酵母细胞壁纳米颗粒及其制备方法与应用

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种酵母细胞壁纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术：

癌症严重威胁着人类的健康，据国家癌症中心的最新统计数据显示，恶性肿瘤引起的死亡占全部死亡原因的23.91％，目前恶性肿瘤的发病率和死亡率呈上升趋势，亟需采取手段以防控严峻的发展趋势。近年来，肿瘤免疫疗法，一种利用宿主免疫系统来达到抗肿瘤目的的治疗手段已经得到了广泛的关注，并且取得了一定的成果。虽然如此，但是肿瘤免疫疗法对实体瘤的临床响应率偏低，愈来愈多的研究表明，炎症性肿瘤微环境会使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感，非炎症性肿瘤具有免疫抑制性的肿瘤微环境，其主要特征是肿瘤间质嵌入的t细胞失活，髓系来源细胞丰富，血管分布异常，对免疫检查点抑制剂不敏感。因此，开发具有免疫激活效应的免疫刺激物，将非炎性肿瘤微环境转变为炎性，提高肿瘤对免疫检查点抑制剂的敏感性是目前的研究热点。

最近的研究表明，细菌、病毒和/或真菌在癌症中普遍存在，它们是癌症免疫治疗的关键因素，且可用于治疗肿瘤转移。近年来，基于微生物的癌症免疫疗法，包括细菌、病毒和真菌，已被用来激活先天免疫和提高适应性免疫，从而增强抗肿瘤免疫反应。外源性细菌和病毒制剂的工程已经取得了重大进展用于癌症治疗，特别是作为强大的免疫治疗选择或新辅助。有两种药物获得了美国食品和药物管理局(fda)的批准：t-vec(是由ⅰ型单纯疱疹病毒(hsv-1)改造而来的一种溶瘤病毒)和细菌治疗晚期黑色素瘤的分枝杆菌(卡介苗)。

虽然大量研究表明基于微生物的治疗策略为癌症免疫疗法提供了新的方向，但是仍然存在局限性。首先，活的微生物群可能会引起患者的系统性感染和严重的全身毒性，导致免疫系统攻击健康细胞。第二，细菌疗法引起的肿瘤消退率较低，抗肿瘤免疫效率依然有待提高；第三，上述基于活的细菌和病毒的大规模生产、质量控制、稳定性很难保证；最后，病人的耐受性也是值得考虑的问题。因此，基于微生物的癌症免疫治疗仍然处于早期发展阶段。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种酵母来源的纳米颗粒系统，由酿酒酵母菌微米级细胞壁通过破碎、差速离心法制备而来。本发明的优势之处在于：第一，由于酿酒酵母菌细胞壁没有繁殖能力，不会造成微生物在机体内的感染，因此其具有良好的生物安全性。第二，纳米级别的酿酒酵母菌细胞壁颗粒相比于微米级别可更加容易富集至肿瘤和淋巴结处，产生强大的抗肿瘤免疫反应；第三，该纳米制剂制备可重复性好，可大规模生产和运输，且成本低廉；最后，酿酒酵母是一种益生菌，能够为病人所接受。

本发明的第一个目的是提供一种酵母细胞壁纳米颗粒，所述的酵母细胞壁纳米颗粒是通过去除酵母的内含物，将收集的酵母细胞壁采用超声破碎和差速离心的方式，获得的粒径为10～1000nm的纳米颗粒，所述的酵母细胞壁纳米颗粒的电位为-1mv～-50mv。

进一步地，所述的酵母细胞壁纳米颗粒的粒径为10-100nm、100-500nm或500-1000nm。

本发明的第二个目的是提供一种酵母细胞壁纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

s1、将酵母细胞进行破壁处理，收集细胞壁组分；

s2、将s1步骤收集的细胞壁组分进行清洗，干燥后得到细胞壁粉末；

s3、将s2步骤的细胞壁粉末重悬于缓冲液中，进行超声破碎，破碎后采用600～1200g转速离心，收集上清液；

s4、将s3步骤的上清液采用2000～3000g转速离心，分别收集上清液和沉淀；

s5、将s4步骤的上清液采用8000～11000g转速离心，分别收集上清液和沉淀；

s6、将s5步骤的上清液采用18000～22000g转速离心，收集沉淀；

其中，s4、s5或s6步骤收集的沉淀为所述的酵母细胞壁纳米颗粒；

超声破碎的条件是：在80～120w超声功率下，按照超声2～4秒、间隙6～8秒的频率，超声处理80～120次。。

进一步地，s1步骤中，所述的破壁处理是采用将酵母细胞悬浮于碱液中，在70～90℃加热0.5～2小时。

进一步地，所述的碱液为0.8～1.5mnaoh溶液。

进一步地，s1步骤中，收集细胞壁组分是采用1500-2500g离心力离心10分钟。

进一步地，s2步骤中，清洗包括如下步骤：

s01、将s1步骤收集的细胞壁组分采用ph为4-5的稀盐酸，中和naoh溶液，50～60℃加热0.5～2小时，采用1500-2500g离心力离心10分钟，收集沉淀；

s02、将s01步骤收集的沉淀依次采用超纯水、异丙醇、丙酮进行洗涤。

本发明先用超纯水清洗除去水溶性的杂质，再用异丙醇作为脱水剂，除去沉淀中的水份，最后用丙酮清洗，便于干燥。

本发明的第三个目的是提供所述的酵母细胞壁纳米颗粒在制备抗肿瘤免疫药物中的应用。

进一步地，所述的抗肿瘤免疫药物中还包括免疫检查点抑制剂。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明的纳米颗粒系统是由酿酒酵母菌通过破碎、差速离心制备而来的，注射体内无繁殖能力，因此具有良好的安全性。

2、本发明的纳米尺寸的酵母来源的颗粒系统，具有很强的递送至肿瘤引流淋巴结的能力，能够有效地调节肿瘤引流淋巴结的微环境，引起免疫应答反应。

3、本发明的酵母来源的纳米颗粒递送至肿瘤引流淋巴结的能力以及抗肿瘤疗效与其纳米尺寸有关，是第一次在基于微生物的肿瘤治疗中发现这一现象。

4、相比于活的微生物疗法，该纳米制剂制备可重复性好，可大规模生产和运输，且成本低廉。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。

附图说明

图1为本发明的酵母来源的微米级和纳米颗粒系统的透射电镜图；

图2为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统的粒径分布图；

图3为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统在室温和4℃条件下的粒径变化图；

图4为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统表面蛋白含量图；

图5为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统的sds-page凝胶电泳图；

图6为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统体外细胞吞噬流式分析图；

图7为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统体外细胞吞噬共聚焦图；

图8为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统诱导骨髓来源树突状细胞成熟图；

图9为本发明的酵母来源的纳米颗粒系统诱导骨髓来源树突状细胞细胞因子分泌图；

图10为本发明的抗肿瘤免疫药物瘤内注射后肿瘤生长曲线图；

图11为未治疗组与小粒径酵母细胞壁治疗组肿瘤h&e切片图；

图12为未治疗组与小粒径酵母细胞壁治疗组肿瘤微环境流式分析图；

图13为本发明的抗肿瘤免疫药物递送至肿瘤引流淋巴结体外成像图；

图14为本发明的抗肿瘤免疫药物迁移至肿瘤引流淋巴结能力与尺寸效应有关的数学建模图；

图15为本发明的抗肿瘤免疫药物在肿瘤引流淋巴结中的分布情况图；

图16为本发明的抗肿瘤免疫药物激活肿瘤引流淋巴结中t细胞和b细胞流式分析图；

图17为本发明的抗肿瘤免疫药物激活肿瘤引流淋巴结中树突状细胞的流式分析图；

图18为本发明的抗肿瘤免疫药物治疗黑色素瘤的肿瘤生长曲线图；

图19为本发明的抗肿瘤免疫药物治疗黑色素瘤的生存曲线图；

图20为本发明的抗肿瘤免疫药物治疗黑色素瘤的主要器官的h&e染色切片图和小鼠体重图；

图21为本发明的抗肿瘤免疫药物治疗黑色素转移瘤的肿瘤生长曲线图；

图22为本发明的抗肿瘤免疫药物治疗黑色素转移瘤的小动物荧光成像图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优势和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

6-8周龄的c57bl/6和balb/c雌性小鼠购于常州卡文斯实验动物有限公司。所有小鼠实验按照苏州大学实验动物中心批准的动物实验方案进行。

小鼠黑色素瘤b16-luc肿瘤细胞，结肠癌细胞ct26，巨噬细胞raw264.7，树突状细胞dc2.4购于中国科学院上海生物科学研究所细胞库。骨髓来源的树突状细胞(bmdcs)按照既定方法从7-8周龄c57bl/6小鼠骨髓腔提取。使用第三代或者第四代传代培养的细胞用于本发明的各实施例。

免疫检查点抑制剂：pd-l1抗体(anti-pd-l1)购自bioxcell公司，(抗体编号为10f.9g2)。

实施例1：酵母来源的纳米颗粒系统的制备

称取100g酿酒酵母菌粉末悬浮于1mnaoh溶液中，80℃加热1小时。冷却后，2000g离心10分钟，收集含有酵母细胞壁的不溶物质。将该不溶物悬浮于用hcl调节ph值至4-5的1l超纯水中，并在55℃下孵育1小时。冷却至室温后，2000g离心10分钟收集不溶性物质，并用1l超纯水洗涤1次，200ml异丙醇洗涤4次，200ml丙酮洗涤2次。将所得的不溶性物质置于容器中，室温下干燥得到细微的白色粉末，此粉末即为微米级别的酵母细胞壁。随后，采用梯度离心的方法制备不同纳米尺寸的酵母细胞壁。具体来说，称取25mg白色粉末溶于8ml的pbs(ph＝7.4)中，采用100w的细胞破碎仪，按照超声时间：3秒；间隙时间：7秒；工作次数：99次进行超声破碎处理，破碎后，1000g离心5分钟除去大颗粒不溶性物质，所得上清经2500g离心10分钟，所得沉淀重悬于pbs中即为大粒径酵母细胞壁颗粒；上清继续经10000g离心10分钟，所得沉淀重悬于pbs中即为中等粒径酵母细胞壁颗粒；最后，上清经20000g离心10分钟后得到的沉淀重悬于pbs中获得小粒径酵母细胞壁颗粒。

实施例2：酵母来源的纳米颗粒系统的表征

透射电镜(tem)对微米级别的酵母细胞壁和三种纳米尺寸的酵母细胞壁的内部结构进行表征，结果如图1所示，粒径分别约为3-4μm，500nm，200nm，50nm，均呈现球形形貌，且分布均匀。动态光散射(dls)分析粒径大小以及三种纳米尺寸的酵母细胞壁在不同储存条件下随时间的粒径变化，结果如图2，图3所示，在室温和4℃储存条件下均能稳定储存至少2周。采用bca蛋白定量试剂盒和sds-page凝胶电泳对其表面蛋白进行分析，结果如图4，图5所示，三种纳米尺寸的酵母细胞壁含有相同的蛋白成分以及含量，这表明其除了在尺寸方面存在差异，其他方面均保持一致性。

实施例3：酵母来源的纳米颗粒系统对树突状细胞的免疫学效应

(1)体外细胞摄取分析

首先将三种纳米尺寸的酵母细胞壁用cy5.5染色，与dc2.4共孵育24小时后，300g离心3分钟收集细胞，流式细胞术分析树突状细胞吞噬三种纳米颗粒的效果。与此同时，将染有cy5.5的三种纳米尺寸的酵母细胞壁与树突状细胞共孵育24小时，4％多聚甲醛固定后，用dapi染细胞核以定位细胞，共聚焦显微镜拍摄进行分析。结果如图6，图7所示，三种纳米尺寸的酵母细胞壁均能够有效地被树突状细胞所吞噬，并且随着粒径的减小，其吞噬效果更佳。

(2)体外骨髓来源树突状细胞的免疫学效应分析

根据已有方法提取小鼠骨髓来源树突状细胞，待其成熟度至8％左右时，将其与lps，三种纳米尺寸的酵母细胞壁共孵育24小时，收集上清液保存于-80℃供后续检测细胞因子，300g离心3分钟收集bmdcs分析共刺激因子(cd80，cd86)的表达。结果如图8，图9所示，三种纳米尺寸的酵母细胞壁很好地刺激了bmdc的成熟，效果与lps组(阳性对照)相当，elisa结果显示，经三种纳米尺寸的酵母细胞壁刺激后，bmdc有效地分泌了tnf-α，il-1β，il-12p70等细胞因子，这为后续体内诱导强烈的抗肿瘤免疫应答提供了依据。

实施例4：酵母来源的纳米颗粒系统体内免疫学效应

(1)酵母来源的纳米颗粒系统通过重塑肿瘤微环境抑制肿瘤的生长

瘤内注射三种纳米尺寸的酵母细胞壁，通过监测其肿瘤生长情况来判断其抑制肿瘤生长效果。结果如图10所示，酵母来源的纳米颗粒系统能够抑制小鼠黑色素瘤的生长，并且随着粒径的减小，其压制肿瘤的效果越好。与此同时，如图11所示，对照组和治疗组肿瘤的h&e切片反映出同样的结果。对肿瘤微环境内t细胞浸润、骨髓来源的抑制性细胞(mdscs)，肿瘤相关巨噬细胞(tams)，调节性t细胞(tregs)，树突状细胞进行分析，结果如图12所示，与未治疗组相比，小粒径酵母细胞壁治疗组能够显著提高cd8⁺t细胞和cd4⁺t细胞在肿瘤中所占的比例，治疗组也明显改善了肿瘤免疫抑制微环境，经治疗后，肿瘤内mdscs，tregs，tams的比例明显地下降了，与此同时，dc的成熟度达到了35％左右，这进一步说明了酵母来源的纳米颗粒系统能够作为一种抗肿瘤免疫药物。

(2)抗肿瘤免疫药物迁移至肿瘤引流淋巴结的能力分析

首先，我们将cy5.5标记的三种纳米尺寸的酵母细胞壁注射到b16肿瘤中，48小时后安乐死小鼠，收集其肿瘤引流淋巴结进行活体荧光成像。如图13所示，小粒径酵母细胞壁有利于进入和靶向肿瘤引流淋巴结，中等粒径酵母细胞壁次之，大粒径酵母细胞壁对肿瘤引流淋巴结的靶向能力最差。为了更好地解释酵母来源的纳米颗粒系统靶向肿瘤引流淋巴结的能力与尺寸大小有关，通过数学建模，数据拟合结果表明，如图14所示，该纳米系统的迁移能力与粒径的平方根成反比，即e＝d^-1/2。接着，我们评估了酵母来源的纳米颗粒系统在肿瘤引流淋巴结中的分布，如图15所示，在树突状细胞、巨噬细胞、t细胞、b细胞等主要免疫细胞中检测到了cy5.5的信号，并且其含量与纳米颗粒系统的尺寸大小呈负相关。免疫细胞的活化在抗肿瘤免疫应答中起到了关键作用，紧接着，我们评价了主要免疫细胞的活化情况。如图16所示，瘤内注射48小时后，t(cd4⁺和cd8⁺)细胞和b细胞(cd19⁺)上cd69的表达均上调了，这表明治疗后t细胞和b细胞均被有效地激活。树突状细胞，作为一种专职抗原提呈细胞，在抗肿瘤过程中发挥着至关重要的作用。如图17所示，与对照组相比，治疗组肿瘤引流淋巴结中树突状细胞上共刺激分子(cd80、cd86、cd40、mhcii)的表达均增加。小粒径酵母细胞壁对小鼠主要免疫细胞具有更强的刺激作用，这可能与它们在肿瘤引流淋巴结中富集量较多有关。

(3)酵母来源的纳米颗粒系统联合免疫检查点阻断疗法的有效性和安全性评价

对肿瘤进行免疫评价分析后，结果表明，小粒径酵母细胞壁治疗后，t细胞上pd-1和pd-l1的表达量均显著上调，因此，我们将小粒径酵母细胞壁与anti-pd-l1联合以治疗小鼠黑色素瘤。结果如图18所示，与单独给药治疗组相比，基于酵母来源的纳米颗粒系统的免疫治疗与anti-pd-l1联合后在控制肿瘤生长方面表现出了巨大的协同效应，并且联合治疗使小鼠的肿瘤完全消退，图19表明，小鼠生存期得到了显著延长。与此同时，通过对治疗期间小鼠的体重监测以及主要脏器的h&e切片观察，酵母来源的纳米颗粒系统与免疫检查点抑制剂联合治疗的小鼠耐受性良好，结果如图20所示。这些结果直观地表明了小粒径酵母细胞壁与pd-l1阻断相联合产生了显著的协同抗肿瘤免疫应答。

小粒径酵母细胞壁与anti-pd-l1联合能够破坏肿瘤，从而产生肿瘤细胞裂解物，随后，肿瘤细胞裂解物和小粒径酵母细胞壁共同迁移至肿瘤引流淋巴结，并促进树突状细胞的成熟和t细胞、b细胞的活化。从图21的生长曲线以及图22小动物荧光成像来看，联合治疗不仅抑制了原位肿瘤的生长，对侧的肿瘤也明显得到了抑制，这说明酵母来源的纳米颗粒系统和免疫检查点抑制剂联合后作为一种抗肿瘤组合物，可以诱导全身抗肿瘤的免疫反应，从而降低肿瘤的转移。

综上，本发明的酵母来源的纳米颗粒系统，作为一种抗肿瘤免疫药物通过重塑肿瘤引流淋巴结和肿瘤微环境引起抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤的生长并且降低肿瘤的转移。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。