节在6
‑
10之间的范围内以获得悬浮粒子。以重复方式用醇洗涤悬浮粒子，以确保粒子中没有任何水分子。将粒子进一步溶于去溶剂化剂(或任何沸点低于水的液体)中以获得悬浮液。为了干燥悬浮液，采用手动干燥工序。将悬浮液喷洒在通风良好的区域中的热板或经加热的铝箔(50℃
‑
80℃)上，以干燥悬浮液。在干燥步骤之后，获得了粉末形式的本公开中所公开的组合物，所述组合物可以收集在试管中以用于进一步的研究和/或应用。通过使用振动器使组合物的碎片进一步变得更细。所公开的方法导致获得三种不同样品形式的组合物；如表1所描绘的样品1(ca30ch70)、样品2(ca50ch50)和样品3(ca70ch30)。图1中概述了根据本公开获得组合物的方法。
94.作为本公开的一部分，样品4至6也是通过调整上述段落中所提到的某些步骤制备的。遵循相同的工艺步骤，直到获得不同样品中的悬浮粒子的步骤，如表1中所述，所述不同样品具有不同比率的壳聚糖和酪蛋白。悬浮粒子不用乙醇洗涤，并且随后不溶于任何去溶剂化剂中。将悬浮粒子在热板上独立干燥，以获得样品4(ca30ch70_膜)、样品5(ca50ch50_膜)和样品6(ca70ch30_膜)。样品4至6是膜形式，而样品1至3是细粉形式。样品4至6由厚度为约10微米的膜组成。
95.表1：
[0096][0097]
实施例2
[0098]
场发射扫描电子显微镜(fesem)成像研究
[0099]
为了分析从实施例1获得的样品1至3的组合物的纳米级结构，执行不同样品的fesem成像。在fesem成像中，观察到所有样品都具有纤维直径在20nm至200nm范围内的纳米纤维结构。图2示出了如本文所获得的组合物的纳米纤维结构。图2a和图2b示出了由样品1(ca30ch70)代表的组合物的纳米纤维。图2c和图2d示出了由样品2(ca50ch50)代表的组合物的纳米纤维。图2e和图2f示出了由样品3(ca70ch30)代表的组合物的纳米纤维。可以得出结论，根据本公开，所有样品1至3显示出直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维。
[0100]
实施例3
[0101]
ζ电位分析
[0102]
ζ电位值的测量提供了关于组合物的纳米纤维的表面上存在的电荷的可测量信息。图3表示实施例1中描述的不同组成比率的组合物的纳米纤维的ζ电位。样品1(由30％酪蛋白和70％壳聚糖组成的纳米纤维)显示出为11.39
±
7.19mv的ζ电位。随着pec中壳聚糖量的减少，这种电荷继续减少。由70％酪蛋白组成的pec纳米纤维显示出为
‑
14.83
±
11.95mv的ζ电位。ζ电位测量表明纳米纤维的表面电荷与所述纳米纤维的组成相关。表面电荷随着壳聚糖浓度的增加而增加。图3描绘了样品1(ca30ch70)、样品2(ca50ch50)和样品3(ca70ch30)的表面电荷。
[0103]
实施例4
[0104]
全血凝血测定
[0105]
通过全血凝血测定测量实施例1中描述的组合物(样品1至6)的血液凝血能力。将200μl血液放入微量离心管(埃彭道夫管)中，同时向其中加入20μl的0.2m氯化钙溶液和相应的样品。针对样品中的每个样品重复该过程。通过振荡试管以查看血液是否有任何运动来确保血液凝血，并记录时间。为了与样品进行比较，采用celox
tm
作为参考。表2中提到了不同样品的相应凝血时间。
[0106]
表2：
[0107][0108]
从表2可以观察到，与商业产品(celox
tm
)相比，样品1至3显示出更短的凝血时间。此外，与样品4至6(189秒、212秒、233秒)相比，样品1至3还显示出分别为15秒、14秒和13秒的更短凝血时间，其中，样品4至6是膜形式并且具有如实施例1中所述的不同处理步骤。因此，可以理解的是，与没有纳米纤维并且以膜的形式存在的样品4至6相比，样品1至3的纳米纤维形态(如实施例2所示，纳米纤维直径在20
‑
200的范围内)对于获得更短的凝血时间至关重要。
[0109]
实施例5
[0110]
细胞粘附测试
[0111]
为了研究细胞粘附质量，如实施例4所述，将样品1至3用于使血液样品凝块。在全血样品形成凝块后，通过将凝块的样品浸入福尔马林中12小时来固定所述凝块的样品。在此之后，取出固定的凝块并浸入叔丁醇中12小时。然后将样品在真空干燥器中干燥。然后通过fesem成像研究凝块样品。图4示出了fesem成像测试结果。
[0112]
图4描绘了分别使用较低和较高放大倍率的样品1—ca30ch70(a、b)、样品2—ca50ch50(c、d)和样品3—ca70ch30(e，f)和celox
tm
(g、h)获得的血凝块的fe
‑
sem图像。这些图表明所有样品都促进细胞粘附，而不管所述样品的组成和表面电荷如何。
[0113]
实施例6
[0114]
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)测试
[0115]
通过细胞裂解时释放的ldh的量来量化由样品1至3代表的组合物的纳米纤维表面上的血小板粘附。用1％tritonx100溶液裂解细胞。这项测试背后的概念是每个细胞都含有ldh，因此溶液中的ldh活性越高，意味着粘附至纤维表面的血小板的数量就越多。
[0116]
图5描绘了表示执行ldh测试之后ldh的量的图表。从图(图5)中可以清楚地看出，与市售产品相比，样品1至3具有明显更高的细胞粘附能力，并且有更多数量的血小板附着至所述样品的表面。这可能是由于样品的表面电荷而发生的。表面电荷在细胞粘附中起重要作用，因为它影响血小板和血浆蛋白。带电表面也有助于形成凝血酶原酶复合物(活化的f
‑
v和f
‑
x)和内在的tenase复合物(活化的f
‑
viii和f
‑
ix)，这导致了血液凝块。因此，该实
施例再次证明了以样品1至3的形式表示的本公开的组合物作为止血剂是有利的。
[0117]
实施例7
[0118]
溶血测定
[0119]
执行样品1至3的溶血性质以评估样品是否与血细胞相容。为了执行该测试，制备0.9％的nacl溶液。通过以4:5的比率加入nacl溶液来稀释经抗凝化的血液。将等量的样品放入装有6ml nacl溶液的15ml聚丙烯试管中，并于37℃保持30分钟。在孵育后，在每个聚丙烯试管中，加入0.5ml稀释的血液，并于37℃保持2小时。还制备了阳性对照和阴性对照。阳性对照是通过加入6ml nacl溶液、0.5ml稀释的血液和0.01m hcl溶液制成的。阴性对照是通过加入6ml nacl溶液和0.5ml稀释的血液制成的。在孵育2小时后，所有样品以2000g离心20分钟。最后，获得上清液在540nm处的od值。一式三份地执行该测试。所测量的样品1、样品2和样品3的溶血百分比数据在下表3中提及。与celox
tm
相比，所有样品都表现出明显更低的溶血。因此，可以理解的是，根据本公开的组合物使用起来更安全，并且对红血细胞无害，并且与血液相容。
[0120]
表3：
[0121]
样品编号样品名称溶血(％)1ca30ch701.49
±
0.342ca50ch501.82
±
0.133ca70ch303.06
±
0.30
‑
celox
tm
10.00
±
2.80
[0122]
实施例8
[0123]
凝血酶原时间测试
[0124]
凝血酶原测试(prothrombin test，pt)是显示样品是否有凝血级联的任何外源性途径的指标。它表示外源性途径启动的持续时间。pt缩短表明凝血效率提高。这种pt测试也可以称为inr(国际归一化比率)测试。这种inr测试实际上标准化了从凝血酶原时间测试获得的结果，而没有考虑测试方法。
[0125]
凝血酶原或f
‑
ii是实时凝血因子之一。pt测试对于检查血液中是否存在5种不同的凝血因子(f
‑
i、f
‑
ii、f
‑
v、f
‑
vii、和f
‑
x)以及它们是否正常工作非常重要。
[0126]
通常pt值在2至3之间。如果低于2，则该pt值表示血液具有高凝血倾向，并且如果高于3，则pt值表示血液具有延迟凝血倾向。图6描绘了样品1(ca30ch70)、样品2(ca50ch50)、样品3(ca70ch30)和celox的凝血酶原测试。可以观察到，在所有样品1至3的情况下，inr的值在2与3之间。因此，可以理解的是本公开的组合物以自然方式启动了血液的凝块。
[0127]
本公开的优点
[0128]
本公开公开了一种组合物，所述组合物包含：包含酪蛋白或其衍生物的聚阴离子组分；和包含壳聚糖或其衍生物的聚阳离子组分，其中所述组合物是直径在20
‑
200nm范围内的纳米纤维的形式。本文所述的组合物是快速起效的，并且在抑制失血方面显示出几乎瞬时的作用。如测定所描述，所述组合物显示出高水平的血液凝块。所述组合物是可生物降解并且环境友好的。此外，由于使用了生物聚合物如酪蛋白和壳聚糖，因此没有明显的副作用。用于制备本公开的组合物的方法是容易和可扩展的，并且提供了高通量的结果。