专利名称：大胶囊化的分泌细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及在亲水凝胶材料中对分泌细胞的大胶囊化(macroencapsulation)，应用大胶囊化分泌细胞的治疗方法及通过大胶囊化以保存分泌细胞的方法。
背景技术：
分泌细胞是特征在于分泌活性物质如，但并不仅限于，激素(如胰岛素)、生长激素、细胞因子等等的细胞。其在生物学过程中的作用已被很好了解，这里不需陈述。许多疾病和病理状态与分泌细胞正常功能不足有关，像分泌产物的量不足，例如甲状腺功能减退及呆小病都是由于甲状腺素缺乏引起，垂体性侏儒症是由于垂体分泌的生长激素缺乏；Lesch-Hyhan综合症是由于次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶不足；急性肝衰是由于肝营养素缺乏，胞外基质症是由于软骨细胞缺乏，及胰岛素依赖型糖尿病是由于胰岛素缺乏所致。
治疗此类疾病的一种方法是为病人移植分泌细胞。为达到临床安全性及有效性，此移植物必须(1)对被移植者的细胞和组织是非免疫原性的、非凝血酶原性的、生物稳定的及完全无毒的，(2)持续保持一段时期细胞的存活性，(3)允许营养素、促泌素(一种促进分泌的物质)及细胞产物自由通过，(4)便于外科移植体及细胞重生，(5)易于放置也易于移去。
胰岛移植以治疗胰岛素依赖型糖尿病这一课题被重新关注是因为分离Langerhans胰岛技术的发展。作为背景情况，人体胰腺含有Langerhans胰岛(在下文称为“胰岛”)，其在胰管附近以某一浓度分散地布于胰腺的外分泌部中。所有的胰岛加在一起可以被认为是一个内分泌器管，约占胰腺体积的1％。在胰腺内，小的胰岛(直径至16μm)趋于分布遍及于外分泌组织中。这些小胰岛相当于占胰岛数量的75％，但只占体积的约15％。直径大于250μm的较大胰岛只占胰岛总数量的15％而体积却占60％。这些胰岛集中在较大的胰管和血管附近，并不被腺泡组织环绕。人体胰腺可以含有超过100万个胰岛，且每个胰岛典型地由几千个细胞组成。每个胰岛由胰岛素产生中心的β细胞(B细胞)和环绕的含胰高血糖素的α细胞(A细胞)，含有生长激素释放抑制因子的δ细胞(D细胞)及含胰腺多肽的细胞(PP细胞)组成。产生胰岛素的B细胞占细胞的大多数，并组成人体约80％的胰岛。
胰岛移植的临床应用由于不能防止胰岛的同种移植-异种移植的排斥反应，即由于受体的免疫系统攻击移植的胰岛而产生的对移植的胰岛的排斥反应，而受到限制。为中和排斥反应，移植胰岛要联合应用免疫抑制剂。
但是免疫抑制疗法已证实有双重杀伤力，当减少排斥反应危险的同时，它损伤机体的全面免疫防御系统。各种保护移植的组织免受受体免疫反应损伤的方法已由许多研究者进行了探索，如下所述，尽管已有暂时成功的报道(见Lacy，Diabetes Reviews1(1)76(1993))，但仍未获得长期有效的方法。
保护移植组织免受受体免疫反应损伤的五种主要方法都包括试图使移植组织分离于受体的免疫系统，目前使用的免疫分离技术包括脉管外扩散室、脉管内扩散室、脉管内超滤室、微胶囊化及大胶囊化。但因以下的一个或多个问题所有方法都失败了受体对移植物的纤维变性反应，移植物的不稳定性，营养素经过半透膜的扩散受限，促泌素及分泌物的渗透性，及经过半透膜屏障的扩散时滞。
例如，将活性细胞，组织及其它不稳定的生物膜封入半透膜的微胶囊化程序已被Lim在1978年开发出(Lim，Research reportto Damon Corporation(1978))。Lim使用藻酸盐及聚L-赖氨酸的微胶囊包住Langerhans胰岛。1980年报道了在糖尿病研究中首次成功应用这一新技术(Lim et al Science 210908(1980))。这些微胶囊化的Langerhans胰岛移植物使患糖尿病的动物保持一种良好血糖状态。但是重做这些实验的其它一些研究者发现藻酸盐引起组织反应且不能再得到Lim等的结果(Lamberti，et al，Applied Biochemistry and Biotechnolgy 10101(1984)；Dupuy，et al，Jour.Biomed.Material and Res.221061(1988)；Weber，et al，Transplantation 49396 (1990)；and Soon-Shiong，etal，Transplantation Proceedings 22754(1990))。这些聚合物的水溶性现被认为导致了在体内这些微胶囊有限的稳定性及生物相容性(Dupuy，et al.supra，Weber，et al.supra，Soon-Shiong，et al.supra，and Smidsrod，Faraday Discussion ofChemical Society 57263(1974))。
近来I wata等将琼脂糖用于同种异基因胰岛的微胶囊化，发现其可被用作制备微珠的培养基(I wata，et al.Jour.Biomedical Material and Res.26967(1992))。在他们的研究中，将1500-2000个胰岛在5％琼脂糖中单独地微胶囊化且将其移植到链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠体内。此移植物可存活较长一段时间且受体无定限地保持正常糖血。
但他们的方法存在许多弊端，它不方便且不准确。例如，许多珠只部分被涂覆且几百个珠只是空琼脂糖形式，这样要求附加时间将已胶囊化的胰岛从空珠中分离出来。此外，多数被移植的微珠聚集在盆腔内，且要求大量胰岛完全地被涂覆成单独的珠以达到正常糖血，更进一步地，被移植珠难于取出，易碎且受到轻微损害时易释放出胰岛。
大胶囊化程序也已被试验，已生产了各种不同物质的大胶囊，如聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯，聚氯乙烯-共-丙烯酸及醋酸纤维素用以Langerhans胰岛的免疫分离(见Altman，et al.Diabetes 35625(1986)Altman，et al.，Transplantation American Society of ArtificalInternal Organs 30382(1984)；Ronel，et al.Jour.Biomedical Material Research.17855(1983)；Klomp.et al，Jour.Biomedical Material Research 17865-871(1983))。在所有这些研究中，只得到糖血的暂时正常化。
Archer等(Journal of Surgical Research，2877(1980))使用丙烯酸共聚物中空纤维暂时防止异体移植胰岛的排异反应，他们报道移植到糖尿病仓鼠体内的分散在中空纤维中的新生鼠胰腺移植物可长期存活。最近Lacy et al.，Seience 2541782-1784(1991)进一步证实了他们的结果，但发现正常血糖状态是暂时的。他们发现当将胰岛注入纤维中时，它们聚集在空心管内导致聚集的胰岛中心部分坏死，此中心坏死妨碍移植物的存活。为解决此问题，他们使用藻酸盐以将胰岛分散在纤维中，使用此方法可得到长期存活的移植物。但此实验未被广泛重做，因此其作为人体胰岛移植培养基的膜的功能仍存疑问。
这样仍需要分泌细胞移植法，特别地需要不用长期使用免疫抑制剂而使胰岛的同种移植物和异种移植物存活的方法。
本发明已惊人地发现将分泌细胞在亲水凝胶中大胶囊化能产生有功能的、非免疫原性的大珠(macrobead)，其能被移植到动物体内且能长时间贮存。本发明对分泌细胞的大胶囊化为分泌细胞移植提供了更有效及易操作的技术。此大胶囊化技术也可被用于使其它生物制剂大胶囊化，如酶、微生物、包括重组生产的营养制剂的营养制剂、细胞毒素制剂及化疗制剂。可以给予大胶囊化的生物制剂以治疗已知对该生物制剂有反应的疾病。发明概述因此本发明的一个目的在于提供一种分泌细胞大珠，其能被移植到动物体内以治疗由受体分泌细胞功能损伤引起的疾病。
本发明的另一目的在于提供一种能长期贮存的分泌细胞大珠。
为完成这些和其它目的，根据本发明的一个方面，提供了一种生产琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠、琼脂糖涂覆的明胶海绵(gelfoam)分泌细胞大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠的方法。
根据本发明的又一方面，提供了一种治疗患有分泌细胞产物不足所致疾病的病人的方法，其包括为病人移植治疗有效量的选自由琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠、琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠组成的一组的分泌细胞大珠。
根据本发明的再一方面，提供了一种保存分泌细胞的方法，包括形成选自由琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠、琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠一组的大珠，及培养所述分泌细胞大珠。
本发明的其它目的、特征及优点通过以下详细论述将变得显而易见。需清楚的是，详细论述及具体实施例在表明本发明优选的实施方案的同时，本领域技术人员从此详细论述中将显而易见地了解本发明的精神及范围内的各种变化及改进。
附图简述
图1及图2显示琼脂糖涂覆的胶原-琼脂糖胰岛大珠。
图3显示移植琼脂糖涂覆的胶原-琼脂糖胰岛大珠的糖尿病小鼠的葡萄糖水平。
图4显示移植琼脂糖涂覆的明胶海绵胰岛大珠的糖尿病小鼠的葡萄糖水平。
图5显示移植琼脂糖涂覆的琼脂糖大珠的糖尿病小鼠的葡萄糖水平。
图6显示移植游离胰岛后糖尿病小鼠的葡萄糖水平。
图7显示移植琼脂糖涂覆的胶原-琼脂糖大珠及游离胰岛后糖尿病小鼠的葡萄糖水平。
图8表明正常鼠、由链脲佐菌素所致糖尿病小鼠、在肾被膜中接受同种移植物的由链脲佐菌素所致糖尿病小鼠(KCT鼠)及接受琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原胰岛大珠、琼脂糖涂覆的明胶海绵胰岛大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖胰岛大珠的由链脲佐菌素所致糖尿病小鼠(统称“珠鼠”)的葡萄糖耐量试验结果。
本发明的详细论述本发明涉及在亲水凝胶材料中对生物制剂，优选为分泌细胞大胶囊化；应用大胶囊化生物制剂，优选为分泌细胞的治疗方法，及通过大胶囊化保存优选为分泌细胞的生物制剂的方法，亲水性凝胶材料包括琼脂糖、胶原-琼脂糖和明胶海绵-琼脂糖的结合体。明胶海绵在此后被称作明胶海绵。
术语“生物制剂”指的是活体生物及其产物，例如蛋白质、酶、激素、多肽、血清、抗体及抗生素及遗传工程化的细胞。生物制剂包括酶如葡萄糖氧化酶、乳糖酶复合体，微生物如排除氨和尿素的Klebsiella aerogenes，营养制剂，包括重组产生的营养制剂如重组产生的生长激素，及细胞毒剂。
术语“分泌细胞”包括胰岛，尽管严格地讲一个胰岛不是分泌细胞，但通常成群的分泌细胞分散地遍及在胰腺并组成其内分泌部分。在人中，它们由至少四种不同类型的分泌细胞组成分泌胰高血糖素的α细胞；占总数的70-80％并分泌胰岛素的β细胞；分泌生长激素释放控制因子的δ细胞及分泌多肽激素的多肽细胞。
由前所述，移植物与受体必须相容。在生物学研究中已较长时间使用琼脂糖，其品质已被很好控制。胶原是哺乳动物的最丰富的蛋白质，提供牢固的机械支持及为细胞复制、分化、器官发生、个体生长及创伤修复提供生物学空间，胶原也具有良好的生物相容性。明胶海绵是非免疫原性的且已广泛地用于外科手术过程中，它与分泌细胞也有很好的相容性。
生物制剂，优选分泌细胞首先用本领域公知步骤进行分离。在一优选的实施方案中，胰岛在其被大胶囊化之前要在4℃、24℃或37℃下进行培养，此方法允许人们在分离损伤之后只选择存活的胰岛，胰岛也变德较小免疫原性从而防止大珠的纤维化。
在本发明的一个实施方案中，将生物制剂、优选胰岛、更优选约50,000-700,000个胰岛悬浮在胶原水溶液中，优选约0.5％-2％的去端肽的胶原(atellocollagen)溶液。去端肽的胶原可通过用胃蛋白酶处理胶原以除去与胶原分子间交叉连接有关的抗原性端肽而得到。然后将约0.5-5％、优选约1％的琼脂糖加人到悬浮的胰岛中形成悬浮于胶原与琼脂糖混合物中的胰岛。接着使用本领域公知的技术，优选通过将混合物滴入矿物油或Teflon片材上，使含胰岛的混合物转变成半固体珠。然后将此半固体珠转到抗生素培养基中，冲洗，并在聚合胶原的标准条件下培养，优选在37℃增湿的5％CO2环境下培养，以形成固体胶原-琼脂糖大珠。
在本发明的另一实施方案中，将生物制剂、优选胰岛、更优选约50,000-700,000个胰岛涂到明胶海绵表面(3-5cm)，滚动此明胶海绵成球形，将3％-5％琼脂糖加到球上形成珠。
在本发明的又一实施方案中，将生物制剂、优选胰岛、更优选约50,000-700,000个胰岛放入约含0.5-5％琼脂糖、优选约含1％琼脂的琼脂糖溶液中，然后通过将此混合物与矿物油或Teflon接触使此混合物转变成大珠。将珠转到抗生素培养基中，冲洗，然后优选在37℃增湿的5％CO2环境下培养过夜。
在所有前述的实施方案中，大珠是如下被琼脂糖均匀涂覆的优选在含约500-2000μl的5％-10％琼脂糖的Teflon匙中滚动此珠3-4次。类似地，此处使用的术语“生物制剂大珠”指的是以珠形式大胶囊化的生物制剂。
大珠可被用作载体以传送生物制剂至体内其将发挥已知功能处。在一个珠内可以以囊包被多于一种的生物制剂，例如一个大珠能包含多种酶，如血红蛋白和葡萄糖氧化酶。如此的珠能有助于除去胆红素。这些珠能被用于消化酶(乳糖酶复合体)的口服或用于从体内选择性除去不合需要的氨基酸。酶的胶囊化也能防止酶在体腔内的降解。进一步地，重组基因产物使用胶囊包被作为培养基能安全地被传送。例如K.aerogenes基因被大胶囊化在大珠内以排除尿素及氨。在生物制剂对受体有免疫原性时，大珠可使在给予此生物制剂时不需使用免疫抑制剂或降低免疫抑制剂的使用数量。
分泌大珠可通过为病人移植分泌细胞大珠来治疗因病人分泌细胞功能损伤所致疾病，例如胰岛素依赖型糖尿病、生长因子缺乏症、内分泌失调症。此大珠可被置入适当部位以进行特殊的治疗，例如含肝细胞的大珠可被植入腹腔内以治疗与肝功衰退有关的疾病。一优选的应用方案是为病人移植5-10个且每个含50,000-700,000个胰岛的胰岛大珠以治疗胰岛素依赖型糖尿病，此大珠可被置入到腹膜腔内。
分泌细胞大珠是以足以治疗疾病的量移植给病人，达到治疗目的所需药量称为“治疗有效量”或“有效量”。使用的有效量依赖于疾病的严重程度、病人的一般状态，应用途径、大珠置入部位及分泌细胞大珠是否与其它药物联合应用。
分泌细胞大珠可与免疫抑制剂联合或优选不使用免疫抑制剂以应用于同种及异种移植。在一优选的实施方案中，治疗慢性或急性胰岛素依赖型糖尿病人是不使用免疫抑制剂为病人异种移植动物胰岛，例如，猪、牛、小鼠、大鼠、鸟或其它合适物种的胰岛。分泌细胞大珠也能与其它药物如三联药(环孢菌素、硫唑嘌呤、氢化可的松)、雷帕霉素、deoxyspergualin或抗体联合应用治疗疾病。
大珠也可被用作长时间贮存生物制剂、优选分泌细胞的工具。为保持生物制剂、优选分泌细胞的活性，需培养此生物制剂、优选分泌细胞大珠直到其被移植到动物体内。
当分泌细胞是胰岛时，胰岛大珠要在24℃温度下培养。
实施例实施例1分离胰岛用Gotoh，et.al.Transplantation 40437(1985)所述方法的改进方法从大鼠体内分离出胰岛。
将胶原溶液(XI型胶原酶，Sigma Chemical，St.Louis，MO，1mg/ml，含2mg/ml Sigma V型牛血清白蛋白及1mg/ml CaCl2)经普通胆小管注入胰腺(Gotoh etal，Transplantation 40437(1985))。取出胰腺并收集在冰上的烧瓶中。一旦4只大鼠的胰腺已被收集完，将烧瓶放入38℃水浴中30分钟。用冷的(8℃)HBSS(Hank’s平衡盐溶液)冲洗得到的被消化的组织4次。
未消化的组织、大淋巴结及其它无关物通过组织的反复流动随上清液的除去而被除去。提纯的胰岛在由25％、23％、21％及11％的Ficoll层组成的非连续Ficoll梯度下被分离，该梯度在Euro-Collins溶液(Frescenius AG，Gluchen Steiweg，Homburg V.D.H.)中制备，在2000rpm下离心16分钟。在11％和21％及21％和23％的Ficoll层分界处收集胰岛，将每个组分的胰岛合并起来并用含10％胎牛血清的HBSS溶液冲洗4次。
将合并的胰岛转入含RPMI完全培养基的培养皿中，即冷的RPMI 1640培养基(GIBCO，Grand Island，NY)，补加25mM HEPES，热失活的胎牛血清(10％)，及抗生素-抗霉素溶液(1ml/100ml)其含有100μg/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素及25μg/ml两性霉素B。残存的非胰岛腺泡、脉管、导管或淋巴结组织借助解剖用显微镜加以识别，用细尖无菌吸管小心地除去。用二苯基硫卡巴腙对胰岛制备物加以染色以确定其最终纯度。
分离后，将胰岛在含10ml RPMI培养基的细菌学塑料皿(100mm)中，在37℃于含5％CO2的增湿环境中培养4天。每天更换培养基，然后胰岛被直接移植或大胶囊化。
实施例2A制备琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原胰岛大珠将用实施例1的方法得到的1000个胰岛在去掉胎牛血清的RPMI完全培养基中冲洗4次。然后将此胰岛加入到含50μl溶于磷酸盐缓冲盐水的1％去端肽胶原溶液的试管中使胰岛悬浮。将保持在60℃的、在RPMI或MEN(最小基本培养基)中制备的100μl 1％低粘度的琼脂糖(SigmaType XII)加入到胶原-胰岛悬浮物中，然后立即将管中物以单个的大滴转入到保持在室温的无菌矿物油或Teflon片材上。1分钟后，滴状物变成半固体大珠，然后将其转到37℃的RPMI抗生素培养基中，用同样培养基冲洗此大珠3次以除去所有的油。最后，用完全培养基(37℃)润洗二次，在37℃增湿的含5％CO2环境下培养过夜。在此阶段期间，胶原聚合而胰岛留在胶原纤维上。
第二天，将固体大珠转入含约1ml 5％的在RPMI或MEM培养基内的琼脂糖的Teflon匙中，在此溶液中滚动固体大珠2-3次以均匀涂覆它们。在琼脂糖固化前将此大珠转到在Teflon皿中的矿物油中以获得表面光滑的大珠。60秒钟后，从矿物油中取出大珠并用RPMI抗生素培养基冲洗3次，然后用RPMI完全培养基冲洗2次。在37℃增湿的含5％CO2环境下培养过夜。琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原胰岛大珠如图1及图2所示。
B制备琼脂糖涂覆的明胶海绵胰岛大珠首先将一小片3mm2的明胶海绵浸入RPMI完全培养基中，挤出培养基，将明胶海绵放置1分钟。用RPMI抗生素培养基冲洗根据实施例1制备的1000个胰岛4次，然后使其悬浮在10μl的RPMI抗生素培养基中。用细尖塑料吸管将其吸出涂布于明胶海绵表面上，20秒钟后，将明胶海绵滚动成小球，将50μl 5％琼脂糖倒在此球表面以形成胰岛大珠。
为均匀地用5％琼脂糖涂覆大珠，在Teflon匙中将500μl 5％琼脂糖加入大珠中并滚动3-4次。在琼脂糖固化前，将大珠转入矿物油中，转动器皿以得到表面光滑的大珠。用RPMI抗生素培养基冲洗此大珠3-4次，然后用RPMI完全培养基润洗2次，在用于移植物前培养此大珠过夜。
C制备琼脂糖涂覆的琼脂糖胰岛大珠首先用RPMI抗生素培养基冲洗根据实施例1的方法获得的1000个胰岛4次，将胰岛转入含50μl RPMI抗生素培养基的试管中并使其悬浮在其中。在试管中加入100μl 1％琼脂糖溶液，将试管内所有物以单个的大滴转入到无菌矿物油或Teflon片上，1分钟后此大滴固化成大珠，将此大珠转到RPMI抗生素培养基中，保持在37℃。然后用同样培养基冲洗大珠3次以除去油，再用RPMI完全培养基润洗2次，在37℃增湿的含5％CO2环境下培养此珠过夜。
第二天，将这些大珠转到含1ml 5％的在RPMI或MEM培养基中的琼脂糖的Teflon匙中。为用琼脂糖均匀涂覆大珠，将大珠在琼脂糖内温和地滚动2-3次，在琼脂糖固化前将大珠转到在Teflon皿内的矿物油中，60秒后，从矿物油中取出珠且用RPMI抗生素培养基冲洗3次及用RPMI完全培养基润洗2次，然后将此珠培养过夜。
实施例3将胰岛大珠移植到小鼠中A受体鼠和供体大鼠使用的小鼠是雄性C57BL/6及BALB/c种，用单次静脉注射链脲佐菌素(170-200mg/kg)使受体小鼠产生糖尿病。
在引发糖尿病前测定未禁食时血浆葡萄糖水平，使用Exac Tech Pen Senson通过尾静脉血样监测受体鼠所有血糖水平，只使用移植当天血清葡萄糖水平＞400mg/d1的那些鼠。
使用Wistar Furth大鼠作为异种移植供体。
B向腹模腔内异种移植胰岛大珠在异种移植时，将分别由实施例2(A)、(B)、(C)得到的胰岛大珠轻轻放入含RPMI抗生素培养基的各自的平板中，为除去所有血清蛋白质，更换培养基3次，用avertin麻醉糖尿病受体小鼠，做中线切口将一单个胰岛大珠置入腹膜腔，用可吸收缝线在切口处两层缝合。对照小鼠i、p(腹膜内)接受空大珠、i、p(腹膜内)接受游离胰岛、或空大珠及游离供体胰岛。
移植后，每天或每隔一天检查每个受体的血糖直到达到正常范围，此后每周只查2-3次血糖，如果血清葡萄糖＜200mg/d1且持续抽血仍保持在此水平，则此移植物被认为是技术上成功的。如果血清葡萄糖浓度在一段短暂正常水平后增高超过200mg/d1，则认为此移植物被排斥。如果血糖从未正常(即持续保持＞200mg/d1)，则认为此移植物失败或成为“基本上无功能的”。
C腹膜内葡萄糖耐量试验移植约70-84天后进行葡萄糖耐量试验，将葡萄糖溶液(1.0g/kg体重)腹腔内注射入已禁食6小时(9am-3pm)的小鼠体内，取注射前及注射后(0、30、60、120分钟)血样，使用Exac Tech Pen Sensors测定血浆葡萄糖水平。
为了对照，对正常C57BL/6和BALB/c小鼠、由链脲佐菌素引发的未移植胰岛的C57BL/6和BALB/c糖尿病小鼠、及由链脲佐菌素引发的经在肾被膜内移植游离胰岛的BALB/c糖尿病小鼠(“KCT”小鼠)进行葡萄糖耐量试验。
进行对照实验以证实糖尿病小鼠正常血糖状态的得到是由于大胶囊化的胰岛而不是大珠自身，因此以与实施例2(A)及(B)所制珠相同的方法制备空的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原大珠和琼脂糖涂覆的明胶海绵大珠。
D腹膜内异种移植及葡萄糖耐量试验的结果在由链脲佐菌素引发的STZ型糖尿病的C57BL/6小鼠内移植胰岛大珠后，观测到的未禁食血浆葡萄糖水平的变化显示于图3及图4。琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原胰岛大珠及琼脂糖涂覆的明胶海绵胰岛大珠的受体保持超过60天的正常血糖状态，且此期间小鼠的体重平均增长3g。当移植琼脂糖涂覆的琼脂糖胰岛大珠时，6只动物中的2只在移植21-33天后趋于正常血糖水平，且此后一直保持此良好血糖水平(见图5)，其它所有的实验动物未达到此良好状态。空的大珠(n＝6)对血糖无影响。
当腹膜内移植游离胰岛时，7只动物中6只在移植后1天趋于正常血糖水平，但其保持此状态仅3-10天(图6)。当游离胰岛与由琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原大珠或琼脂糖涂覆的明胶海绵大珠制成的空珠一起移植时，所有动物在24小时内趋于正常血糖水平且保持此状态超过12天(图7)，随后所有动物趋于高血糖水平。在随后的90天含空的大珠的动物不发生组织排斥反应。
进行葡萄糖耐量试验后得到的结果显示于图8，在正常BALB/c和C57BL/6小鼠及“KCT”小鼠中，血浆葡萄糖水平在30分钟升至最高且在120分钟降至基本水平。
当进行将大胶囊化胰岛及未胶囊化胰岛移植到肾被膜内的试验时得到相似的结果。
这些实验结果证实，琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原胰岛大珠、琼脂糖涂覆的琼脂糖-明胶海绵胰岛大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖胰岛大珠显示了人工杂交器官所需的特性。尽管三种类型都能成功地分泌胰岛素，但由于从最低数目的经过移植的动物中得到的结果的一致性，琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖-明胶海绵大珠更适于作为人工生物杂交器官。此外，所有三种类型的珠均显示无副作用。在腹膜内保持游离的大珠显示既无组织排斥，也不与其它器官发生粘连。这样，这些生物杂交胰岛在其原始居处-胰腺内，以大胶囊化珠高效地发挥其功能。
所有小鼠的血浆葡萄糖水平在30分钟升至最高且在120分钟降至基本水平。
实施例5胰岛的更长期的保存寿命将根据实施例1(A)、(B)、(C)制备的大胶囊珠在RPMI完全培养基中于37℃培养4周，以试验其在体内及体外的长期保存性，结果发现，培养4周的大胶囊化胰岛与那些只培养1天的大胶囊化胰岛具有相近的功能。
本实施例证实，本发明的大胶囊包裹的方法能用于分泌细胞，优选胰岛的保存。
权利要求
1.一种生产琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠的方法，包括(a)使分泌细胞悬浮在含有胶原的溶液中，(b)向步骤(a)所述的悬浮的分泌细胞中加入琼脂糖以形成悬浮在琼脂糖及胶原的混合物中的分泌细胞，(c)从步骤(b)所述的悬浮的分泌细胞形成胶原-琼脂糖半固体大珠，(d)处理步骤(c)所述的胶原-琼脂糖半固体大珠，使在所述半固体大珠中含有的胶原聚合，形成固体胶原-琼脂糖大珠，(e)用琼脂糖涂覆步骤(d)所述的固体大珠以获得琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括在5％琼脂糖中滚动步骤(d)所述的固体大珠，使所述的滚动后的固体大珠与矿物油接触，冲洗所述滚动后的大珠以获得所述的琼脂涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的分泌细胞是胰岛。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的胰岛是人胰岛。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述的胰岛是牛胰岛。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述的胰岛是猪胰岛。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述的大珠包含约50,000-70,000个胰岛。
8.一种生产琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠的方法，包括(a)使分泌细胞悬浮在明胶海绵中，(b)滚动所述的含有所述悬浮的分泌细胞的明胶海绵使其成为球形，(o)用琼脂糖涂覆所述的球以获得琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠。
9.如权利要求8所述的方法，其中步骤(c)包括(1)在所述球表面倒上琼脂糖以形成大珠，(2)在5％琼脂糖中滚动所述的大珠，(3)使步骤(2)产生的所述的滚动后的大珠与矿物油接触，(4)冲洗步骤(3)的大珠以形成所述的琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述的分泌细胞是胰岛。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述的胰岛是人胰岛。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述的胰岛是牛胰岛。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述的胰岛是猪胰岛。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述的大珠含有约50,000-70,000个胰岛。
15.一种生产琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠的方法，包括(a)使分泌细胞悬浮在琼脂糖中，(b)从步骤(a)所述的悬浮的分泌细胞形成大珠，(c)在增湿的空气中培养步骤(b)所述的大珠，(d)用琼脂糖涂覆步骤(c)所述的大珠以形成琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠。
16.如权利要求13所述的方法，其中步骤(e)包括在5％琼脂糖中滚动步骤(c)所述的固体大珠，使所述的固体大珠与矿物油接触，冲洗所述滚动后的大珠以形成所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述的分泌细胞是胰岛。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述的胰岛是人胰岛。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述的胰岛是牛胰岛。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述的胰岛是猪胰岛。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述大珠含有约50,000-70,000个胰岛。
22.一种琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠。
23.如权利要求22所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述分泌细胞是胰岛。
24.如权利要求23所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述胰岛是人胰岛。
25.如权利要求23所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述胰岛是牛胰岛。
26.如权利要求23所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述胰岛是猪胰岛。
27.一种琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠。
28.如权利要求27所述的琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠，其中所述的分泌细胞是胰岛。
29.如权利要求28所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述的胰岛是人胰岛。
30.如权利要求28所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述的胰岛是牛胰岛。
31.如权利要求28所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述的胰岛是猪胰岛。
32.一种琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠。
33.如权利要求32所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠，其中所述的分泌细胞是胰岛。
34.如权利要求33所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述的胰岛是人胰岛。
35.如权利要求33所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述的胰岛是牛胰岛。
36.如权利要求33所述的琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠，其中所述的胰岛是猪胰岛。
37.一种治疗具有由分泌细胞功能损害所致病情的病人的方法给所述病人移植治疗有效量的、选自由琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠、琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞珠组成的一组的分泌细胞大珠。
38.如权利要求37的方法，其中所述的病情是胰岛素依赖型糖尿病。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述分泌细胞是胰岛。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述胰岛是人胰岛。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述胰岛是猪胰岛。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述胰岛是牛胰岛。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述分泌细胞大珠被放置于腹膜腔内。
44.如权利要求39所述的方法，其中植入约5-10个大珠，每个大珠含有约50,000-70,000个胰岛。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述的分泌细胞大珠是琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠。
46.如权利要求39所述的方法，其中所述的分泌细胞大珠是琼脂糖涂覆的明胶海绵分泌细胞大珠。
47.如权利要求39所述的方法，其中所述分泌细胞大珠是琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠。
48.保存分泌细胞的方法，包括(a)形成选自由琼脂糖涂覆的琼脂糖-胶原分泌细胞大珠、琼脂糖涂覆的明海绵分泌细胞大珠及琼脂糖涂覆的琼脂糖分泌细胞大珠组成的一组的大珠；以及(b)培养所述的分泌细胞大珠。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述的分泌细胞是胰岛。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述的胰岛在24℃或37℃培养。
全文摘要
本发明涉及在亲水凝胶材料中对分泌细胞的大胶囊化，使用大胶囊化的分泌细胞的治疗方法及通过大胶囊化来保存分泌细胞的方法。
文档编号A61K9/16GK1141650SQ95191589
公开日1997年1月29日 申请日期1995年1月12日 优先权日1994年1月13日
发明者坎蒂·基恩, 艾伯特·L·罗宾 申请人:罗格森研究所