用于可调谐磁性纳米颗粒的组合物和方法与流程

用于可调谐磁性纳米颗粒的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年12月5日提交的美国临时申请号62/943,927的权益。前述申请的全部内容以其整体通过引用并入本文。
技术领域
3.本公开提出具有可调谐磁性和可调谐表面修饰(例如胺基修饰)的纳米颗粒组合物、制备这些纳米颗粒组合物的方法、和使用这些纳米颗粒组合物的方法。纳米颗粒组合物可包括氯化亚铁、氯化铁、葡聚糖、或其任何组合。


背景技术：

4.使用医学成像来收集关于受试者的信息。在一些类型的成像中，将造影剂施用至受试者。造影剂选择性地结合至受试者中感兴趣的生物颗粒或其它结构。然后，使用医学成像装置检测该造影剂，并将收集的信息用于使图像显影等。
5.尽管即使从单个医学图像中也可获得许多信息，但是需要多种成像技术以提供具有高时空分辨率、高检测灵敏度、和断层成像能力的综合定量诊断信息。在过去，这往往意味着对于每种所执行的模态(modality)，需要对单个受试者施用多种造影剂。
6.已经开发出适合于通过各种类型的模态进行检测的多模态造影剂。这些多模态造影剂通常包括多个实体，各个实体可由单独的模态检测。通常使用化学连接基团将多个实体连接在一起，以制备各自包含所有相应的多个实体的颗粒。然而，化学连接基团在细胞和组织中或随时间推移通常具有变化的稳定性，意味着一些实体可能会分离，从而降低这些造影剂的质量和有用性。
7.为了避免将多个实体化学连接在一起的问题，一些人尝试形成具有核-壳结构的造影剂。然而，迄今为止，开发可临床应用的核-壳结构存在显著的问题。此外，目前可用的颗粒缺少使用靶向部分进行的可调谐表面官能化和可调谐磁性。
8.因此，需要一种临床上适用、并在表面官能化和物理性质(例如磁性)方面提供设计的灵活性的多模态造影剂。


技术实现要素：

9.本公开的某些方面涉及一种纳米颗粒组合物，其包括：磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒包含：氯化铁、氯化亚铁、或其组合；和用一个或更多个胺基官能化的葡聚糖涂层，其中所述一个或更多个胺基的数量范围为约5至约1000。
10.在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约50重量(wt)％至约100重量％的氯化铁和约0重量％至约50重量％的氯化亚铁。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约0.65g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁。在一些实施方案中，一个或更多个氨基的数量范围为约5至约150。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括约50重量％至约100重量％的氯化铁。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括约1.2g的氯化铁。在一些实施方案中，纳米颗
粒组合物不包含氯化亚铁。在一些实施方案中，一个或更多个氨基的数量范围为约246至约500。
11.在另一方面，本公开涉及一种纳米颗粒组合物，其包括：磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒包含：氯化铁、氯化亚铁、或其组合；和葡聚糖涂层，其中磁性纳米颗粒的非线性指数范围为约6至约40。
12.在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约50重量(wt)％至约80重量％的氯化铁和约50重量％至约20重量％的氯化亚铁氯化亚铁。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约0.54g的氯化铁和约0.2g的氯化亚铁。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒的非线性指数范围为8至14。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约0重量(wt)％至约50重量％的氯化铁和约100重量％至约50重量％的氯化亚铁氯化亚铁、或约80重量％至约[100重量％]的氯化铁和约0重量％至约20重量％的氯化亚铁氯化亚铁。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约0.54g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒的非线性指数范围为约8至约67。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒的非线性指数为约67。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒具有直径为约3nm至约50nm的铁氧化物晶核，并且磁性纳米颗粒的流体动力学直径为约7nm至约200nm。
[0013]
在一些实施方案中，磁性纳米颗粒的多分散性为约0.1至约0.25。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量范围为约1kda至约15kda的葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量为约10kda的葡聚糖。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物进一步包括附接至葡聚糖涂层的表面的药物有效载荷(payload)。在一些实施方案中，药物有效载荷是缀合至一个或更多个胺基的寡核苷酸。在一些实施方案中，药物有效载荷为药物、抗体、生长因子、核酸、核酸衍生物、核酸片段、蛋白质、蛋白质衍生物、蛋白质片段、糖、多糖片段、糖衍生物、糖苷、糖苷片段、糖苷衍生物、成像造影剂、或其任何组合。
[0014]
另一方面，本公开涉及一种药物组合物，其包括本公开的任何纳米颗粒组合物和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
[0015]
另一方面，本公开涉及在有需要的受试者中对组织靶位点进行成像的方法，所述方法包括：将治疗有效量的本公开的任何纳米颗粒组合物施用至受试者的身体、身体部分、组织、细胞、或体液的一部分处的至少组织靶位点；向磁性纳米颗粒组合物和组织靶位点施加能量；检测纳米颗粒组合物和组织靶位点的信号；和基于检测到的信号获得组织靶位点的图像。
[0016]
在一些实施方案中，成像是磁共振成像、磁性颗粒成像、或其组合，并且能量是磁场。在一些实施方案中，疾病是癌症，并且组织靶位点是肿瘤。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物在受试者的靶位点处累积。
[0017]
另一方面，本公开涉及用于在有需要的受试者中使疾病成像的方法的本公开的任何组合物。
[0018]
另一方面，本公开涉及制备本公开的任何纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：将葡聚糖溶解于水中；用环氧氯丙烷使葡聚糖交联；制备氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、或其组合；通过向葡聚糖添加氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、或其组合来制备混合物；在搅拌并使混合物进行冰浴的同时向混合物添加碱；和使混合物经历约75℃至约90℃的温度，其中添加碱的步骤防止形成铁氧化物晶体、铁氧化物水合物、或其组合，和其中混合物包含约50重
量(wt)％至100重量％的氯化铁和约0重量％至50重量％的氯化亚铁。
[0019]
另一方面，本公开涉及制备本公开的任何纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：将葡聚糖溶解于水中；用环氧氯丙烷使葡聚糖交联；制备氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、或其组合；通过向葡聚糖添加氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、或其组合来制备混合物；在搅拌并使混合物进行冰浴的同时向混合物添加碱；和使混合物经历约75℃至约90℃的温度，其中添加碱的步骤防止形成铁氧化物晶体、铁氧化物水合物、或其组合，和其中混合物包含50重量％至约80重量％的氯化铁和约50重量％至约20重量％的氯化亚铁。
[0020]
术语“磁性”用于描述响应于磁场的组合物。磁性组合物(例如，任何本文所述的纳米颗粒组合物)的非限制性实例可包括顺磁性、超顺磁性、铁磁性、或抗磁性的材料。磁性组合物的非限制性实例包含选自以下的组的金属氧化物：磁铁矿；铁氧体(例如，锰、钴和镍的铁氧体)；fe(ii)氧化物；和赤铁矿、及其金属合金。另外的磁性材料记载于本文中并且是本领域已知的。
[0021]
术语“抗磁性”用于描述具有小于或等于1的相对磁导率并且被磁场排斥的组合物。
[0022]
术语“顺磁性”用于描述仅在外加磁场的存在下产生磁矩的组合物。
[0023]
术语“铁磁性”或“铁磁性的”用于描述对磁场的敏感性强并且在去除外加磁场后能够保留磁性(磁矩)的组合物。
[0024]
术语“纳米颗粒”意指直径在约2nm至约200nm之间(例如，在10nm和200nm之间、在2nm和100nm之间、在2nm和40nm之间、在2nm和30nm之间、在2nm和20nm之间、在2nm和15nm之间、在100nm和200nm之间、和在150nm和200nm之间)的物体。纳米颗粒的非限制性实例包括本文所述的纳米颗粒。
[0025]
术语“磁性纳米颗粒”意指磁性的(如本文所定义)纳米颗粒(例如，任何本文所述的纳米颗粒)。磁性纳米颗粒的非限制性实例如本文所述。本领域已知另外的磁性纳米颗粒。
[0026]
术语“核酸”意指任何单链或双链多核苷酸(例如，dna或rna、cdna、半合成或合成来源)。术语核酸包括含有至少一个修饰的核苷酸(例如，含有碱基中的修饰和/或糖中的修饰)和/或连接两个核苷酸的磷酸二酯键中的修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，核酸可包含至少一种锁核酸(lna)。核酸的非限制性实例如本文所述。本领域已知核酸的另外的实例。
[0027]
术语“成像”意指使用生物物理学技术(例如，电磁能量吸收和/或发射)使受试者的至少一种组织可视化。成像的非限制性实施方案包括磁共振成像(mri)、x射线计算机断层扫描、和光学成像。
[0028]
如本文所用的术语“受试者”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防、和/或治疗目的，可向其施用本公开的组合物或方法的任何哺乳动物(例如，人或兽医受试者，例如，犬、猫、马、牛、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、或兔)。受试者对于特定疾病或病况可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗、或者在由受过训练的专业人员护理。
[0029]
除非上下文另外明确指出，否则如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该(the)”包括多个指代对象。因此，例如，提及“一种纳米颗粒”包括纳米颗粒的混合物，提及“一个纳米颗粒”包括两个或更多个这样的纳米
颗粒的混合物，等。
[0030]
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当数值表示为近似值时，通过使用前述“约”，将理解，该特定值形成另一个实施方案。将进一步理解，各个范围的端点相对于另一个端点和独立于另一个端点都是重要的。
[0031]
本公开的某些实施方案包括使用任何纳米颗粒组合物用于在有需要的受试者中治疗疾病、预防疾病、诊断疾病、和/或使疾病成像的方法。目前需要可调谐和改进的纳米颗粒组合物，其可以满足成功到达人体内的靶位点用于治疗和/或成像目的的必需要求。本公开的纳米颗粒组合物和使用纳米颗粒组合物的方法解决了上述必需要求。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的关键物理特性(例如，胺化(amination)和磁强度)可通过调节某些组分的浓度(例如，氯化亚铁或氯化铁的浓度)来微调。在一些实施方案中，可以在物理特性(例如，胺化、磁强度、尺寸、和多分散性)不变的情况下扩增(scale-up)纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可具有长期稳定性(例如，至少长达6个月)。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒可以在水性介质中通过沉淀法来制备，该方法是环境友好的并且比其它合成方法更便宜。
[0032]
在一些实施方案中，使用本文所述的纳米颗粒组合物的方法可以预防、治疗、减少和/或消除与疾病(例如，癌症)相关的症状。在一些实施方案中，使用本文所述的纳米颗粒组合物的方法可有助于靶位点(例如，肿瘤)的成像。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可用于在有需要的受试者中同时使靶位点(例如，肿瘤)成像和治疗靶位点(例如，肿瘤)。
[0033]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物使得能够将有效载荷(例如，寡核苷酸)持续递送至靶位点(例如，肿瘤)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物适于将有效载荷(例如，寡核苷酸)递送至药物递送载体通常难以到达的靶位点(例如，肿瘤或肿瘤核心(tumor core))。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是生物相容性的，并且可以以约0.25小时至约24小时的半衰期保留在血液循环中。
[0034]
当在本公开中以范围描述数值时，包括端点。此外，应理解，无论是否明确说明了具体数值或具体子范围，该描述包括此类范围内的所有可能的子范围的公开内容、以及落在此类范围内的具体数值。
[0035]
本公开的其它特征和优点将从以下详细描述和附图以及从权利要求书变得显而易见。
[0036]
本文描述了本公开的特征的各种实施方案。然而，应理解，此类实施方案仅是通过实例的方式提供的，并且在不偏离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以进行许多变化、改变、和替换。还应理解，本文所述的具体实施方案的各种替代方案也在本公开的范围内。
[0037]
除非另外限定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法、和实例仅是说明性的，并且不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献以其整体通过引用并入本文。在冲突的情况下，包括定义的本说明书将控制。
[0038]
本发明的一个或更多个实施方案的细节记载于附图和以下描述中。本发明的其它
特征和优点将从以下详细描述和附图以及从权利要求书变得显而易见。
附图说明
[0039]
图1显示在制备本公开的纳米颗粒的方法期间用于葡聚糖溶解的装置的一个实例。
[0040]
图2显示在制备本公开的纳米颗粒的方法期间用于葡聚糖溶解的装置的一个实例。
[0041]
图3显示如通过紫外/可见光(uv/vis)光谱法测定的、暴露于6n-盐酸的胺化的葡聚糖包被的纳米颗粒的吸收光谱并监测该溶液。
[0042]
图4显示每个磁性纳米颗粒(mnp)具有约60-90个胺基的“条件1”纳米颗粒的尺寸特征；如通过动态光散射测定的，尺寸为约11.48纳米(nm)。
[0043]
图5显示每个mnp具有约250个胺基的“条件2”纳米颗粒的尺寸特征；如通过动态光散射测定的，尺寸为约15.6nm。
[0044]
图6显示如通过uv/vis光谱法测定的、每个磁性纳米颗粒(mnp)具有约250个胺基的“条件2”纳米颗粒的吸收光谱。
[0045]
图7显示如通过uv/vis光谱法测定的、每个磁性纳米颗粒(mnp)具有约60-90个胺基的“条件1”纳米颗粒和每个mnp具有约246-500个胺基的“条件2”纳米颗粒的吸收光谱。
[0046]
图8显示用于分析条件1mnp中寡核苷酸载荷的凝胶电泳的实例。通过改变每个纳米颗粒的寡核苷酸(oligo)与氨基之比，可以逐渐增加寡核苷酸/磁性纳米颗粒(oligo/mn)的数值。oligo/mn数值表示每个纳米颗粒的寡核苷酸的摩尔比。用64个胺/mnp测试寡核苷酸的数量，并且改变反应比以使寡核苷酸的载荷最大化。这些mnp通过表3中的条件(即，fe
3+
/fe
2+
比为1:1的mnp)并在过量氢氧化铵添加物的存在下合成。
[0047]
图9显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法(magnetic particle spectrometry)。作为磁性的主要标准，在具有所示配方的样品之间比较非线性指数。
[0048]
图10显示如通过动态光散射测定的，fe
3+
:fe
2+
比为1:1且非线性指数为12.1的实例纳米颗粒的平均纳米颗粒尺寸为约149.3nm并且标准偏差为0.9nm。
[0049]
图11显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法。根据表4中所示的“条件b”合成的纳米颗粒的非线性指数计算为9.7111。
[0050]
图12显示如通过动态光散射测定的，图11的纳米颗粒的平均纳米颗粒尺寸为约127.1nm并且标准偏差为0.21nm。
[0051]
图13显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法。根据表4中所示的“条件c”合成的纳米颗粒的非线性指数计算为8.8326。在合成后1个月进行该测定以检查纳米颗粒的稳定性。
[0052]
图15显示如通过动态光散射测定的，图14的纳米颗粒的平均纳米颗粒尺寸为约63.47nm并且标准偏差为0.61nm。
[0053]
图16显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法。根据表4中所示的“条件e”合成的纳米颗粒的非线性指数计算为14.3731。
[0054]
图17显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法。在贮存约1个月后，根据表4中所示的“条件e”合成的纳米颗粒的非线性指数计算为15.6437，以检查纳米颗粒
的稳定性。
[0055]
图18显示如通过动态光散射测定的，在贮存约2个月后，图16的纳米颗粒的平均纳米颗粒尺寸为约181.83nm并且标准偏差为1.0nm。
[0056]
图19显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法。根据表4中所示的“条件f”合成的纳米颗粒的非线性指数为14.806。
[0057]
图20显示用于对纳米颗粒的磁性进行定量的磁性粒子光谱法。在贮存约1个月后，图19的纳米颗粒的非线性指数计算为14.2168。
[0058]
图21显示如通过动态光散射测定的，在贮存约2个月后，图19的纳米颗粒的平均纳米颗粒尺寸为约185.97nm并且标准偏差为0.25nm。
[0059]
图22是示出用胺基对实例纳米颗粒进行表面修饰用于悬浮稳定和用聚乙二醇-2000(peg-2000)对实例纳米颗粒进行表面修饰用于增强血液循环的示意图。
具体实施方式
[0060]
发现本文所述的磁性纳米颗粒适于具有可调谐磁性和表面官能化。本文提供了具有这些特征的磁性纳米颗粒以及制备这些磁性纳米颗粒的方法、和通过施用这些磁性纳米颗粒在有需要的受试者中治疗疾病、预防疾病、和/或使疾病成像的方法。
[0061]
纳米颗粒组合物
[0062]
本文提供了包括磁性纳米颗粒的纳米颗粒组合物，所述磁性纳米颗粒包括氯化铁、氯化亚铁、或其组合、和葡聚糖涂层。在一些实施方案中，组合物可包含两种或更多种不同的本文所述的纳米颗粒组合物的混合物。在一些实施方案中，组合物包含至少一种具有可调谐表面官能化的磁性纳米颗粒、和至少一种具有可调谐磁性的磁性纳米颗粒。
[0063]
可调谐胺基官能化
[0064]
在一些实施方案中，磁性纳米颗粒可以用一个或更多个胺基官能化。在一些实施方案中，官能化发生于磁性纳米颗粒的表面。在一些实施方案中，一个或更多个胺基共价连接至葡聚糖涂层。在一些实施方案中，一个或更多个胺基取代葡聚糖涂层的一个或更多个羟基。在一些实施方案中，一个或更多个胺基的数量基于氯化铁、氯化亚铁、或其组合的浓度可调谐。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约5至约1000个胺基。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约5至25、25至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、450至500、500至550、550至600、600至650、650至700、700至750、750至800、800至850、850至900、900至950、或950至1000个胺基。
[0065]
在一些实施方案中，磁性纳米颗粒可包含磁性材料(例如，氯化铁和/或氯化亚铁)的核。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约0.60g至约0.70g的氯化铁和约0.3g至约0.5g的氯化亚铁。在一些实施方案中，用约5至150个胺基使包含约0.60g至约0.70g的氯化铁和约0.3g至约0.5g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约60至90个胺基使包含约0.65g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约5至150个胺基使包含约0.65g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约1至150个胺基使包含约0.65g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约至少1至10个胺基、10至20个胺基、约20至30个胺基、约30至40个胺基、约40至50个胺基、约50至60个胺基、约60至70个胺
基、约70至80个胺基、约80至90个胺基、约90至100个胺基、约100至110个胺基、约110至120个胺基、约120至130个胺基、约130至140个胺基、或约140至150个胺基使包含约0.65g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物官能化。
[0066]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约1g至约1.4g的氯化铁。在一些实施方案中，用约246至500个胺基使包含约1g至约1.4g的氯化铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约246至500个胺基使包含约1.2g的氯化铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约246至500个胺基官能化的纳米颗粒组合物不包含氯化铁。在一些实施方案中，用约200至600个胺基使包含约1.2g的氯化铁的纳米颗粒组合物官能化。在一些实施方案中，用约至少200至250个胺基、250至300个胺基、约300至350个胺基、约350至400个胺基、约400至450个胺基、约450至500个胺基、约500至550个胺基、约550至600个胺基或更多个来使包含约1.2g的氯化铁的纳米颗粒组合物官能化。
[0067]
因此，在一些实施方案中，缀合至葡聚糖涂层的胺基的数量可以通过控制用于制备磁性纳米颗粒的氯化铁和氯化亚铁的浓度来微调。
[0068]
可调谐磁性
[0069]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括具有基于氯化铁、氯化亚铁、或其组合的浓度可调谐的磁强度的磁性纳米颗粒。
[0070]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物在每个mnp的总铁中包含约0.1％至约99.9％的三价铁离子和约99.9％至约0.1％的亚铁离子。在一些实施方案中，包含约60％至约80％的氯化铁和约20％至约40％的氯化亚铁的纳米颗粒组合物具有比氯化亚铁量高于约80％的纳米颗粒组合物更强的磁性。在一些实施方案中，包含约70％的三价铁离子和约30％g的亚铁离子的纳米颗粒组合物具有比亚铁离子量高于约30％的纳米颗粒组合物更强的磁性。
[0071]
在一些实施方案中，磁性纳米颗粒的磁强度可以通过借助磁性粒子光谱法测定非线性指数(nli)来量化。nli是用于确定颗粒是否适用于磁性颗粒成像或依赖于磁性纳米颗粒的非线性行为的其它技术的标准。nli可以通过计算f1与f3的比来确定，所述f1与f3是磁性粒子光谱仪系统中的参数。f1/f3比较颗粒相对于外部磁场的磁化强度。f1是傅里叶分解(fourier decomposition)后外部磁激发(“驱动”)频率的幅度(magnitude)，并且f3是指驱动频率的第三个谐波的幅度(例如，如果驱动频率是25khz，f1是25khz，f3是75khz)；因此，f1和f3是用频率的幅度来计算的，并且傅里叶分解的过程使得可以分析时域中的非线性相关性。如果颗粒具有与磁性粒子光谱仪使用的外部磁场成线性比例的磁性，则其非线性指数会非常大。如果颗粒具有与磁性粒子光谱仪使用的外部磁场成线性比例的磁性，则其非线性指数会非常大。相对于借助外部磁场磁化时的磁强度，无外部磁场的颗粒的磁导率(图9、11、13、14、16、17、19、和20中的“磁强度”或“dm/dh”)越大，非线性指数将越小(例如，它会更接近1，方波磁化响应(square wave magnetization response)的nli)。相反地，颗粒的初始磁强度相对于其完全磁化状态越相似，非线性指数将越大。由于nli与特定的激发条件相关，因此在本文呈现的所有测量中都使用了相同的外场(峰值幅度为4.5mt/μ0的正弦场)，尽管方法和分析可类似地应用于其它操作条件。
[0072]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli的范围为约6至约40。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli的范围为约6至约70。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli的范围为约8.5至约14.8。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli的范围为约8至约14。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli约为6。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli约为8。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli约为14。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli约为67。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的nli的范围为6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、17至18、18至19、19至20、20至30、30至40、40至50、50至60、或60至70。在一些实施方案中，包含约0.54g的氯化铁和约0.2g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物的非线性指数范围为约8.5至约14.8。在一些实施方案中，包含约0.54g的氯化铁和约0.2g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物的非线性指数约为12。
[0073]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含约80％至约100％的氯化铁和约20％至约0％的氯化亚铁。在一些实施方案中，包含约0％至约50％的氯化铁和约100％至约50％的氯化亚铁的纳米颗粒组合物具有比氯化亚铁量低于约0.4g的纳米颗粒组合物更弱的磁性。在一些实施方案中，包含约0.54g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物具有比氯化亚铁量低于约0.2g的纳米颗粒组合物更弱的磁性。
[0074]
在一些实施方案中，包含约0.54g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物的非线性指数范围为约50至约120。在一些实施方案中，包含约0.54g的氯化铁和约0.4g的氯化亚铁的纳米颗粒组合物的非线性指数约为67。
[0075]
因此，在一些实施方案中，磁性纳米颗粒的磁性(例如，磁强度)可通过控制用于制备磁性纳米颗粒的氯化铁和氯化亚铁的浓度来微调。
[0076]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的铁浓度的范围为约8μm至约217μm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的铁浓度的范围为约8μm至约15μm、约15μm至约25μm、约25μm至约50μm、50μm至约60μm、约60μm至约70μm、约70μm至约80μm、80μm至约90μm、约90μm至约100μm、约100μm至约110μm、110μm至约120μm、约120μm至约130μm、约130μm至约140μm、140μm至约150μm、约150μm至约160μm、约160μm至约170μm、170μm至约180μm、约180μm至约190μm、约190μm至约200μm、200μm至约210μm、约210μm至约220μm。
[0077]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的铁浓度的范围为约1mg/ml至约25mg/ml。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的铁浓度的范围为约1mg/ml至约5mg/ml、约5mg/ml至约10mg/ml、约10mg/ml至约15mg/ml、约15mg/ml至约20mg/ml、或约20mg/ml至约25mg/ml。
[0078]
其它物理性质
[0079]
在一些实施方案中，用于药物递送的纳米颗粒的关键性质包括纳米颗粒的可生物降解性、毒性谱、和药代动力学/药效学。纳米颗粒的组成和/或尺寸是其生物学命运的关键决定因素。例如，较大的纳米颗粒通常由肝脏摄取和降解，而较小的纳米颗粒(直径《30nm)通常循环较长时间(有时在人体中超过24小时血液半衰期)并在淋巴结和具有高渗透性脉管系统的器官的间质如肿瘤和转移瘤中累积。
[0080]
在一些实施方案中，磁性纳米颗粒可具有约2纳米(nm)至约200nm之间的直径(例如，约2nm至约10nm之间、约10nm至约30nm之间、约5nm至约25nm之间、约10nm至约25nm之间、约15nm至约25nm之间、约20nm和约25nm之间、约25nm至约50nm之间、约50nm和约200nm之间、约70nm和约200nm之间、约80nm和约200nm之间、约100nm和约200nm之间、约140nm至约200nm之间、和约150nm至约200nm之间)，例如至少约2、5、10、15、20、25、50、70、80、100、120、125、140、或150nm，高达约10、20、25、30、50、75、100、150、200、或250nm。
[0081]
在一些实施方案中，本文提供的磁性纳米颗粒可以是球形或椭圆形，或者可以具
有无定形形状。在一些实施方案中，本文提供的磁性纳米颗粒的直径(纳米颗粒组合物的外表面上任意两点之间)可以在约2nm至约200nm之间(例如，约10nm至约200nm之间、约2nm至约30nm之间、约5nm至约25nm之间、约10nm至约25nm之间、约15nm至约25nm之间、约20nm至约25nm之间、约50nm至约200nm之间、约70nm至约200nm之间、约80nm至约200nm之间、约100nm至约200nm之间、约140nm至约200nm之间、和约150nm至约200nm之间)。在一些实施方案中，直径在约2nm至约30nm之间的磁性纳米颗粒集中(localize)至受试者中的肿瘤、淋巴结、和转移性病变。在一些实施方案中，直径在约40nm至约200nm之间的磁性纳米颗粒集中至肝脏。
[0082]
在一些实施方案中，本文提供的磁性纳米颗粒可具有约0.05至约0.25的多分散性指数(pdi)。pdi本质上表示给定样品内尺寸群体分布。pdi的数值的范围为0.0(对于粒径完全均匀的样品)至1.0(对于具有多个粒径群体的高度多分散样品)。在一些实施方案中，本文提供的磁性纳米颗粒的pdi可以为约0.050至0.100、约0.100至0.110、约0.110至0.120、约0.120至0.130、约0.130至0.140、约0.140至0.150、约0.150至0.160、约0.160至0.170、约0.170至0.180、约0.180至0.190、约0.190至0.200、约0.200至0.210、约0.210至0.220、约0.230至0.240、或约0.240至0.250。
[0083]
在一些实施方案中，磁性材料或颗粒可以包含响应于磁场的抗磁性材料、顺磁性材料、超顺磁性材料、或铁磁性材料。治疗性磁性纳米颗粒的非限制性实例包含含有选自以下物质的组的金属氧化物的磁性材料的核：磁铁矿；铁氧体(例如锰、钴和镍的铁氧体)；fe(ii)氧化物、和赤铁矿、及其金属合金。在本文所述方法的一些实施方案中，治疗性磁性纳米颗粒的位置或定位可以在受试者中成像(例如，在施用一种或更多种剂量的磁性纳米颗粒后，在受试者中成像)。
[0084]
聚合物涂层
[0085]
本文所述的磁性纳米颗粒在核磁性材料上(例如，在磁性材料的表面上)包含聚合物(例如，葡聚糖)涂层。聚合物材料可适于附接或偶联一种或更多种生物制剂(例如，如任何本文所述的核酸)。可以通过化学偶联(例如共价键)将一种或更多种生物制剂(例如，核酸)附接至聚合物涂层。
[0086]
用于合成铁氧化物纳米颗粒的方法包括，例如，物理方法和化学方法。例如，铁氧化物可以通过水溶液中fe
2+
盐和fe
3+
盐的共沉淀来制备，例如，如实施例1-8中所述。所得核由磁铁矿(fe3o4)、磁赤铁矿(γ-fe2o3)、或二者的混合物构成。水溶液中的阴离子盐含量(例如，氯化物、硝酸盐、硫酸盐等)、fe
2+
与fe
3+
之比、ph、和离子强度均在纳米颗粒的尺寸的控制中起作用。重要的是通过在如氮气或氩气等非活性气体下在无氧环境中进行反应来防止合成的纳米颗粒的氧化并保护它们的磁性。可以在共沉淀过程期间添加涂层材料以防止铁氧化物纳米颗粒聚集为微粒。本领域技术人员将理解，任何数量的已知表面涂层材料可用于使铁氧化物纳米颗粒稳定，其中包括合成的和天然的聚合物，如，例如，聚乙二醇(peg)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、脂肪酸、多肽、壳聚糖、明胶。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含peg。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含peg-2000。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含peg-1000、peg-3000、peg-3350、peg-4000、peg-6000、peg-8000、peg-12,000、peg-20,000、或其任何组合。
[0087]
在一些实施方案中，聚合物涂层是葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层共价连
接至磁性纳米颗粒。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量范围为约1千道尔顿(kda)至约15kda的葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量为约1kda的葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量为约5kda的葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量为约10kda的葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含分子量为约15kda的葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖涂层包含化学交联的葡聚糖，如实施例2中所述。可用于包被磁性材料的核的可选的合适聚合物包括但不限于：聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚醚氨基甲酸酯(polyetherurethane)、聚砜、氟化或氯化聚合物如聚氯乙烯、聚乙烯、和聚丙烯、聚碳酸酯、和聚酯。可用于包被磁性材料的核的聚合物的另外的实例包括聚烯烃，例如聚丁二烯、聚二氯丁二烯、聚异戊二烯、聚氯丁二烯(polychloroprene)、聚偏二卤乙烯(polyvinylidene halide)、聚偏二烯碳酸酯(polyvinylidene carbonate)、和聚氟化乙烯。包括苯乙烯/丁二烯、α-甲基苯乙烯/二甲基硅氧烷、或其它聚硅氧烷的许多共聚物也可用于包被磁性材料的核(例如，聚二甲基硅氧烷、聚苯基甲基硅氧烷、和聚三氟丙基甲基硅氧烷)。可用于包被磁性材料的核的另外的聚合物包括聚丙烯腈或含丙烯腈的聚合物，例如聚α-丙烯腈共聚物、醇酸树脂或萜类树脂、和聚亚烷基聚磺酸酯(polyalkylene polysulfonate)。
[0088]
药物有效载荷
[0089]
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物进一步包含药物有效载荷。在一些实施方案中，药物有效载荷可附接(例如，通过共价结合)至葡聚糖涂层的表面。在一些实施方案中，药物有效载荷是药物、抗体、生长因子、核酸、核酸衍生物、核酸片段、蛋白质、蛋白质衍生物、蛋白质片段、肽、小分子、或其任何组合。在一些实施方案中，药物有效载荷是缀合至聚合物涂层(例如，葡聚糖涂层)的一个或更多个胺基的寡核苷酸。在一些实施方案中，药物有效载荷是核酸。在一些实施方案中，核酸是单链或双链的。在一些实施方案中，核酸是反义rna、小干扰rna(sirna)、dna、微小rna模拟物(microrna mimic)、适体、或核酸酶。在一些实施方案中，核酸分子可包含至少一种修饰的核苷酸(含有修饰的碱基或糖的核苷酸)。在一些实施方案中，核酸分子可在磷酸酯(磷酸二酯)骨架中包含至少一种修饰。引入这些修饰可增加核酸分子的稳定性或改善核酸分子的杂交或溶解性。
[0090]
在一些实施方案中，药物有效载荷(例如，核酸)通过含有硫醚键或二硫键的化学部分附接至磁性纳米颗粒(例如，附接至磁性纳米颗粒的聚合物涂层)。在一些实施方案中，核酸通过含有酰胺键的化学部分附接至磁性纳米颗粒。可用于将核酸共价连接至磁性纳米颗粒的其它化学部分是本领域已知的。
[0091]
可以使用各种不同的方法将药物有效载荷共价连接至磁性纳米颗粒。在一些实施方案中，碳二亚胺用于将药物有效载荷附接至磁性纳米颗粒。
[0092]
药物组合物
[0093]
本文还提供了药物组合物，其包括本公开的任何纳米颗粒组合物和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的磁性纳米颗粒。两种或更多种(例如，两种、三种、或四种)本文所述的任何类型的磁性纳米颗粒可以以任何组合存在于药物组合物中。药物组合物可以以本领域已知的任何方式配制。
[0094]
将药物组合物配制成与其预期施用途径(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、或腹膜内)相容。组合物可包含无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)，固定油(fixed oil)，聚
乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂，抗细菌剂或抗真菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、和硫柳汞等，抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠，螯合剂如乙二胺四乙酸，缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐，和等渗剂如糖(例如，葡萄糖)，多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)，或盐(例如，氯化钠)，或其任何组合。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。可以配制组合物的制剂并将其封装在安瓿、一次性注射器、或多剂量小瓶中。根据需要(如在例如可注射制剂中)，可以通过例如使用诸如卵磷脂等涂层或表面活性剂来维持适当的流动性。纳米颗粒组合物的吸收可以通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长。可选地，可通过植入物和微囊化递送系统来实现控释，所述植入物和微囊化递送系统可包括可生物降解的生物相容性聚合物(例如，乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸)。可以将包含一种或更多种本文所述的任何磁性纳米颗粒的组合物以剂量单元形式(即，为了易于施用和剂量均匀，含有预定量的活性化合物的物理上离散的单元)配制以用于胃肠外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下、或腹膜内)施用。
[0095]
组合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物(例如，猴)中通过标准药学程序测定。可以例如确定ld50(对群体的50％致死的剂量)和ed50(在群体的50％中治疗有效的剂量)：治疗指数是ld50:ed50的比。优选表现出高治疗指数的药剂。当药剂表现出不希望的副作用时，应当注意使潜在损害最小化(即，减少不希望的副作用)。毒性和治疗功效可通过其它标准药学程序确定。
[0096]
从细胞培养分析和动物研究获得的数据可用于配制用于受试者(例如，人)的适当剂量的任何给定药剂。一种或更多种(例如，一种、两种、三种、或四种)磁性纳米颗粒(例如，本文所述的任何磁性纳米颗粒)的治疗有效量将是在患有癌症的受试者中减少癌细胞侵袭或转移、治疗受试者中的转移性癌症、使受试者中的转移性肿瘤尺寸减小或稳定、降低受试者中转移性肿瘤的生长速率、降低受试者(例如，人)中转移性癌症的一种或更多种症状的严重程度、频率、和/或持续时间、或减少受试者中转移性癌症的症状的数量(例如，与患有相同疾病但未接受治疗或接受不同治疗的对照受试者相比、或与治疗前的同一受试者相比)的量。
[0097]
本文所述的任何磁性组合物的有效性和剂量可由医护专业人员使用本领域已知的方法、以及通过观察受试者(例如，人)中转移性癌症的一种或更多种症状来确定。某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量和时机(例如，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及其它疾病的存在)。
[0098]
示例性剂量包括每千克受试者体重的毫克或微克量的本文所述的任何纳米颗粒组合物。虽然这些剂量覆盖了宽泛的范围，但是本领域普通技术人员将理解，包括本文所述的纳米颗粒组合物的治疗剂效力不同，并且有效量可以通过本领域已知的方法来确定。典型地，首先施用相对低的剂量，主治医护专业人员(在治疗性应用的情况下)或研究人员(在仍处于开发阶段时)可以随后逐渐增加剂量直至获得适当的反应。此外，应当理解用于任何特定受试者的具体剂量水平将取决于各种因素，包括所采用的具体化合物的活性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、和纳米颗粒组合物在体内的半衰期。
[0099]
药物组合物可与施用说明一起包含在容器、包装、或分配器中。
[0100]
合成方法
[0101]
在一些实施方案中，本文提供了制备本公开的任何纳米颗粒组合物的方法，如实施例1-8中详细描述的。在一些实施方案中，所述方法包括将葡聚糖溶解于水中，制备氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、或其组合。在一些实施方案中，所述方法包括通过向葡聚糖添加氯化亚铁溶液、氯化铁溶液、或其组合来制备混合物。
[0102]
在一些实施方案中，所述方法包括在搅拌并使混合物进行冰浴的同时向混合物添加碱。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加约10ml至15ml的碱。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加约25ml至30ml的碱。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加至少约10ml至15ml、15ml至20ml、20ml至25ml、25ml至30ml或更多的碱。在一些实施方案中，碱是氢氧化铵。在一些实施方案中，碱是氢氧化钠。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加约10ml的氢氧化铵。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加约15ml的氢氧化铵。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加约25ml的氢氧化铵。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物添加约30ml的氢氧化铵。
[0103]
在一些实施方案中，所述方法包括在搅拌并使混合物进行冰浴的同时向混合物添加氢氧化铵。在一些实施方案中，需要过量的氨或氢氧化铵以在葡聚糖涂层上羟基的相同位点处引入胺基。在一些实施方案中，所述方法包括向混合物(例如，纳米颗粒前体组合物)添加约60ml的氢氧化铵。在一些实施方案中，所述方法包括使混合物经受约75℃至约90℃的温度。在一些实施方案中，所述方法包括在添加氢氧化铵之后使混合物经受约75℃至约90℃的温度。在一些实施方案中，添加氢氧化铵的步骤防止形成铁氧化物晶体、铁氧化物水合物、或其组合。在一些实施方案中，添加氢氧化铵的步骤用一个或更多个胺基使葡聚糖涂层官能化。
[0104]
在一些实施方案中，所述方法包括用环氧氯丙烷使葡聚糖交联。环氧氯丙烷是一种可用于使葡聚糖聚合物骨架上的两个羟基交联的化学物质。在一些实施方案中，借助环氧氯丙烷的交联确保了铁氧化物核的表面上的葡聚糖涂层的化学稳定。在一些实施方案中，环氧氯丙烷可聚合以延长葡聚糖聚合物骨架上的羟基链，这可导致可被胺基取代的羟基增加。在一些实施方案中，向混合物添加氢氧化铵破坏了反应混合物中剩余的未反应的环氧氯丙烷。
[0105]
在一些实施方案中，可对本公开的任何纳米颗粒组合物进行扩增。例如，在一些实施方案中，所述方法进一步包括产生约21ml的第一最终体积的第一纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，第一纳米颗粒组合物(例如，小规模批次的磁性纳米颗粒)包括第一磁性纳米颗粒，其特征在于具有第一组物理性质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括产生至少大于约21ml的第二最终体积的第二纳米颗粒组合物(例如，大规模批次的磁性纳米颗粒)。在一些实施方案中，第二纳米颗粒组合物的第二最终体积为约20ml至约30ml、约30ml至约40ml、约40ml至约50ml、约50ml至约60ml、约60ml至约70ml、约70ml至约80ml、约80ml至约90ml、约90ml至约100ml、约100ml至约100ml、或约110ml至约120ml。
[0106]
在一些实施方案中，第二纳米颗粒组合物包括第二磁性纳米颗粒，其特征在于具有第二组物理性质。在一些实施方案中，第一组物理性质和第二组物理性质大致相同。在一些实施方案中，可以在不改变其物理性质(例如，尺寸、pdi、或nli)的情况下扩增本公开的任何纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，可以在不改变其物理性质的情况下扩增本公开
的任何纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，第一物理性质和第二物理性质包括直径、磁强度、多分散性指数、表面电荷、非线性指数值、pdi值、或其任何组合。
[0107]
在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物稳定至少约1天至约6个月以上。如本文所用的，术语“稳定”或“稳定性”表示如从制备磁性纳米颗粒或组合物之日至它们在贮存后作为样品之日测量和比较的，磁性纳米颗粒或组合物的同一样品的任何物理性质均没有变化。在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物稳定至少约1天至约5天、约5天至10天、约10天至约15天、约15天至30天、约30天至约40天、约40天至50天、约50天至约60天、约3个月至约4个月、约4个月至约5个月、约5个月至约6个月、或更长。
[0108]
治疗方法
[0109]
在一些实施方案中，本文提供了在有需要的受试者中治疗疾病、预防疾病或使疾病成像的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的任何纳米颗粒组合物施用至受试者的身体、身体部分、组织、细胞、或体液的一部分处的至少一个靶位点。在一些实施方案中，本公开的任何纳米颗粒组合物用于在有需要的受试者中治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本公开的任何纳米颗粒组合物用于在有需要的受试者中使疾病成像(例如，通过磁共振成像(mri))的方法。在一些实施方案中，本文提供了减少(例如，显著的或可观察到的减少)受试者中的癌细胞侵袭或转移的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以足以减少受试者中的癌细胞侵袭或转移的量向受试者施用至少一种本文所述的纳米颗粒组合物。
[0110]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向磁性纳米颗粒组合物和靶位点施加能量。在一些实施方案中，能量是光能或磁能。例如，在一些实施方案中，施加能量的步骤可包括施加磁场或将已施用本文所述的任何纳米颗粒组合物的受试者暴露于用于磁共振成像的磁场。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物用于使受试者的身体、身体部分、组织、细胞、或体液的一部分成像。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可以治疗疾病、预防疾病(例如，通过能够检测处于早期的癌症来预防癌细胞的进一步转移)和/或使疾病成像。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病是转移性癌症。
[0111]
在一些实施方案中，靶位点是肿瘤位点。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物在受试者的靶位点处累积(例如，由于本公开的磁性纳米颗粒的尺寸)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用纳米颗粒组合物对靶位点进行成像。在一些实施方案中，使用磁共振成像来进行成像。
[0112]
在一些实施方案中，向磁性纳米颗粒组合物和靶位点施加能量的步骤是任选的步骤。例如，磁性组合物可以单独地用作治疗性组合物，而不是同时用作治疗性组合物和显像剂(例如，造影剂)。在一些实施方案中，磁性组合物单独地用作显像剂(例如，造影剂)，而不是同时用作治疗性组合物和显像剂。
[0113]
剂量、施用和组合物
[0114]
在本文所述的任何方法中，纳米颗粒组合物可由医护专业人员(例如，医师、医师的助手、护士、或实验室或临床工作人员)、受试者(即，自我施用)来施用。可以在临床环境中(例如，在诊所或医院)、在疗养院(assisted living facility)中、或在药房中进行施用。
[0115]
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，将纳米颗粒组合物施用至已诊断为患
有疾病(例如，癌症如原发性癌症或转移性癌症)的受试者。在一些实施方案中，受试者已诊断为患有转移性癌症。转移性癌症的非限制性实例包括乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌、和子宫癌。在一些非限制性实施方案中，受试者是男性或女性、成人、青少年、或儿童。受试者可能已经经历了癌症或转移性癌症(例如，淋巴结中的转移性癌症)的一种或更多种症状。受试者也可诊断为患有严重的或晚期癌症(例如，原发性癌症或转移性癌症)。在一些实施方案中，受试者可被鉴定为患有存在于至少一个淋巴结中的转移性肿瘤。在一些实施方案中，受试者可能已经历了淋巴切除术和/或乳腺切除术。
[0116]
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，对受试者施用至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、或30种)剂量的组合物，所述组合物含有至少一种(例如，一种、两种、三种、或四种)本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物。在本文所述的任何方法中，可将至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物)静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、或肌内施用至受试者。在一些实施方案中，将至少磁性颗粒或药物组合物直接施用(注射)至受试者的淋巴结中。
[0117]
在一些实施方案中，对受试者施用至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物)和至少一种另外的治疗剂。所述至少一种另外的治疗剂可以是化学治疗剂(例如，环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、戊柔比星(valrubicin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、他氟泊苷(tafluposide)、氮杂胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、氟脲嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、博莱霉素(bleomycin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、盐孢菌酰胺a(salinosporamide a)、全反式维甲酸、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、和长春瑞宾(vinorelbine))和/或镇痛剂(例如，对乙酰氨基酚(acetaminophen)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、塞来昔布(celecoxib)、丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺(butorphanol)、可待因(codeine)、氢可酮(hydrocodone)、氢吗啡酮(hydromorphone)、左啡诺(levorphanol)、哌替啶(meperidine)、美沙酮(methadone)、吗啡(morphine)、纳布啡(nalbuphine)、羟考酮(oxycodone)、羟吗啡酮(oxymorphone)、喷他佐辛(pentazocine)、丙氧芬(propoxyphene)、和曲马多(tramadol))。
[0118]
在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂和至少一种磁性纳米颗粒(例如，本文
所述的任何纳米颗粒组合物)以同一组合物(例如，同一药物组合物)施用。在一些实施方案中，使用不同的施用途径将至少一种另外的治疗剂和至少一种磁性纳米颗粒施用至受试者(例如，通过口服施用递送至少一种另外的治疗剂并通过静脉内施用递送至少一种磁性纳米颗粒)。
[0119]
在本文所述的任何方法中，至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物)和任选至少一种另外的治疗剂可以至少每周一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次、或每天三次)施用至受试者。在一些实施方案中，至少两种不同的纳米颗粒组合物以同一组合物(例如，液体组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种纳米颗粒组合物和至少一种另外的治疗剂以同一组合物(例如，液体组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种纳米颗粒组合物和至少一种另外的治疗剂以两种不同的组合物(例如，含有至少一种纳米颗粒组合物的液体组合物和含有至少一种另外的治疗剂的固体口服组合物)施用。在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂、或胶囊剂施用。
[0120]
在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂以缓释口服制剂施用。在一些实施方案中，可以在施用至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物)之前，将一种或更多种另外的治疗剂施用至受试者。在一些实施方案中，可以在施用至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何磁性颗粒或药物组合物)之后，将一种或更多种另外的治疗剂施用至受试者。在一些实施方案中，将一种或更多种另外的治疗剂和至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物)施用至受试者，使得受试者中一种或更多种另外的治疗剂和至少一种纳米颗粒组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物)的生物活性期存在重叠。
[0121]
在一些实施方案中，可在延长的时间段内(例如，在至少一周、两周、三周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、一年、两年、三年、四年、五年、或十年的时间段内)对受试者施用至少一种纳米颗粒组合物或药物组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物或药物组合物)。熟练的医疗专业人员可以使用本文所述的用于诊断或跟踪治疗的有效性的任何方法(例如，使用上述方法和本领域已知的方法)来确定治疗期的长度。如本文所述，基于治疗的有效性的评价(例如，使用本文所述的和本领域已知的任何方法)，熟练的医疗专业人员还可以改变施用至受试者的纳米颗粒组合物(和/或一种或更多种另外的治疗剂)的特性(identity)和数量(例如，增加或减少)，并且还可以调节(例如，增加或减少)向受试者施用至少一种纳米颗粒组合物(和/或一种或更多种另外的治疗剂)的剂量和频率。熟练的医疗专业人员可以进一步确定何时停止治疗(例如，诸如，在受试者的症状显著减少时)。
[0122]
实施例
[0123]
在以下实施例中进一步描述了本公开的某些实施方案，以下实施例不限制权利要求中所描述的任何实施方案的范围。
[0124]
实施例1-具有模块化氨基有效载荷的磁性纳米颗粒(mn)的合成
[0125]
磁性纳米颗粒(mn)的合成使用一种示例装置进行，所述装置包括玻璃板、冰，包括圆底烧瓶。圆底烧瓶包含下文中进一步描述的反应组分。将圆底烧瓶置于热板/搅拌板上。
[0126]
mn的配方包括葡聚糖(9g/30ml d.i.水)、0.65g氯化铁、0.4g氯化亚铁、和15ml nh4oh(28％)。
[0127]
首先，将9克的葡聚糖t10溶解于去离子水(d.i.水)中以在锥形管中达到30ml(30％w/v)。葡聚糖t10(技术质量(technical quality))是平均分子量为10kda的高纯度葡聚糖级分(fraction)。当溶液在室温下、在三天内形成沉淀时，制备新鲜的葡聚糖溶液。
[0128]
然后，在室温下将葡聚糖在旋转器上溶解于去离子(d.i.)水中1小时。所得溶液是无色的，但是它可能看起来略有混浊、带有气泡。可施加适度的热以使葡聚糖完全溶解。用于葡聚糖溶解的装置的实例示于图1。
[0129]
使用0.2微米(μm)/0.45μm过滤器将葡聚糖溶液过滤至含有磁力搅拌棒的250ml圆底烧瓶中。根据需要，管中任何剩余的葡聚糖都可以用蒸馏水。在冰浴中冷却双颈圆底烧瓶(rbf)中溶解的溶液30分钟，同时进行温和的磁力搅拌和氮气(或氩气)鼓泡(不是空气吹扫)以除去溶解氧。
[0130]
然后，制备氯化铁储备溶液。用于“条件1”的氯化铁的量是0.65g的氯化铁六水合物(fecl3·
6h2o)，并且1.2g的氯化铁六水合物(fecl3·
6h2o)用于“条件2”。将盐溶解于约5ml的di水中，如表1所示。储备溶液呈现棕色，使用0.22μm过滤器单元进行过滤，并储存在冷暗处。通过减去铁盐组合物中的其它元素来计算铁的量。将氯化亚铁四水合物瓶储存在干燥器中以使空气的氧化最小化。粉末氯化亚铁应为绿色的，并且瓶中棕色晶体的形成是铁氧化(即，从fe(ii)转化为fe(iii))的指示，为了获得高质量的超顺磁性纳米颗粒，这是应当避免的。
[0131]
然后，制备氯化亚铁溶液(fecl2·
4h2o)。新鲜称量0.4gr的氯化亚铁(条件1)并溶解于eppendorf管中1ml的d.i.水中，产生珠光蓝-绿色溶液。0.0gr的氯化亚铁用于条件2的配方。为了溶解氯化亚铁，用氮气吹扫d.i.水10分钟(min)以除去水中溶解的氧气。溶解后不需要过滤，但是溶解步骤进行15分钟(对于0.4g的氯化亚铁-即条件1)以确保实现完全溶解。通过忽略铁盐组合物中的其它元素来计算铁的量。
[0132]
将在1ml的氯化铁储备溶液中0.65g的氯化铁(条件1)、和在2-5ml的氯化铁储备溶液中1.2g的氯化铁(条件2)添加至冷葡聚糖溶液。在烧瓶中在持续氮气(或氩气)鼓泡的情况下搅拌混合物1小时。30分钟后，将1ml氯化亚铁溶液(0.4g fecl2(条件1)或(0.0g fecl2(条件2)添加至烧瓶，如表1所示。用橡胶塞盖紧rbf的所有颈部，从而通过使空气接触最少化来防止氧化，但是一个颈部具有气体出口，在橡胶塞的顶部具有针(18g)。
[0133]
表1
–
具有模块化氨基有效载荷的纳米磁性颗粒(mn)的配方
[0134] 条件1条件2fecl3·
6h2o(氯化铁六水合物)0.65g1.2g(fecl2·
4h2o)(氯化亚铁四水合物)0.4g0g添加的总铁盐1.05g1.2g添加的总铁(fe)240mg240mg
[0135]
然后，停止用非活性气体吹扫。连接套管(cannular tube)以在没有空气接触的情况下添加氢氧化铵。在该步骤中，将搅拌速度设定为最大以克服粘度的变化。反应混合物最初变得非常粘稠并变为军绿色。进行氢氧化铵的缓慢滴定。如果缓慢添加氢氧化铵，则粘度增加，从而干扰氢氧化铵在三价铁/亚铁混合物中的均匀混合，产生大颗粒。
[0136]
在冰浴中继续剧烈搅拌30分钟。保持反应混合物下方的冰浴，并在整个过程期间保持搅拌。60分钟后，将一个颈部与水冷式冷凝器连接，并且将另一个颈部与非活性气体连接以在高热下吹扫(不在反应混合物中)。小心以免在高温下引起暴沸。将反应rbf重新置于预热至90℃的油浴中。在油浴中继续搅拌90分钟。将温度计保持在反应混合物中以测量温度，并且将温度保持在至少约75℃至85℃。在该步骤之后，停止气流，并将溶液缓慢冷却至室温。在这一系列的反应结束时实现葡聚糖包被的磁性纳米颗粒的形成。最终溶液的体积约为40ml。
[0137]
通过amicon管(50k离心过滤器单元)纯化所得溶液以除去未反应的葡聚糖、铁盐、和氢氧化铵。首先由离心(～1,500
×
g(rcf)3-4k rpm，30至45分钟)来浓缩纳米颗粒悬浮液，这导致过滤器上的高度浓缩的纳米颗粒悬浮液和过滤器单元下方的无纳米颗粒洗脱物。弃去过滤器下方的洗脱液，将纳米颗粒团块(pellet)重悬于d.i.水中，并使用相同的过滤器单元再次离心。重复该步骤，直到洗脱液显示出d.i.水的ph或中性ph。最初，由于混合物中溶液的粘度、大尺寸的颗粒杂质、和较大量的未反应的游离葡聚糖，离心花费约1小时。然而，在前3个或4个离心步骤之后，大部分的游离葡聚糖被除去，并且纳米颗粒的重悬和浓缩在相对短的离心步骤(每个离心步骤约15分钟)中完成。洗涤步骤重复7次。将所得的磁性纳米颗粒的纯化溶液重悬于蒸馏水中。将最终体积调节至21ml，并将溶液静置于冰箱(例如，在约4℃)中过夜。
[0138]
实施例2-交联和胺化
[0139]
使用氢氧化钠、环氧氯丙烷、和氢氧化铵通过一系列的反应步骤使纳米颗粒交联和胺化。将21ml的mn与35ml氢氧化钠(naoh)、14ml环氧氯丙烷+60ml氢氧化铵(nh4oh)混合。实验在通风橱中进行，并采取安全预防措施以使对合成中所使用的化学品的暴露最小化。将35ml的naoh(5m)贮存在4℃下。为了从粒料(acros 134070010，1kg，cas 1310-732)制备5m naoh溶液，称量200g并添加至玻璃瓶。将1l水(milllipore)添加至瓶中，盖上瓶盖，并涡旋混合物。
[0140]
将冷的35ml的naoh(5m)添加至冰浴中的250ml圆底烧瓶中冷的21ml的纳米颗粒悬浮液。在冰浴中在没有气流的情况下搅拌反应混合物15分钟。在剧烈搅拌的情况下将14ml的环氧氯丙烷添加至反应混合物。在添加环氧氯丙烷后，所得溶液形成两个液相。混合后，将温度保持在室温。在室温下、在剧烈搅拌的情况下继续交联反应8小时。交联反应是放热的，并且监测并控制温度以使其不超过35℃。
[0141]
使用环氧氯丙烷来使葡聚糖聚合物骨架上的两个羟基交联。借助环氧氯丙烷的交联确保了mn的铁氧化物核表面上的葡聚糖涂层的化学稳定。环氧氯丙烷可以被聚合以使链延长，这可导致随后要被胺取代的羟基的增加。
[0142]
然后，使所得均匀溶液与氢氧化铵反应以使最终的纳米颗粒组合物胺化。对于条件1和条件2二者，将60ml的氢氧化铵(nh4oh，28％)添加至反应混合物。在室温下搅拌反应混合物48小时。用橡胶塞盖住圆底烧瓶的颈部以防止氨蒸发，这对于获得高的胺化收率是重要的。反应结束后，将溶液(～150ml)转移至透析袋(mwco 12-14kda)，并在通风橱中、在持续搅拌的情况下、在烧杯中用4-6l的蒸馏水透析。在两天内重复透析数次以除去所有未反应的氢氧化铵和副产物(6-7次)。继续进行直到透析袋中的氨气味消失且ph为中性。此后，再重复3-4次。透析装置的实例如图2所示。
[0143]
然后，使用amicon离心单元(mwco 30kda，2.8k rpm，15min)将所得棕黑色纳米颗粒悬浮液浓缩至20ml。将浓缩的纳米颗粒悬浮于100mm pbs缓冲液(ph7.4)中。使用amicon离心单元(mwco 30kda，每分钟2.8k转(rpm)，15分钟)、用pbs缓冲液再一次洗涤溶液。使用pbs缓冲液(ph7.4)将体积调节至15ml。以14500rpm离心纳米颗粒溶液。然后，使用0.1μm过滤器单元过滤掉大颗粒。进行铁分析以确定溶液中铁的量。使用pbs缓冲液(ph＝7.4)将体积调节至达到12mg fe/ml。使用nanosizer通过动态光散射来确定纳米颗粒的尺寸(直径约22
±
3nm)。
[0144]
实施例3-mn的铁浓度的表征
[0145]
通过进行下文中所述的铁分析来确定铁含量并用于计算纳米颗粒浓度。使用下文中所述的铁分析、使用8个标准铁溶液和4个样品来确定铁的量。将10μl的铁标准品和纳米颗粒溶液添加至980μl的6n hcl中。将10μl的过氧化氢(h2o2，在h2o中为30％)添加至各混合物中。通过将10μl的蒸馏水代替铁标准品添加至980μl的6n hcl和10μl的h2o2来制备空白样品。在此过程期间铁氧化物核被消化。通过uv-vis光谱法测定410nm处的光密度(od)。使用标准品获得校准曲线。使用所得校准曲线确定纳米颗粒溶液中铁含量的浓度。uv-vis曲线的实例示于图3中。在先前的实验中，发现浓度在8.7μm(即1mg/ml)的铁和216.9μm(即25mg/ml)的铁之间。
[0146]
spdp定量
[0147]
将725μl水添加至25μl的缀合的纳米颗粒。制备两管相同的稀释液(即，有或无tcep消化)。添加25μl的3％tcep。在室温下温育溶液约10分钟。然后，通过小的amicon过滤器(eppendorf型；100k截留(cut off))过滤溶液。然后，将溶液以7000rpm离心约2-5分钟。在343nm处测定滤液的吸光度。有tcep的滤液在343nm处测得的吸光度数据约为0.33，并且在无tcep处理的滤液中没有发现峰。如下计算每个纳米颗粒的spdp的总数。spdp的总数：0.33
×
10 6
×
30(稀释倍数)/8100(消光系数)＝1200。由于纳米颗粒浓度为20μm(2.2mg/ml)，因此每个纳米颗粒的spdp的数量是通过将1200个spdp除以10μm来计算的，并得到60个spdp/μm np。
[0148]
实施例4-纳米颗粒尺寸和胺基含量的表征
[0149]
使用动态光散射来确定纳米颗粒尺寸。在先前的实验中，合成半径大至约20至35nm和小至约11.5至15.6nm的纳米颗粒，如图4和5所示。
[0150]
胺含量通过缀合至纳米颗粒的spdp(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸n-琥珀酰亚胺酯)的数量来定量。spdp是对氨基和巯基具有反应性的异双官能连接基团。借助还原剂(3％tcep)裂解spdp官能化的纳米颗粒以释放可检测的吡啶-2-硫酮(p2t)副产物。通过监测343nm处的最大吸收峰来实现p2t的定量(343nm处的消光系数为8.08
×
103/cm/m)。p2t的数量给出了溶液中反应性胺基的数量。因此，每个纳米颗粒的胺基的数量是通过p2t与纳米颗粒的浓度比计算的。
[0151]
简言之，将一份纳米颗粒悬浮液(100μl)在800μl的磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4)中稀释。将spdp瓶从冰箱中取出并在打开之前平衡至室温以避免瓶中的水分累积。这对于防止spdp的nhs酯的水解是重要的。在无水dmso中制备100mm spdp储备溶液。spdp具有有限的水溶性，因此，将纳米颗粒溶液缓慢滴定至spdp溶液(dmso中)以防止spdp结晶。用800μl的pbs缓冲液稀释100μl的纳米颗粒，并添加100μl的100mm spdp溶液。在冷室中、在旋转器
上温育混合物(约16至20小时)。
[0152]
使用一次性sephadex pd-10柱、使用pbs缓冲液作为洗脱液来纯化纳米颗粒。收集1000μl的洗脱液。将450μl的经纯化的spdp官能化的纳米颗粒(来自pd-10柱后的～1000μl)与50μl的3％tcep混合，并将混合物在室温下静置20分钟。tcep还原spdp以释放可通过吸收光谱法检测的吡啶-2-硫酮。在混合物中避免包括dtt(二硫苏糖醇)或tcep残留物的二硫化物还原剂、或其它污染物，以保持纳米颗粒上的spdp的活性。
[0153]
将反应混合物转移到amicon过滤单元(0.5ml，mwco 100kda)，并且在微型离心机中使用～10,000
×
g(rcf)离心10分钟。回收含有p2t的洗脱液，并用于借助uv-vis光谱法的胺定量。弃去过滤器单元上保留的纳米颗粒团块。经纯化的spdp官能化的纳米颗粒溶液中的铁的量使用下文中所述的铁分析、使用8个标准铁溶液和4个样品来确定。
[0154]
简言之，将10μl的铁标准品和纳米颗粒溶液添加至980μl的6n hcl。将10μl的过氧化氢(h2o2，在h2o中为30％)添加至各混合物。通过将10μl的蒸馏水代替铁标准品添加至980μl的6n hcl和10μl的h2o2来制备空白样品。在此过程期间铁氧化物核被消化。通过uv-vis光谱法测定410nm处的光密度(od)。使用标准品获得校准曲线。使用所得校准曲线确定纳米颗粒溶液中铁含量的浓度。
[0155]
通过假定各纳米颗粒具有平均每个纳米颗粒2064个铁原子，在测定纳米颗粒悬浮液中的铁浓度之后确定纳米颗粒浓度。通常，浓度确定为约12mg/ml，这相当于100μm纳米颗粒溶液。
[0156]
发现了意想不到且令人惊奇的结果：通过改变反应中使用的fecl3和fecl2的量，能够调节每个纳米颗粒的氨基的数量。包括fecl3和fecl2二者的条件1产生每个纳米颗粒约60-90个氨基。条件2导致每个纳米颗粒引入约246-500个氨基，这是非常高的数量。表示410nm处p2t吸光度的uv-vis光谱的实例示于图6和7中。
[0157]
胺基定量
[0158]
在eppendorf管中，将100μl的mn与100μl pbs混合，并使其达到4℃。制备spdp在dmso中的20mm溶液(100μl中1mg)。将冷的纳米颗粒溶液滴加至spdp溶液中(反应为放热的)。在室温(rt)下温育溶液30分钟。然后通过pd-10柱纯化该溶液，并利用重力与pbs平衡。收集约2ml。将两个350μl等分试样(“样品”和“对照”)置于两个amicon过滤器(microcons)中。向样品添加30μl tcep(35mm)，并将样品单独放置10分钟。在rt下以6000rpm离心样品和对照20分钟。将30μl tcep(35mm)添加至对照洗脱液。在pbs中以1:4.86的比例稀释样品和对照。在343nm处读取样品和对照的光密度(od)。使用下文中所示的公式计算胺基团的数量。比色皿中，样品稀释20*1.0857*4.86)＝105.53倍。比色皿中铁的浓度＝铁储备溶液的浓度/105.53。比色皿中的[晶体]＝比色皿中的[fe]/0.116(常数)＝以μm计的[晶体]。比色皿中的[吡啶-2-硫酮]＝δod/0.0081(消光系数)＝以μm计的[吡啶2硫酮]nh2/xtal＝比色皿中的[xtals]/比色皿中的[吡啶-2-硫酮]。
[0159]
实施例5-寡核苷酸与mn的缀合
[0160]
如本文所述，用硫醇化寡核苷酸使mn官能化。通过在pbs缓冲液(ph 7.4)中混合10mg fe(相当于约1ml)来制备储备纳米颗粒溶液。随后，使纳米颗粒缀合至spdp从而为纳米颗粒提供硫醇反应性末端用于进一步的缀合步骤。如上所述，将spdp瓶从冰箱中取出并在将瓶打开之前平衡至室温(约30分钟)以避免瓶中的水分累积。将10mg的spdp溶解于500μ
l的无水dmso中，转移至冷的13ml falcon管中并立即使用。通过涡旋和移液将纳米颗粒溶液缓慢滴定至spdp溶液中。由于spdp溶液快速水解，所以每次都必须制备新鲜的spdp溶液。
[0161]
在黑暗中温育过夜后，使用一次性pd-10柱对pbs缓冲液(ph 7.4)纯化纳米颗粒以除去游离的未反应的spdp分子。弃去柱中纳米颗粒带的最后一部分以使游离的spdp与纳米颗粒完全分离。使用铁分析来计算最终纳米颗粒溶液的浓度。然后使具有硫醇反应性末端的纳米颗粒缀合至硫醇修饰的寡核苷酸。将硫醇修饰的寡核苷酸溶解于无核酸酶的水中至最终浓度为1mm。然后用3％三(2-羧基乙基)膦(tcep)处理寡核苷酸，以通过裂解寡核苷酸构建体中的保护性二硫键来活化硫醇基团。每次使用前新鲜制备3％tcep。将100μl的tcep溶液添加至1000μl的寡核苷酸储备溶液(1mm)并温育10分钟。然后使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化寡核苷酸。
[0162]
简言之，将500μl的9.5m乙酸铵添加至寡核苷酸混合物。之后，将2300μl的冷乙醇(200proof，分子生物学级)添加至混合物。在管中观察到白色混浊的寡核苷酸沉淀。然后将溶液在-80℃下静置1小时。之后，在4℃下、以20,000
×
g(rcf)离心寡核苷酸混合物15分钟。离心结束后，在管的底部形成白色寡核苷酸团块。弃去上清液，并且用100％乙醇和在水中的70％乙醇洗涤团块数次。然后，通过高速真空浓缩器干燥团块并将其重悬于无核酸酶的水中至最终浓度为1mm。在冷室中、在旋转器上将纳米颗粒与活化的寡核苷酸以1比13(多至1:40)的摩尔比混合至少一天。用0.22μm注射器式过滤器过滤纳米颗粒溶液以除去任何大的污染物。对于体外或体内研究，使用g-50sephadex一次性快速旋转柱在pbs(ph 7.4)中纯化100μl的纳米颗粒。
[0163]
使用铁分析、动态光散射、和凝胶电泳来表征所得治疗性铁氧化物纳米探针的浓度、尺寸、和寡核苷酸载荷。对于使用小动物的体内研究，根据需要，在离心的同时使用0.5ml amicon过滤单元(mwco 100kda，amicon ultra-0.5ml离心过滤器)浓缩纳米颗粒。用于分析寡核苷酸载荷的凝胶电泳的实例示于图8。通过改变寡核苷酸与氨基/纳米颗粒之比，可以逐渐增加和微调寡核苷酸/纳米颗粒的数值。
[0164]
聚丙烯酰胺凝胶中寡核苷酸载荷的分析
[0165]
将适量(例如，10μl)的tcep消化的mn添加至eppendorf管。使用游离的寡核苷酸作为对照以在凝胶中定位条带并定量。添加并混合2μl的核酸上样缓冲液(5
×
)。各样品在70℃下加热3分钟。将各样品冷却至室温，并快速将其离心。将所有液体小心地加载在15％tbe-脲(聚丙烯酰胺)凝胶或4％-20％page上。使用1
×
tbe缓冲液在130伏下运行凝胶约30-40分钟。小心地将凝胶从塑料盒中取出。用溴化乙锭(1μg/ml；将5μl原液添加至50ml水中)将凝胶染色20分钟。将溴化乙锭溶液倒出并保存以在之后适当地处理，用水洗涤凝胶两次，每次约5分钟。然后，在uv光下使凝胶可视化。
[0166]
实施例6-具有可控磁性的磁性纳米颗粒(mn)的合成
[0167]
磁性纳米颗粒(mn)的合成使用一种示例装置进行，所述装置包括玻璃板、冰，包括圆底烧瓶。圆底烧瓶包含下文中进一步描述的反应组分。将圆底烧瓶置于热板/搅拌板上。
[0168]
mn的配方包括葡聚糖(9g/30ml d.i.水)、0.54g氯化铁、0.24g氯化亚铁、和1ml nh4oh(28％)。该配方在磁性方面产生最小非线性指数。
[0169]
首先，将9克的葡聚糖t10溶解于去离子水(d.i.水)中以在锥形管中达到30ml(30％w/v)。葡聚糖t10(技术质量)是平均分子量为10kda的高纯度葡聚糖级分。当溶液在室
温下在三天内形成沉淀时，制备新鲜的葡聚糖溶液。
[0170]
然后，在室温下将葡聚糖在旋转器上溶解于去离子(d.i.)水中1小时。所得溶液是无色的，但是它可能看起来略有混浊、带有气泡。可施加适度的热以使葡聚糖完全溶解。用于葡聚糖溶解的装置的实例示于图1。
[0171]
使用0.2微米(μm)/0.45μm过滤器将葡聚糖溶液过滤至含有磁力搅拌棒的250ml圆底烧瓶中。根据需要，管中任何剩余的葡聚糖都可以用蒸馏水。在冰浴中冷却双颈圆底烧瓶(rbf)中溶解的溶液30分钟，同时进行温和的磁力搅拌和氮气(或氩气)鼓泡(不是空气吹扫)以除去溶解氧。
[0172]
然后，制备氯化铁储备溶液。用于“条件1”的氯化铁和氯化亚铁的量是0.54g的氯化铁六水合物(fecl3·
6h2o)和0.2g的氯化亚铁四水合物(fecl2·
4h2o)，用于“条件2”的氯化铁和氯化亚铁的量是0.54g的氯化铁六水合物(fecl3·
6h2o)和0.4g的氯化亚铁四水合物(fecl2·
4h2o)。将盐溶解于约5ml的di水中，如表2所示。储备溶液呈现棕色，使用0.22μm过滤器单元进行过滤，并储存在冷暗处。通过减去铁盐组合物中的其它元素来计算铁的量。将氯化亚铁四水合物瓶储存在干燥器中以使空气的氧化最小化。粉末氯化亚铁应为绿色的，并且瓶中棕色晶体的形成是铁氧化(即，从fe(ii)转化为fe(iii))的指示，为了获得高质量的超顺磁性纳米颗粒，这是应当避免的。
[0173]
然后，制备氯化亚铁溶液(fecl2·
4h2o)。新鲜称量0.2g的氯化亚铁(条件1)并溶解于eppendorf管中1ml的d.i.水中，产生珠光蓝-绿色溶液。0.4gr的氯化亚铁用于条件2的配方。为了溶解氯化亚铁，用氮气吹扫d.i.水10分钟(min)以除去可产生非磁性氧化的铁(铁锈(rust))的水中溶解的氧气。溶解后不需要过滤，但是溶解步骤进行15分钟(对于0.4g的氯化亚铁-即条件1)以确保实现完全溶解。通过忽略铁盐组合物中的其它元素来计算铁的量。
[0174]
将在1ml的氯化铁储备溶液中0.545g的氯化铁(条件1和条件2)添加至冷葡聚糖溶液。将1ml氯化亚铁溶液(0.2g fecl2(条件1)或(0.4g fecl2(条件2))添加至烧瓶，如表2所示。在烧瓶中在持续氮气(或氩气)鼓泡的情况下搅拌混合物1小时。用橡胶塞盖紧rbf的所有颈部，从而通过使空气接触最少化来防止氧化，但是一个颈部具有气体出口，在橡胶塞的顶部具有针(18g)。
[0175]
表2-具有可控磁性的磁性纳米颗粒(mn)的配方
[0176] 条件1条件2fecl3·
6h2o(氯化铁六水合物)0.54g0.54g(fecl2·
4h2o)(氯化亚铁四水合物)0.2g0.4g添加的总铁盐0.74g0.94g添加的总铁(fe)168mg224mg
[0177]
然后，停止用非活性气体吹扫。连接套管以在没有空气接触的情况下添加氢氧化铵。将1ml的浓缩的冷(～4℃)氢氧化铵(nh4oh，28％)快速添加至冰浴中的反应混合物。在该步骤中，将搅拌速度设定为最大以克服粘度的变化。如果缓慢添加氢氧化铵，则粘度增加，从而干扰氢氧化铵在三价铁/亚铁混合物中的均匀混合，产生大颗粒。确保不添加额外的氢氧化铵或少于1ml的氢氧化铵。
[0178]
表3
[0179][0180]
在冰浴中继续剧烈搅拌15分钟。保持反应混合物下方的冰浴，并在整个过程期间保持搅拌。15分钟后，将一个颈部与水冷式冷凝器连接，并且将另一个颈部与非活性气体连接以在高热下吹扫(不在反应混合物中)。小心以免在高温下引起暴沸。将反应rbf重新置于预热至90℃的油浴中。在油浴中继续搅拌60分钟。将温度计保持在反应混合物中以测量温度，并且将温度保持在至少约75℃至85℃。加热混合物不超过60分钟。在该步骤之后，停止气流，并将溶液缓慢冷却至室温。在这一系列的反应结束时实现葡聚糖包被的磁性纳米颗粒的形成。最终溶液的体积小于40ml。在室温下继续搅拌12小时。通过添加d.i.水将体积设定为40ml。将溶液转移至50ml锥形管并通过以14,000rpm离心1小时来除去大颗粒。将溶液转移至amicon过滤器单元(10ml
×
4)，并且将颗粒丢弃在50ml锥形管中。
[0181]
通过amicon管(50k离心过滤器单元)纯化所得溶液以除去未反应的葡聚糖、铁盐、和氢氧化铵。首先由离心(4,500rpm，3小时)来浓缩纳米颗粒悬浮液，这导致过滤器上的高度浓缩的纳米颗粒悬浮液和过滤器单元下方的无纳米颗粒洗脱物。弃去过滤器下方的洗脱液，并且将纳米颗粒凝胶样团块重悬于d.i.水中，并使用相同的过滤器单元再次离心。重复该步骤，直到洗脱液显示出d.i.水的ph或中性ph。最初，由于混合物中溶液的粘度、大尺寸的颗粒、和较大量的未反应的游离葡聚糖，离心花费约1小时。然而，在前3个或4个离心步骤之后，大部分的游离葡聚糖被除去，并且纳米颗粒的重悬和浓缩在相对短的离心步骤(每个离心步骤约15分钟)中完成。洗涤步骤重复7次。将所得的磁性纳米颗粒的纯化溶液重悬于蒸馏水中。将最终体积调节至21ml，并将溶液静置于冰箱(例如，在约4℃)中过夜。
[0182]
实施例7-mn的磁性的表征
[0183]
通过磁性粒子光谱仪(mps)分析样品，并且非线性指数(nli)用作纳米颗粒的磁性的标准。图9、11、13-14、16-17、和19-20显示示例mps分析数据，包括各mn样品的nli值。用于这些mn的合成和表征的表面修饰步骤与先前实施例中所述的相同。
[0184]
通过调节反应混合物中氯化亚铁和氯化铁的比例来控制磁性。为了改善纳米颗粒在水性介质中的悬浮稳定性，磁性的控制是关键的。在本系统中，设计表面以使表面带有正电荷，该正电荷可以克服布朗运动中颗粒之间的磁吸引力，所述磁吸引力会导致纳米颗粒在长期贮存期间的凝聚/不稳定。每个颗粒的胺化度大于64，这确保了在水性介质中的悬浮
稳定性。
[0185]
在磁性方面，非线性指数(nli)是用于量化对外部磁场的响应性的磁性颗粒的良好表征的性质。相对于在施加给定磁场的情况下的性质，当颗粒在没有外部磁场的情况下具有更强的磁性(磁导率)时，nli变得更小，并且该关系显示出与外部磁场的非线性相关性，因此，更适合于依赖于所述非线性的成像和治疗技术，一个实例是磁性颗粒成像(mpi)。
[0186]
实施例8-不同规模的mn的合成
[0187]
磁性纳米颗粒(mn)的合成使用一种示例装置进行，所述装置包括玻璃板、冰，包括圆底烧瓶。圆底烧瓶包含下文中进一步描述的反应组分。将圆底烧瓶置于热板/搅拌板上。
[0188]
mn的配方包括葡聚糖(18g/60ml d.i.水)、0.54g氯化铁、0.2g氯化亚铁、和1ml nh4oh(28％)。该配方在磁性方面产生最小的非线性指数。
[0189]
首先，将18克的葡聚糖t10溶解于去离子水(d.i.水)中以在锥形管中达到60ml(30％w/v)。葡聚糖t10(技术质量)是平均分子量为10kda的高纯度葡聚糖级分。当溶液在室温下、在三天内形成沉淀时，制备新鲜的葡聚糖溶液。
[0190]
然后，在室温下将葡聚糖在旋转器上溶解于去离子(d.i.)水中1小时。所得溶液是无色的，但是它可能看起来略有混浊、带有气泡。可施加适度的热以使葡聚糖完全溶解。用于葡聚糖溶解的装置的实例示于图1。
[0191]
使用0.2微米(μm)/0.45μm过滤器将葡聚糖溶液过滤至含有磁力搅拌棒的250ml圆底烧瓶中。根据需要，管中任何剩余的葡聚糖都可以用蒸馏水。在冰浴中冷却双颈圆底烧瓶(rbf)中的溶解的溶液30分钟，同时进行温和的磁力搅拌和氮气(或氩气)鼓泡(不是空气吹扫)以除去溶解氧。
[0192]
然后，制备氯化铁储备溶液。氯化铁的量是100ml的di水中0.54g的氯化铁六水合物，如下表4所示。储备溶液呈现棕色，使用0.22μm过滤器单元进行过滤，并储存在冷暗处。通过减去铁盐组合物中的其它元素来计算铁的量。将氯化亚铁四水合物瓶储存在干燥器中以使空气的氧化最小化。粉末氯化亚铁应为绿色的，并且瓶中棕色晶体的形成是铁氧化(即，从fe(ii)转化为fe(iii))的指示，为了获得高质量的超顺磁性纳米颗粒，这是应当避免的。
[0193]
然后，制备氯化亚铁溶液(fecl2·
4h2o)。新鲜称量0.20gr的氯化亚铁(条件1)并溶解于eppendorf管中1ml的d.i.水中，产生珠光蓝-绿色溶液。0.4gr的氯化亚铁用于条件2的配方。为了溶解氯化亚铁，用氮气吹扫d.i.水10分钟(min)以除去水中溶解的氧气。溶解后不需要过滤，但是溶解步骤进行10分钟(对于0.4g的氯化亚铁-即条件1)以确保实现完全溶解。
[0194]
将氯化铁储备溶液添加至冷葡聚糖溶液。将1ml氯化亚铁溶液1当量0.2g fecl2添加至烧瓶，如表4所示。在烧瓶中在持续氮气(或氩气)鼓泡的情况下搅拌混合物1小时。用橡胶塞盖紧rbf的所有颈部，从而通过使空气接触最少化来防止氧化，但是一个颈部具有气体出口，在橡胶塞的顶部具有针(18g)。
[0195]
表4-用于扩增的磁性纳米颗粒(mn)的配方
[0196][0197]
然后，停止用非活性气体吹扫。连接套管以在没有空气接触的情况下添加氢氧化铵。将1ml的浓缩的冷(～4℃)氢氧化铵(nh4oh，28％)快速添加至冰浴中的反应混合物。在该步骤中，将搅拌速度设定为最大以克服粘度的变化。反应混合物最初变得非常粘稠并变为军绿色。氢氧化铵滴定结束后失去粘度。如果缓慢添加氢氧化铵，则粘度增加，从而干扰氢氧化铵在三价铁/亚铁混合物中的均匀混合，产生大颗粒。确保不添加额外的氢氧化铵或少于1ml的氢氧化铵。
[0198]
在冰浴中继续剧烈搅拌15分钟。保持在反应混合物下方的冰浴，并在整个过程期间保持搅拌。15分钟后，将一个颈部与水冷式冷凝器连接，并且将另一个颈部与非活性气体连接以在高热下吹扫(不在反应混合物中)。小心以免在高温下引起暴沸。将反应rbf重新置于预热至60℃的油浴中。在油浴中继续搅拌90分钟。将温度计保持在反应混合物中以测量温度，并且将温度保持在至少约75℃至85℃。加热混合物不超过60分钟。在该步骤之后，停止气流，并将溶液缓慢冷却至室温。在这一系列的反应结束时实现葡聚糖包被的磁性纳米颗粒的形成。最终溶液的体积为约40ml。在室温下继续搅拌12小时。通过添加d.i.水将体积设定为40ml。将溶液转移至50ml锥形管并通过以14,000rpm离心1小时来除去大颗粒。将溶液转移至amicon过滤器单元(10ml
×
4)，将颗粒丢弃在50ml锥形管中。
[0199]
通过amicon管(50k离心过滤器单元)纯化所得溶液以除去未反应的葡聚糖、铁盐、和氢氧化铵。首先由离心(4,500rpm，3小时)来浓缩纳米颗粒悬浮液，这导致过滤器上的高度浓缩的纳米颗粒悬浮液和过滤器单元下方的无纳米颗粒洗脱物。弃去过滤器下方的洗脱液，并且将纳米颗粒团块重悬于d.i.水中，并使用相同的过滤器单元再次离心。重复该步骤，直到洗脱液显示出d.i.水的ph或中性ph。最初，由于混合物中溶液的粘度、大尺寸的颗粒、和较大量的未反应的游离葡聚糖，离心花费约3小时。然而，在前3个或4个离心步骤之后，大部分的游离葡聚糖被除去，并且纳米颗粒的重悬和浓缩在相对短的离心步骤(每个离心步骤约15分钟)中完成。洗涤步骤重复7次。将所得的磁性纳米颗粒的纯化溶液重悬于蒸馏水中。将最终体积调节至21ml，并将溶液静置于冰箱(例如，在约4℃)中过夜。通过磁性粒子光谱仪(mps)分析样品，并计算非线性指数(nli)。nli值用作纳米颗粒的磁性的标准。
[0200]
在总铁浓度方面，该扩增研究显示比实施例1-6中描述的研究大18倍的扩增。克服
的主要障碍是铁氧化物晶体形成步骤、氢氧化铵添加步骤中的高粘度。机械搅拌器的使用解决了上述步骤中均匀混合的问题，并且通过倒入预定体积而在尽可能短的时间内进行氢氧化铵的添加，并且不进行滴定。氢氧化铵的体积与总铁化合物的量成比例，如表4所示。葡聚糖溶液相对于总铁浓度的增加使晶体形成步骤中的粘度降低。这些结果表明在60ml葡聚糖溶液中总铁浓度为18当量的苛刻条件下具有优异非线性指数的磁性纳米颗粒的大量生产。
[0201]
其它实施方案
[0202]
应理解，尽管已结合本发明的详细描述来描述了本发明，但是前述描述旨在说明并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求书的范围内。