一种靶向B7H3的DNA疫苗、制备方法及应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向b7h3的dna疫苗、制备方法及应用。

背景技术：

肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)简称肾癌，是一种进展迅速，转移潜能高，生长速度快的常见肿瘤类型，大多数晚期肾细胞癌患者往往在诊断初期或原发性肿瘤切除后发现远处转移。目前转移性肾细胞癌的治疗主要集中在抗血管生成药物、细胞因子和单克隆抗体，虽然这些药物在治疗晚期肾细胞癌中大大提高了患者的生存率，但容易造成自身免疫性疾病，治疗效果不尽如人意，并且存在潜在的严重副作用，药物成本高昂。因此，迫切需要研发更好的治疗靶点和新型药物。

dna疫苗已是一种较为成熟的技术，可以诱导对肿瘤抗原的特定且持久的免疫反应。一份2018年的免疫指南提示，一个良好的dna疫苗有赖于具有特异性的抗原、调节免疫反应的佐剂和高效的传递系统。

b7h3是b7家族的新成员之一，在cd8⁺t细胞免疫应答、肿瘤进展和肿瘤预后等方面发挥着重要作用，但目前对它在免疫过程中所起的具体作用尚存在争议。近年来的一系列研究表明，b7h3在肾细胞癌、导管原位癌、结直肠癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤组织中存在异常高表达，而在正常组织中很少表达，在成纤维细胞、内皮细胞(ec)、成骨细胞和羊水干细胞中仅少量表达。德国的一项研究曾表明以b7h3为靶点的免疫治疗，能减少结肠癌的转移率。b7h3具有明显的肿瘤特异性，可作为癌症免疫治疗的理想靶点，迄今为止，已有许多基于b7h3抗原的肿瘤疫苗研究，但有关b7h3的早期抗肿瘤实验多未能取得令人满意的成果。在2015-2017年间进行的多组实验表明，建立于瘤荷动物模型上的抗b7h3免疫确能在一定程度上抑制肿瘤的生长扩散。我们推测，一种有效的抗b7h3肿瘤免疫需要佐剂的加强，开发新的肿瘤特异性疫苗策略迫在眉睫。

一种成功有效的疫苗主要依赖于抗原佐剂和传递系统。hmgb1早期被称为细胞质和细胞核中的非组蛋白dna结合因子，以及炎症中的促炎症细胞因子，已被报道在先天性和适应性免疫应答中都有意义。2018年天津市肿瘤研究所的一项回顾性研究表明，hmgb1过度表达涉及各种疾病，包括肺癌，同时也对疾病治疗有一定的作用。在2019年后，更多综述和回顾开始注意到hmgb1与肿瘤发生发展之间的密切关系。目前对hmgb1的研究主要集中在作为治疗炎症反应性疾病的良好靶点，发明人推测，hmgb1可作为佐剂，提高疫苗对肿瘤组织的反应效率。

药物递送系统是指在空间、时间及剂量上全面调控药物在生物体内分布的技术体系。基因载体能否携带质粒进入人体宿主细胞，在一定程度上决定了dna疫苗的成败。目前，常规药物递送体系以溶瘤病毒、腺病毒为主，但病毒载体在肿瘤潜能、免疫识别和免疫应答方面的安全性限制了其临床应用。因此，一种安全有效的疫苗投递载体是疫苗治疗临床成功的关键。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种靶向b7h3的dna疫苗，为肾癌的治疗提供新思路。

技术方案

一种靶向b7h3的dna疫苗，包含表达b7h3基因的重组质粒pcdna3-b7h3和表达hmgb1基因的重组质粒pcdna3-hmgb1，所述b7h3基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，hmgb1基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。

所述b7h3基因为人类来源的b7h3全长基因，所述hmgb1基因为鼠源hmgb1全长基因。

进一步，所述重组质粒pcdna3-b7h3和重组质粒pcdna3-hmgb1采用的真核表达质粒为pcdna3.1。真核表达质粒还可以是任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体。

进一步，所述dna疫苗还包括投递载体，所述投递载体为叶酸接枝的pei600cyd(h1)载体。本发明以生物材料为主的叶酸接枝的pei600cyd(h1)作为载体，能够有效凝聚dna疫苗，形成稳定的功能纳米粒用于疫苗传递。经试验证实，h1在小鼠体内没有明显升高的血清炎症或非特异性免疫应答的情况下是安全有效的，因此h1具有更好的生物亲和力，更低的不良事件发生率以及更稳定的药物递送的效率。

所述叶酸接枝的pei600cyd(h1)的制备方法，包括如下步骤：

1)将β-环糊精(0.42g,0.37mmol)和1,10-羰基二咪唑(cdi，0.5g，3mmol)溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，室温下搅拌均匀后，加入到-20℃的冷乙醚中进行沉淀，过滤后得到滤渣即为cyd-cdi，溶解于dmso中，4℃保存；

2)将pei600(1.80g，3mmol)溶解于dmso，得到pei600溶液；

3)将步骤(1)制得的cyd-cdi和0.3ml三乙胺et3n混合后滴入pei600溶液中，反应5h后，将得到的产物在水中用透析管(mwco，12kda)透析，冷冻干燥，然后在氮气氛围下进行催化反应，得到反应产物pei600-cyd；

4)将pei600-cyd加入到dmso溶液中溶解，获得h1的粗产物；

5)将粗产物在水中透析三天后，再冷冻干燥，得到淡黄色的叶酸接枝的pei600cyd粉末。

上述靶向b7h3的dna疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)以真核表达质粒为载体，构建表达b7h3基因的重组质粒pcdna3-b7h3和表达hmgb1基因的重组质粒pcdna3-hmgb1；

(2)往100ug的叶酸接枝的pei600cyd粉末中加入100ul的双蒸馏水，配成1mg/ml的叶酸接枝的pei600cyd载体悬液；

(3)将50ul1mg/ml的重组质粒pcdna3-b7h3和50ul1mg/ml的重组质粒pcdna3-hmgb1加入到叶酸接枝的pei600cyd载体悬液中，混合均匀，即得。

采用本发明的靶向b7h3的dna疫苗进行免疫的方法：将dna疫苗行肌肉注射，剂量为50μg/质粒，10天后再注射1次，剂量为50μg/质粒，共注射3次，靶抗原总量约150μg，可有效诱导机体免疫反应。

上述靶向b7h3的dna疫苗在制备预防或治疗肾癌的药剂中的用途。

一种药物组合物，包含上述靶向b7h3的dna疫苗以及药物上接受的载体或赋形剂。

所述药物组合物的剂型为注射剂。

本发明中，“药学上接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、pbs缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，ph值通常约5-8。

本发明的有益效果：本发明的靶向b7h3的dna疫苗，具有以下三大特性：

1)其核心是一种抗原及佐剂质粒载体，编码人类来源的b7h3和hmgb1基因。

2)通过具有特定化学性质的h1，与上述pb7h3、phmgb1质粒dna形成共聚复合物后，再通过肌肉注射途径接种该疫苗，具有安全无毒性、缓释性等多种优势，可促进抗原提呈细胞和t细胞等的激活。

本发明构建的dna疫苗包含pcdna3-b7h3和pcdna3-hmgb1，通过佐剂hmgb1强化针对b7h3的肿瘤特异性免疫效果，并以h1包裹作为投递载体。在携带hb7h3-renca的小鼠中，肌肉注射h1-phmgb1/pb7h3疫苗通过增强dcs介导的肿瘤特异性cd8⁺t细胞反应显著抑制肿瘤生长。它还促进肿瘤浸润cd8⁺t细胞，并通过ifn-γ的产生促进cd8⁺t细胞的产生。本发明的dna疫苗为肾癌的预防和治疗提供了新思路，为临床治疗包括转移性肾癌在内的多种肿瘤提供了广阔的前景。

附图说明

图1是重组质粒pcdna3-b7h3的构建示意图；

图2为重组质粒pcdna3-b7h3体外转染293t细胞后表达产物的westernblot鉴定结果；

图3为重组质粒pcdna3-hmgb1的构建示意图；

图4为重组质粒pcdna3-hmgb1体外转染293t细胞后表达产物的westernblot鉴定结果；

图5为小鼠脾脏细胞中cd11c⁺细胞所占脾脏脾脏细胞百分比的流式检测结果；

图6为cd11c⁺，cd11c⁺cd80⁺，cd11c⁺mhc-ii细胞频率的统计分析结果；

图7为肌肉注射h1-phmgb1/pb7h3后小鼠脾脏t细胞的ctl功能检测结果；

图8为肌肉注射免疫后小鼠的肿瘤照片；

图9为肌肉注射免疫后小鼠肿瘤的体积和重量统计结果；

图10为抑瘤率计算结果；

图11为肌肉注射免疫后荷瘤小鼠体重变化情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

下述实施例中，采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

质粒pcdna3.1(+)、宿主细菌dh5α(invitrogen公司)；hek293t细胞购自atcc；小鼠肾癌细胞系renca购自cobiorebiosciences；hrp标记羊抗小鼠igg多克隆抗体,hrp抗b7h3单抗(affinitybiosciences)，抗hmgb1单抗(beyotime)或抗β-肌动蛋白单抗(santacruz)，标记羊抗小鼠iga多克隆抗体(southernbiotech公司)，山羊抗鼠igg(h+l)抗体(vicmeo)和山羊抗兔igg(h+l)抗体(vicmed)；限制性核酸内切酶bamhi、xhoi(takara公司)；t4dna连接酶(mbi公司)；taqdna聚合酶(promega公司)；rnasea(ameresco公司)；dntp(promega和华美生物公司)；lb培养基(英国oxoid公司)；琼脂粉、琼脂糖、eb(上海化学试剂采购供应站)；tris(usb公司)；琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)；大量质粒抽提试剂盒(qiagen),乳酸脱氢酶ldh试剂盒购自roche；6-8周龄雌性balb/c(h-2d)小鼠购自charlesriverlaboratory，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。

实施例1重组质粒pcdna3-b7h3的构建及体外表达

1)人b7h3(nm__001024736)的编码序列(正向：5'-tcggatccatgcgtcggcgg-3'和反向：5'-atgctcgagcgccttttcgtccatc-3')被用启动子以pcr扩增，然后用限制性酶bamhi和xhoi插入pcdna3.1载体，得到重组质粒pcdna3-b7h3，构建示意图见图1。由invitrogen公司dna测序服务中心进行dna测序鉴定，证实构建正确。

2)重组质粒pcdna3-b7h3的体外表达：以lipofactaminetm-2000辅助重组质粒pcdna3-b7h3转染293t细胞：2μllipofectaminetm与45μl1640混匀室温5min，1μg质粒dna与50μl1640混匀室温5min，二者混匀，室温20min；将100μldna-lipofectaminetm-2000复合物逐滴加入细胞上。37℃、5％co2培养。培养72h后收集细胞培养上清，经sds-page分离蛋白表达产物，转膜，而后以抗b7h3特异性抗体孵育并染色，westernblot鉴定重组质粒pcdna3-b7h3体外转染293t细胞后的表达产物，结果显示：重组质粒pcdna3-b7h3可在体外有效表达，表达产物为57235kd(图2)。

实施例2重组质粒pcdna3-hmgb1的构建和体外表达

来自开放阅读框(orf)cdna(公共质粒，biogotbiotechnology)的小鼠hmgb1表达序列通过nhe1和ecor1亚克隆到pcdna3.1载体中，得到重组质粒pcdna3-hmgb1，构建示意图见图3，由invitrogen公司dna测序服务中心进行dna测序鉴定，证实构建正确。

重组质粒pcdna3-hmgb1的体外表达：以lipofactaminetm-2000辅助重组质粒pcdna3-hmgb1转染293t细胞：2μllipofectaminetm与45μl1640混匀室温5min，1μg质粒dna与50μl1640混匀室温5min，二者混匀，室温20min；将100μldna-lipofectaminetm-2000复合物逐滴加入细胞上，37℃,5％co2培养。培养72h后收集细胞培养上清，经sds-page分离蛋白表达产物，转膜，而后以抗hmgb1特异性抗体孵育并染色，westernblot鉴定重组质粒pcdna3-hmgb1体外转染293t细胞后的表达产物，结果见图4，图4结果显示：pcdna3-hmgb1质粒可在体外有效表达，表达产物约为24894kd。

实施例3

叶酸接枝的pei600cyd(h1)的制备方法，包括如下步骤：

1)将β-环糊精(0.42g,0.37mmol)和1,10-羰基二咪唑(cdi，0.5g，3mmol)溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，室温下搅拌均匀后，加入到-20℃的冷乙醚中进行沉淀，过滤后得到滤渣即为cyd-cdi，溶解于dmso中，4℃保存；

2)将pei600(1.80g，3mmol)溶解于dmso，得到pei600溶液；

3)将步骤(1)制得的cyd-cdi和0.3ml三乙胺混合后滴入pei600溶液中，反应5h后，将得到的产物在水中用透析管(mwco，12kda)透析，冷冻干燥，然后在氮气氛围下进行催化反应，得到反应产物pei600-cyd；

4)将pei600-cyd加入到dmso溶液中溶解，获得h1的粗产物；

5)将粗产物在水中透析三天后，再冷冻干燥，得到淡黄色的h1粉末。

h1-pb7h3靶抗原纳米颗粒的制备：

1)质粒dna的大量制备：依照qiagenplasmidmegakit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

2)在100ugh1粉末加入100ul双蒸馏水，混合均匀；

3)在50ugpcdna3-b7h3中加入50ul双蒸馏水，混合均匀；

4)共沉淀法(共凝聚法)制备h1-pb7h3靶抗原纳米颗粒：在80℃水浴中，将h1溶液逐滴滴入质粒dna溶液中，同时15000rpm高速振荡30秒，即可形成均一略带混浊的h1-pb7h3靶抗原纳米颗粒。

h1-phmgb1佐剂纳米颗粒的制备：

1)质粒dna的大量制备：依照qiagenplasmidmegakit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

2)在100ugh1粉末加入100ul双蒸馏水，混合均匀；

3)在50ugpcdna3-b7h3中加入50ul双蒸馏水，混合均匀；

4)共沉淀法(共凝聚法)制备h1-phmgb1佐剂纳米颗粒：在80℃水浴中，将h1溶液逐滴滴入质粒dna溶液中，同时15000rpm高速振荡30秒，即可形成均一略带混浊的h1-phmgb1佐剂纳米颗粒。

靶向b7h3的dna疫苗(h1-phmgb1/pb7h3)的制备：

(1)以真核表达质粒为载体，构建表达b7h3基因的重组质粒pcdna3-b7h3和表达hmgb1基因的重组质粒pcdna3-hmgb1；

(2)往100ug的叶酸接枝的pei600cyd粉末中加入100ul的双蒸馏水，配成1mg/ml的叶酸接枝的pei600cyd载体悬液；

(3)将50ul1mg/ml的重组质粒pcdna3-b7h3和50ul1mg/ml的重组质粒pcdna3-hmgb1加入到叶酸接枝的pei600cyd载体悬液中，混合均匀，即得h1-phmgb1/pb7h3疫苗溶液。

实施例4h1-phmgb1/pb7h3肌肉注射免疫可促进树突状细胞的诱导和成熟

将6-8周balb/c雌鼠分为4组,分别为：mock,h1-phmgb1,h1-pb7h3,h1-phmgb1/pb7h3,每组5只小鼠。肌肉注射免疫程序如下：以0.75％戊巴比妥钠80-120μl经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉，h1-phmgb1组和h1-pb7h3组是将h1-phmgb1、h1-pb7h3纳米颗粒分别用无菌pbs溶解为1mg/ml的浓度，按50μgdna/50μl的量肌肉注射入小鼠腿部肌肉，h1-phmgb1/pb7h3组是以含有50μg质粒dna的复合物溶液注射入小鼠腿部肌肉，mock组肌肉注射50ul1mg/ml的pcdna3.1-flag质粒。于0天、10天、20天三次肌肉注射免疫小鼠。然后将将小鼠安乐死，取出小鼠脾脏，进行流式分析。

对于dc细胞测定，用抗cd11c单克隆抗体(apc结合物，bdbiosciences)、抗cd80单克隆抗体(pe结合物，biolegend)或抗i-a/i-e单克隆抗体(pe结合物，biolegend)染色细胞。数据均在facsdiva软件(bdbiosciences)的bdfacscantoii(bdbiosciences)上获取，并由flowjo软件(treestarinc.)进行分析。

图5为肌肉注射h1-phmgb1/pb7h3后小鼠脾脏细胞中cd11c⁺细胞所占脾脏脾脏细胞百分比的流式检测结果，可以看出，h1-phmgb1/pb7h3组中cd11c⁺细胞的数量和比例显著高于h1-phmgb1、h1-pb7h3和模拟组；图6为cd11c⁺，cd11c⁺cd80⁺，cd11c⁺mhc-ii细胞频率的统计分析结果，可以看出，h1-phmgb1/pb7h3联合免疫组cd11c⁺dc中cd11c⁺cd80⁺和cd11c⁺mhc-ii⁺的百分率较其他免疫组明显升高。图5和图6表明，h1-phmgb1/pb7h3肌肉联合免疫增强了肿瘤模型中dc的募集和成熟。

实施例5h1-phmgb1/pb7h3肌肉注射免疫可诱导脾脏t细胞的特异性增殖和ctl杀伤

小鼠脾脏t细胞ctl功能检测：

在37℃、5％co2加湿培养箱中，以50∶1的比例将hb7h3诱导的脾细胞与靶细胞在96孔圆底平板上共培养4天，进行肿瘤细胞杀伤实验。共培养后，收集细胞，用抗鼠cd8α和抗人b7h3染色，流式细胞仪检测。

图7为肌肉注射h1-phmgb1/pb7h3后小鼠脾脏t细胞的ctl功能检测结果，可以看出，效应细胞与靶细胞共培养后，h1-phmgb1/pb7h3联合免疫组肿瘤细胞比例明显低于h1-pb7h3联合免疫组，说明h1-phmgb1/pb7h3联合免疫组cd8⁺t细胞杀伤肿瘤细胞的能力更强。

实施例6h1-phmgb1/pb7h3肌肉注射免疫可显著抑制肿瘤的生长

为建立小鼠皮下肿瘤模型，将小鼠接种5×10⁵hb7h3-renca细胞，随机分为4组，每组5只小鼠。7天后，各组分别用空白、h1-phmgb1、h1-pb7h3、h1-phmgb1/pb7h3免疫，剂量为50μg/质粒。每组每10天注射1次，共注射3次，以提高免疫力，每周测量肿瘤体积2次，计算公式为：v(mm³)＝(长×宽²)/2。5周后将小鼠安乐死，肿瘤被手术切除并称重。

图8为肌肉注射免疫后小鼠的肿瘤照片，可以看出，h1-phmgb1/pb7h3免疫小鼠的肿瘤生长明显受到抑制；图9为肌肉注射免疫后小鼠肿瘤的体积和重量统计结果，其中图9b为肿瘤的体积统计结果，图9c为肿瘤的重量统计结果，可以看出，h1-phmgb1/pb7h3组肿瘤体积和重量显著减小。

按公式计算抑瘤率：抑瘤率＝(模型组体积-给予疫苗组体积)/模型组体积*100％，各处理组的抑瘤率测试结果见图10，可与看出，h1-phmgb1/pb7h3组抑瘤率显著提高。

实验过程中，我们通过监测小鼠接种肿瘤后的体重变化来验证h1-phmgb1/pb7h3疫苗的安全性，图11为肌肉注射免疫后荷瘤小鼠体重变化情况，结果显示各组小鼠的体重和健康状况相似，证明h1-phmgb1/pb7h3疫苗没有引起体重减轻或严重的副作用。

序列表

<110>徐州医科大学

<120>一种靶向b7h3的dna疫苗、制备方法及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1605

<212>dna

<213>b7h3(b7h3)

<400>1

atgctgcgtcggcggggcagccctggcatgggtgtgcatgtgggtgcagccctgggagca60

ctgtggttctgcctcacaggagccctggaggtccaggtccctgaagacccagtggtggca120

ctggtgggcaccgatgccaccctgtgctgctccttctcccctgagcctggcttcagcctg180

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<213>b7h3(b7h3)

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