对在生物人工器官中被囊细胞的生长控制的制作方法

专利名称：对在生物人工器官中被囊细胞的生长控制的制作方法
技术领域：
本发明涉及在生物人工器官内控制被囊之细胞生长的方法和组合物。
生物人工器官“BAO”是含活细胞并被设计用以提供宿主所需的代谢功能的装置。
在BAO中被囊的细胞给宿主提供一种或多种生物活性分子，可以用这些分子防止或治疗许多临床症状，缺陷和疾病状态。
例如可以用含分泌胰岛素细胞的BAO治疗糖尿病。通过使用分别分泌甲状旁腺激素和促红细胞生成素的细胞可以治疗相似的其他疾病如甲状旁腺功能减退和贫血。
还可以用生物人工器官供应生物活性分子以治疗或预防神经变性性疾病如Huntington’s疾病，帕金森氏病，老年性痴呆或获得性免疫缺陷综合症相关的痴呆。另外，还可以通过BAO提供淋巴因子和细胞因子以调节宿主免疫系统。可以通过生物人工器官提供的其他生物活性分子包括儿茶酚胺，内啡肽，脑啡肽以及其他用于治疗疼痛的阿片样物质或非阿片样物质肽。通过使用BAO也可以治疗酶缺陷。此外，生物活性分子可以从宿主中取出或消除有害分子。例如，BAO可以含有生产可用于从宿主中“扫除”胆固醇之生物活性分子的细胞。
各种“大被囊”BAO是已知的。参见如Aebischer(美国专利5158881)，Dionne等人(WO 92/03327)，Mandel等人(WO91/00119)，Aebischer(WO 93/00128)。BAO还包括血管外扩散室，血管内扩散室，血管内超滤室和微被囊。参见如Lim et al.，Science210908-910(1980)；Sun，A.M.，Methods in Enzumology 137575-579(1988)；Dunleavy et al.，(WO 93/03901)和Chich et al.，(美国专利5002661)。
由于BAO中被囊的细胞提供所需的代谢功能，所以令人满意的是那些最好提供影响所述功能的生物活性分子的细胞。通常在BAO中使用分化的非分裂细胞优于正在分裂的细胞，原因是它们可以使所需生物活性分子的生产最有利。例如由于认为分化特异性基因的表达和细胞分裂是拮抗过程，因此许多分化的非分裂细胞生产的所需治疗蛋白质的量大于正在分裂的细胞。Wollheim，“Establishment and Culture of Insulin-secreting βCell Lines，”Methods in Enzumology，192，p.223-235(1990)。细胞复制能力随细胞分化而降低。在许多情况下，增殖和分化是相互排斥的。Gonos，“Oncogenes in Cellular Immortalisation and Differentiation，”13，Anticancer Research，p.1117(1993)。
由于用于混入BAO中之组织的功能特性常常是依体内分化组织的特性而定义的，所以，使用分化的组织是有利的。使用分化的非分裂细胞的另一优点是在BAO中的细胞数目将保持相对稳定。这样又会导致产生更容易预测的结果和对受体宿主相对稳定的剂量。另外，分化的细胞更适用于被囊了一种以上分泌生物活性分子之细胞的BAO。在所述BAO中，如果使用正在分裂的细胞，不同类型的细胞可能会以不同的速率生长，从而导致某一类型细胞过度生长。通过使用分化的非分裂细胞，更容易控制两种或多种类型协同细胞的相对比例。
尽管在许多情况下使用分化的细胞是有利的，但是使用直接从哺乳动物中分离的分化细胞也存在着许多问题。
首先，分离的组织有潜在的污染，这要求对从各动物中取出的组织进行既费钱又花时间的检测以确保所述组织物无病原体。
第二，由于在分离过程中使用机械或酶促分离方法，所以有可能在分离过程中损坏组织。机械操作不总是易标准化，这样会导致分离之间的差异。
第三，在分离过程中可能会发生局部缺血，引起组织损伤。
第四，由于组织供体之间的差异，很难有可重复的产率。例如动物源的年龄，性别，健康状况，激素状态可能会影响所需组织的产率和质量。
第五，有时没有足够的源组织来满足BAO的预定要求。这会发生在例如，源组织来源于小器官或对组织的最终要求量很高的情况下。如果待分离组织的来源是人，经常会有供体组织的严重短缺。
第六，在一些情况下，需要用遗传工程方法修饰BAO中所用的细胞。到目前为止，体外很难用遗传工程方法修饰非分裂组织，而且待修饰细胞的产率和特性也不确定。因此，由于上述问题，在使用分化的非分裂细胞的同时，还需要生产并保持用于被囊在BAO中的分化的非分裂细胞的方法。
由于这些问题，已经赞成在BAO内使用正在分裂的细胞和细胞系以提供所需的生物功能。使用正在分裂的细胞的一个重要的优点是所述细胞可以在体外大量生长并根据病原体进行筛选和收集成库。这使得可以以较低的生产成本几乎无限制地供应组织。可以将分离方法如细胞分类或克隆用于细胞库以发育具有改进特征的亚群体。另外，正在分裂的细胞和细胞系比分化的非分裂细胞更适合于使用遗传工程方法。导入异源重组DNA的能力使得有许多新的可能性来改变被囊在BAO中之细胞的功能或表型。这样反过来又给BAO提供了更广泛的治疗用途。
但是，正如上文所讨论的，在BAO中被囊正在连续分裂的细胞的缺点是不能充分调节装置的的细胞数目，从而导致在生产所需生物活性分子方面的可预测性降低。
尽管在大多数情况下，限制或使BAO内的细胞生长最小，但在其他情况下，如，将BAO植入“敌对的”环境中，就会需要使细胞在BAO中缓慢增殖并保持细胞数目。
一般有另一个与被囊细胞有关的问题。各种类型的细胞都有细胞粘附特性，以致细胞彼此倾向于粘附并形成稠密的团块或聚集，特别是如果所述细胞得不到足够的底物的情况下。由于营养和氧相对难以到达植入在核中的细胞或由于在核内有毒产物的堆集，所述细胞簇可发展成中央坏死区。坏死的组织还可释放过量的细胞蛋白质，异蛋白质或其他对存活细胞有害的因子，如引发巨噬细胞或其他免疫反应的因子会多余地充斥在宿主中。当细胞用半透膜衣被囊在BAO中时，由于跨膜的扩散约束，这个问题就会更加严重。在BAO中氧会更少，得到营养的宿主就更少。另外，废物在BAO中积累。
这些稠密的细胞量可缓慢地形成细胞生长的稠密菌落或在重新结合新鲜分散的细胞或有细胞-表面粘附蛋白介导的组织上迅速形成。具有高代谢活性的细胞或组织对于氧或营养丧失的影响是特别敏感的，而且在植入大细胞簇中央后很短的时间内死亡。许多内分泌组织(正常情况下由稠密毛细床支持)有这样的行为；在被被囊后，胰岛似乎就是特别敏感的。
这样就需要控制被囊细胞生长的方法和组合物，所述细胞组合了正在增殖细胞和分化的非分裂细胞的各种优点。本发明提供了方法和组合物，借助它们可以使细胞在体外无限增殖和发展，而且在细胞被被囊在BAO中时，可以控制增殖和分化之间的平衡以便所述装置以所需的方式运行。因此，本发明可以调节在BAO中的细胞数目，并可因此提供改进了的被囊输出水平的调节方法。本发明还提供了通过控制在BAO中的细胞位置而控制细胞生长的方法，由此减少在BAO中不希望有的坏死细胞核的形成。就特定类型的被囊细胞而言，控制BAO中的细胞数目和细胞位置还有利于促进BAO膜和其他装置参数的最优化。这是因为在BAO中，用于固定的细胞群体的所需装置的特征比用于正在分裂细胞群体的更容易确定。另外，可以长期输送生物活性分子。
本发明通过提供用于控制被囊到BAO中之细胞的分布(即在BAO中的细胞数目或细胞位置，或兼而有之)的方法和组合物而致力于解决上述问题。本发明的方法和组合物包括(1)修饰被囊到BAO中之细胞的方法和组合物和(2)修饰BAO内生长表面的方法和组合物。
用于细胞操作的方法和组合物包括用编码影响细胞增殖或分化之产物的基因对细胞进行遗传改变。所述处理包括提供抑制增殖或诱导分化的化学化合物或生长因子。另外，所述处理可包含从生长介质中除去刺激增殖或抑制分化的化学化合物或生长因子。所述处理可以在被囊到BAO中之前或之后进行，优选的是在被囊之前。另外可以用辐射控制细胞增殖。
用于生长表面修饰的方法和组合物包括用一种或多种细胞外基质分子(“ECM”)包被至少一个BAO内的生长表面。可以将ECM直接包被到BAO内的腔表面或任何内支持物上，或包被到微球载体(“微载体”)上。可以再将细胞或细胞引种的微载体悬浮于生理上抑制细胞增殖的基质物质中。此外，基质物质可以是用化学或肽衍生物衍生的。
另外，可以通过化学处理修饰BAO的生长表面以抑制细胞附着或增强细胞附着于BAO的腔表面。此外，可以通过在加入细胞前加入惰性支架来修饰生长表面。支架在生理上抑制细胞的过度生长并给细胞附着提供额外的位点。应理解各种用于细胞修饰和生长表面修饰的方法和组合物不是相互排斥的，而且可以组合使用。


图1描述了一个构建体的质粒图谱，它含有于SV40早期区融合的2.3kb的鼠Mx1启动子，其后有一来自小鼠β球蛋白3’非翻译区的BamH1-Xba1片段。
图2表示从被囊在对照，非衍生膜(在图注中表示为“0％”)或1％或5％PEO-PDMS衍生的膜(在图注中分别表示为“1％”和“5％”)中的BHK细胞，在4，11和25天后分泌的NGF(ng/ml/24h)。没用基质(在图注中表示为“无基质”)，用VitrogenTM基质(在图注中表示为“vit”)或琼脂糖基质(在图注中表示为“agse”)被囊细胞。
图3表示在没有琼脂糖基质(图注n-mat-008，0709-n-m)或存在琼脂糖基质(图注agaro-008，agaro-0709)时，从在CultiSphersTM生长的BHK细胞中NGF的释放。
图4表示在被囊到有惰性PHEMA支架的BAO中之后的1，14和28天，来自PC21A细胞儿茶酚胺的释放。A图表示基础儿茶酚胺的释放；图B表示K+激活的儿茶酚胺的释放。在图注中的缩写L-dopa，NEPI，epi，DOPAC，DA和HVA分别代表L-多巴，去甲肾上腺素，肾上腺素，dopac，多巴胺和高香草酸。
图5表示在被囊到有惰性PHEMA/MMA支架的BAO中之后的1，14和28天，来自PC21A细胞儿茶酚胺的释放。A图表示基础儿茶酚胺的释放；图B表示K+激活的儿茶酚胺的释放。在图注中的缩写L-dopa，NEPI，epi，DOPAC，DA和HVA分别代表L-多巴，去甲肾上腺素，肾上腺素，dopac，多巴胺和高香草酸。
图6表示在被囊在BAO中2，20，40和80天后，存在褐藻酸盐基质(图注CS/AL)或存在琼脂糖基质(图注CS/AG)时，从在CultisphersTM上生长的SV40/Dβ 4-NGF细胞L-多巴释放的情况。
本文所用的“生物人工器官”或“ BAO”是一种装置，是被设计用来植入到宿主中或被制造出在体外发挥功能并永久地或可取出地附着于宿主。BAO含有生产生物活性分子的细胞或活组织，所述生物活性分子对宿主有治疗作用。在植入到宿主受体中后，BAO应是生物上可相容的。因此，BAO不应引发使其不能操作或没有治疗用途的有害的宿主反应。例如通过在被膜周围形成纤维变性结构，限制营养物质扩散到其中的细胞中就会发生所述的不可操作性。有害作用还包括被膜的排异或有毒或致热化合物(如合成的聚合物副产物)从BAO中释放到周围的宿主组织中。
可以根据免疫隔离(immunoisolatory)特性建成含被囊细胞的BAO，所述特性防止宿主免疫系统的组分进入所述器官，由此保护生物人工器官中所含的细胞免于有害的免疫破坏。BAO的使用提高了可以在治疗中使用的细胞类型的多样性。在植入的BAO中，所述装置(可以是或不是免疫隔离的)通常含有在半通透性物理膜内生产所选之产物的细胞或组织，所述半通透性物理膜可以扩散营养物质，废物，然后分泌的产物进入到周围的宿主组织中并保留在含有它的细胞中，但同时使细胞和分子效应物免疫排异的有害作用最小。但并不是在所有的情况下都需要免疫隔离特性(例如，如果细胞是自体的或与宿主同系)。
“生物活性分子”是(a)可以在它被制造的细胞内发挥功能或(b)可在细胞表面表达并影响细胞于其他细胞或生物活性分子(例如神经递质受体或细胞粘附分子)的相互作用，或(c)可以从它被生产的细胞中释放或分泌并发挥其对宿主中不同靶细胞或靶分子(例如，神经递质，激素，生长因子或细胞因子)的作用的分子。
本文所用的术语“细胞”(除特别说明外)指任何形式，包括但不限于在组织、细胞团中所保留的细胞以及单个分离的细胞。本发明所用的细胞生产至少一种生物活性分子。
在BAO中细胞分布的控制指控制在BAO中的细胞数目，控制细胞在BAO中的空间位置或两者兼而有之。
在本发明中可以使用许多类型的细胞。这些包括已知的，公开可得到的不死的细胞系及正在分裂的初级细胞培养物。适用于实施本发明的可公开得到的细胞系的实例包括L-6细胞，MDCK细胞，LLC-PK细胞，β-CH3细胞，C2细胞，副(by)仓鼠肾(BHK)，中国仓鼠卵巢(CHO)，小鼠成纤维细胞(L-M)，NIH瑞士小鼠胚胎(NIH/3T3)，非洲绿猴细胞系(包括COS-a，COS-1，COS-6，COS-7，BSC-1，BSC-40，BMT-10和Vero)，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)，大鼠神经胶质肿瘤细胞(C6)，RAJI(人淋巴瘤)细胞，MOPC-31C小鼠浆细胞瘤，MN9D细胞，MN9H细胞，β-TC细胞，Hep-G2细胞，AT-T20细胞，β-细胞系如NIT细胞或RIN细胞，Ntera-2细胞(Pleasure et al.，Journ.Neuroscience，12，pp.1802-15(1992))和人星形细胞系如U-373和U-937。
可以使用的初级细胞包括从哺乳动物的CNS衍生的bFGF-反应性神经干/祖代细胞(Richards et al.，PNAS 89，pp.8591-8595(1992)；Ray et al.，PNAS90，pp.3602-3606(1993))，初级成纤维细胞，神经鞘细胞(WO92/03536)，星形细胞，少突神经胶质细胞和其前体，成肌细胞和肾上腺嗜铬细胞。例如一种所述的成肌细胞系是C2C12细胞系。
还可以根据所用的特定的生长控制和分化方法来选择细胞。例如，在通过导入化学物质诱导分化的方法中很容易使用干细胞。通常干细胞是体内静止的不分化的细胞，但是能够增殖并能产生具有生产大量祖代细胞的更多多干细胞，然后祖代细胞可产生分化的或可分化的子代细胞。干细胞代表了一类在培养中很容易扩增的细胞，通过施用特异性的生长因子可以分化到终。参见例如Weiss等人(PCT/CA 92/00283)。
根据本发明，成肌细胞是可被囊在BAO中的一类细胞。成肌细胞是肌细胞的前体细胞，最初来源于中胚层干细胞群体。成肌细胞是可经在培养基中分化而得到的细胞系，如L-6和β-CH3细胞。初级成肌细胞很容易从尸检或活检中取出的组织中分离，然后纯化并扩增。成肌细胞增殖并融合在一起形成分化的多核肌小管。肌小管不再分裂，但继续生产肌蛋白。在增殖时，可以很容易地对成肌细胞进行遗传工程处理以产生治疗分子。将一种或多种基因导入到成肌细胞中以产生所需生物活性分子的方法是已知的。成肌细胞能够迁移，融合到预先存在的纤维中，作为待导入基因的载体。Verma等人(WO 94/01129)；Blau等人，TIG，9，pp.269-74(9113)；WO 93/03768；WO 90/15862。然后被囊加工后的细胞并使其在BAO中分化或被囊分化细胞本身。
还可以根据所打算的应用来选择细胞。可以选择BAO中的细胞来分泌神经递质。所述神经递质包括多巴胺，γ-氨酪酸(GABA)，血清素，乙酰胆碱，去肾上腺素，肾上腺素，谷氨酸和其他肽神经递质。还可以使用合成并分泌活性神经递质激动剂，类似物，衍生物或片段的细胞，例如分泌溴隐定，多巴胺激动剂的细胞和分泌L-多巴，多巴胺前体的细胞。
可以根据其分泌的激素，细胞因子，生长因子，营养因子，血管生成因子，抗体，血管凝集因子，淋巴因子，酶，和前体治疗剂或激动剂，前体，活性类似物或其活性片段来选择细胞。这些包括脑啡肽，儿茶酚胺，内啡肽，脑啡肽，胰岛素，VIII因子，促红细胞生成素，物质P，神经生长因子(NGF)，胶质细胞系-衍生的神经营养因子(GDNF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，脑衍生的神经营养因子(BDNF)，促神经激素(neurotrophin)-3(NT-3)，促神经激素-4/5，CDF/LIF，bFGF，aFGF，其他成纤维细胞生长因子的阵(array)睫状神经营养因子(CNTF)和白细胞介素。
从前文的描述应理解，在本发明方法中有用的细胞包括分泌所需生物活性分子的非转化细胞，或转化的细胞也可以完成这些。
已经克隆了编码各种生物活性分子的基因并公开了其核苷酸序列。许多那些基因都可从保藏中心如美国典型培养物收集中心(ATCC)或各种商业途径得到。编码不能公开得到的在本发明中有用的生物活性分子的基因可以用标准重组DNA方法，如PCR扩增，用来自任何公开序列的寡核苷酸探针筛选基因组和cDNA文库而得到。在本发明中可以施用编码生物活性分子的任何已知基因。参见例如美国专利5049493；Gage等人，美国专利5082670和美国专利5167762。
可以用标准技术将所需基因(即编码适宜生物活性分子的基因)插入到适宜表达载体的克隆位点。这些技术是本领域专业人员熟知的。
然后可以用含所需基因的表达载体转染在本发明方法中所用的细胞系。可以使用标准转染技术例如磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖转染，脂介导的方法或电穿孔。
本文提供控制分裂细胞生长的方法，借助所述方法可以控制增殖和分化之间的平衡以在BAO内提供分化的非分裂被囊的细胞。还提供了控制分裂和非分裂细胞生长的方法，借助所述方法控制BAO内的细胞分布和细胞数目，从而减少坏死细胞核的形成并减少细胞碎片。用遗传工程方法控制增殖和分化通过用基因遗传改变细胞，本文提供了控制细胞生长的方法和组合物，所述基因可编码影响细胞增殖或分化的产物。
根据本发明的一个方面，使用条件性不死的细胞系以在BAO中达到控制生长的目的。用编码促进增殖之产物的基因转化初级细胞。将促进增殖的基因可操作地连接到可调节启动子。可以合理地修改由Land等人描述的生产不死细胞的技术(Nature，304，pp.596-602(1983)或Cepko，Neuron，1，pp.345-53(1988))以生产条件性不死的细胞。
根据该方法，通过降低促进增殖之基因，如癌基因(如c-myc，v-mos，v-Ha-ras，SV40 T-抗原，来自腺病毒的E1-A)的表达可以抑制细胞增殖(即有丝分裂)。当BAO被植入到宿主体内时，通过向降调节、抑制驱动癌基因表达的启动子或使其失活来降低癌基因的表达。体外向上调节、激活或使可调节启动子去阻制会导致表达促进增殖的基因，由此使细胞在体外增殖。适宜的启动子是在体内可被下降调节的启动子，包括如糖皮质激素反应性启动子，如PNMT(Hummang etal.，Neutoprotocols，3，pp.276-83(1993))和干扰素(“IFN”)-反应性启动子如Ms1(Hug et al.，Mol.Cell.Biol.，8，pp.3065-79(1988)；Arnheiter etal.，Cell，52，pp.51-61(1990))，反转录病毒长末端重复启动子，四环素反应性启动子，如lac启动子和胰岛素反应性启动子。还可参见McDonnell等人WO 93/23431。应理解启动子的选择应取决于所打算植入的位点。因此，根据本发明，糖皮质激素或IFN反应性启动子对于植入到脑中是有用的。因此不能预期，这些启动子在BAO植入到脑中后，将指导癌基因以显著地水平进行表达。
在一个实施方案中，通过将癌基因与可调节启动子可操作相连而产生条件性的不死的细胞。存在结合蛋白的情况下可激活或上调所述启动子。通过将编码结合蛋白的基因与四环素反应性启动子相连，可调节结合蛋白的生产。
例如一个实施方案完成了含一构成性启动子的转化细胞，所述启动子驱动tet阻遏表达。所述细胞还含有与CMV-IE启动子可操作相连的异源基因。如果CMV-IE启动子侧翼为tet操纵子序列，则用tet阻遏物就可关闭从该启动子开始的表达。存在tet时，由于tet与tet阻遏物结合，从而使其他转录因子以CMV-IE启动子结合而发生转录。根据该实施方案，只有存在四环素时才会表达癌基因。因此存在四环素时，细胞可以在体外增殖。
在植入前数天，除去四环素可以降低转基因表达，因此相应地减少或抑制细胞在BAO中的增殖。
在使用条件性不死之细胞的具体实施方案中，用Mx1启动子达到控制生长的目的。Mx1基因编码赋予对流感病毒A和B抗性的蛋白质。Mx1基因紧紧受其启动子的调节。在不存在干扰素(“IFN”)的情况下，不表达基因，而存在IFNα和IFNβ时，所述基因是可诱导的。Arnheiter等人(Cell，52，pp.51-61(1990))报道了Mx1转基因小鼠的生产，所述小鼠在数种组织中表现出用干扰素可诱导表达转基因。SV40大T抗原能够转化来自许多组织的细胞并使其不死。
在一个实施方案中，可以将小鼠Mx1启动子与SV40早期区融合，然后用嵌合基因生产转基因小鼠。由Mx1启动子元件提供的紧密调节使得人们可以控制组织或从转基因动物中制备的细胞培养物中之癌基因的表达，由此产生条件性不死的细胞系。
存在IFNα或IFNβ时，用这种方法生产的细胞系可以象大多数其他细胞系一样，以算术方式扩增。通过在被囊之前或之后除去IFNα或IFNβ可以停止细胞分裂。在优选的实施方案中，用Weiss(PCT/CA92/00283)的方法，可以从含Mx1-SV40 T抗原构建体的转基因小鼠中制备神经干细胞(neurospheres)。然后被囊由此得到的条件性不死的神经干细胞系，并将其植入宿主体内。
另外，如果需要，根据标准方法，可以进一步基因修饰条件性不死的神经干细胞系以释放任何数量的生长因子或神经递质。在该实施方案中还使用了另一种IFN反应性启动子。这些启动子包括金属硫蛋白，H-2Kb，H-2Dd，H-2Ld，HLA-A3，HLA-DRα，HLAI型基因，202，56K，6-16，IP-10，ISG15，ISG54，和2’，5’-oligo(A)合成酶。参见Hug。等人，Mol.Cell.Biol.，8，pp.3065-79(1988)。
该实施方案特别适用于被囊在BAO中用于植入脑中的细胞。IFNα和IFNβ在脑中的循环水平足够低，以便由Mx1启动子所驱动的转录活性不足以导致细胞增殖。在建立转基因动物中，可以在数种组织中诱导T抗原的表达，但只有在胸腺中才能见到癌基因的自然表达。但是，癌基因的胸腺表达在表达SV40早期区的转基因动物中是相当常见的现象。因此，在没有显著癌基因表达的情况下，可以将细胞在体内保持在一种接近静止的状态。
另一实施方案利用了这样的观察结果即在用于体内的有关遗传工程细胞的传统反转录病毒感染技术中，使用反转录病毒启动子如长末端重复(“LTR”)启动子。参见如Gage等人美国专利5082670。由这些启动子驱动的基因表达通常在体内受到下降调节。通常认为这种下降调节是由循环中的细胞因子介导的。在细胞被被囊在BAO中并植入体内后，本发明就是利用这种一般来讲有害的反转录病毒基因的下降调节来停止或降低细胞增殖。在所述情况下，不死的基因(癌基因)由LTR驱动。在细胞在体外保持或扩增时，所述基因也会使细胞“不死”。在植入后，存在细胞因子的情况下，“不死”的癌基因被下降调节，增殖降低或停止，细胞在所述装置中静止。
根据该实施方案，可以通过用反转录病毒感染或用含癌基因(如，c-myc，v-mos，v-Ha-ras，SV40 T抗原，来自腺病毒的E1)的cDNA进行DNA转染生产条件性不死的细胞，所述癌基因与反转录病毒启动子，如LTR启动子可操纵相连。我们优选莫洛氏鼠白血病病毒(MLV)，劳氏肉瘤病毒(RSV)和小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子序列。
这些转化的细胞一般将在体外表达所述癌基因。用已建立的培养技术，在培养基中可以使成功转化的细胞生长。通过加入地塞米松或表皮生长因子可以刺激LTR-转基因表达以缩短培养转化细胞所需的时间。优选的在被囊和植入数天前，将细胞暴露于细胞因子，如γ-干扰素(IFN-γ)，TNF-α和转化生长因子-β(TGFβ)，通过抑制LTR驱动的转基因表达可以降低有丝分裂。Schinstine and Gage，Molecular andCellular approaches to the Treatment of NeurologicalDisease，71，ed.Waxman，S.G.(1993)；Seliger et al.，J.Immunol.，141，pp.2138-44(1988)；Seliger et al.，J.Virology，61，pp.2567-72(1987)；Seliger et al.，J.Virology，62，pp.619-21(1988)。
根据上述方法，任何适宜的细胞都可以是条件性不死的。通过本领域已知的筛选方法，包括本文提供的方法，本领域专业人员可以确定给定细胞类型有关条件性不死的适宜性。
本文通过转化这些细胞以包括肿瘤抑制基因，如p53基因或RB基因，从而来停止或降低增殖，而提供了控制不死细胞系或连续增殖之细胞生长的方法。一般认为肿瘤抑制基因或抗癌基因是生长抑制基因。参见如Weiberg，Neuron，11，pp.191-96(1993)。例如，野生型p53激活片段1(WAF1)可以在培养基中抑制肿瘤细胞的生长。理论上由p53蛋白质诱导的基因可以介导其作为肿瘤抑制剂的生物学作用。E1-Deiry et al.，“ WAF1，a Potential Mediator of p53 Tumor Suppression”Cell，75，pp.817-825)1993)。WAF1基因也称为CIP1基因。其他p53-介导的生长抑制基因包括GADD45和GADD153(或CHOP)。参见RonProc.Natl.Acad.sci.USA，91，pp.1985-86(1994)。本文可以使用用上述转化的异源DNA转化细胞的标准技术。
根据一个实施方案，用与可调节启动子操纵相连的肿瘤抑制基因转化不死的细胞或连续增殖的细胞。在体外培养转化细胞，由此进行扩增时，用适宜的可调节或可诱导启动子可以表达下降调节或关闭的转基因。在被囊或植入后，表达肿瘤抑制基因，从而降低或停止细胞增殖。
酪氨酸羟化酶和促红细胞生成素启动子在本发明的该方面是有用的。这些启动子通常在高O2条件下如在体外时，“下降调节”，但在低O2条件下，如在被囊在BAO中并植入宿主后，细胞所遇到的环境下，“上升调节”。
另外，可以使用适宜偶联或去阻遏启动子系统以按需调节增殖抑制基因。例如一个适宜的系统涉及使用由Hannan等人(Gene 130 pp.233-39(1993))描述的AP1启动子和lac操纵基因/PGK1启动子系统。AP1启动子与lac阻遏物基因可操纵相连。lacO(lac操纵基因)和3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子与增殖抑制基因可操纵相连。体外加入外源佛波醇酯诱导AP1启动子，可导致lac阻遏物蛋白质的表达。存在阻遏物蛋白质的情况下，阻遏了lacO-PGK1启动子构建体，而且不会表达增殖抑制基因。体内不存在佛波醇酯的情况下，不表达阻遏物蛋白质，lacO-PGK1启动子去阻遏，则表达增殖抑制基因。
根据一种方法，用编码分化诱导产物的基因转化适宜的细胞。所述分化-诱导基因与可调节启动子可操纵相连。根据该方法，在被囊并植入宿主体内后，将会表达分化-诱导基因。然而，通过适宜的下降调节，阻遏或失活可调节启动子，可以体外抑制表达。正在分裂的细胞或已经不死的初级细胞可以使用该方法。高迁移率组的染色体蛋白质14，“HGM”，是与调节细胞分化有关的基因的一个实例。如上文讨论的用于增殖抑制基因的一样，体内上升调节，但在体外可以被“关闭”或下降调节的任何适宜的启动子均可以用在该实施方案中。另外，如上文讨论的有关调节肿瘤抑制基因表达一样，可以使用任何适宜的去阻遏启动子，如上文讨论的。
生长控制的另一种方法使用反义RNA或DNA或其衍生物。反义RNA或DNA是单链核酸，与一基因的编码链或从该基因转录生产的“编码”mRNA互补。如果反义RNA与mRNA同时存在于细胞中，那么反义RNA就与mRNA杂交形成不能通过制备蛋白质的核糖体翻译的双链。翻译RNA可以经微注射或大量加入到培养基中而施用于细胞。本发明优选的方法是用真核表达载体植入靶细胞。Neckers et al.，“AntisenseTechnologyBiological Utility And Practical Considerations”Am.J.Physiol.265(Lung Cell.Mol.Physiol.，9)，pp.L1-L12(1993)。
根据该实施方案，可以将编码与增殖诱导基因或肿瘤抑制基因反义之RNA的反义基因与可诱导启动子操纵相连。在诱导启动子后，就会生产反义RNA。根据该实施方案，如果所述转化细胞含有增殖诱导基因，在体外将会停止或下降调节反义RNA的生产，但在体内上升调节后，将会停止或降低增殖。
换言之，如果转化细胞含有肿瘤抑制基因，在体外就会上升调节反义RNA生产，而在体内下降调节，从而达到所需的生长控制目的。
另外，还可以用反义技术将任何反义基因构建成编码产物之基因，所述产物是增殖或分化所必需的。适当的诱导表达反义基因可以使本领域专业人员达到控制本发明被囊细胞生长的目的。
优选的是使用可调节启动子/基因构建体，即使所述构建体成为诱导体内细胞增殖所必需的或所需的，那么也可以在体内操纵所述构建体。例如若是上文所讨论的Mx1/SV40构建体，可以局部或全身加入IFN以诱导癌基因表达。在BAO中增加体内细胞分裂可以增加细胞数目以代替BAO中死亡的细胞或增加从BAO中所需生物活性分子的输出。用化合物控制生长和分化构建本发明的另一种方法，可以将细胞暴露于抑制增殖或诱导分化的处理中。在某些方法中，处理包括提供化合物或生长因子。在其他方法中，处理包括从生长培养基中除去化合物或生长因子。可以在被囊于BAO之前或之后进行处理，优选是在被囊之前。
所用的蛋白质或化合物取决于细胞类型或所需的效果。本领域专业人员用合理技术即根据细胞对所选化合物或蛋白质的反应可以筛选所给的细胞类型。
在一种方法中，通过包含从细胞生长培养基中除去增殖诱导化合物或生长因子的处理来控制细胞分布。在一个实施方案中，可以使用生长因子如表皮生长因子(“EGF”)，转化生长因子α(“TGFα”)，双调蛋白或任何其他适宜的试剂以诱导干细胞或祖代细胞(包括来自胚胎交感神经节和不死祖代细胞)，优选神经干细胞(Weiss，PCT/CA 92/000283)的生长。这样可以保持并增加体外神经前体细胞的供应。不存在这些增殖诱导生长因子而被囊时，神经前体细胞会停止分裂和分化。
还可以通过用例如佛波醇酯处理或在固定底物(包括带离子电荷的表面如聚-L-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸等)上生长进一步诱导神经前体细胞分化。还可以通过用FGF家族的成员与至少1种由Ip等人(WO94/03199)描述的睫状神经营养因子(CNTF)或神经生长因子(NGF)家族中的成员结合处理来诱导分化。
在另一实施方案中，可以使用在基质中输出的多谱系生长因子，也称为“肥大细胞生长因子”，“干细胞因子”，“c-kit-配体”或“青灰因子”诱导造血干细胞的增殖。为了保持在体外供应正在分裂的细胞，存在肥大细胞生长因子存在的条件下培养造血干细胞。为了抑制或降低增殖，从培养基中除去肥大细胞生长因子。可以在被囊之前或之后完成该步骤，优选在被囊之前。
前体促进增殖的多谱系生长因子的实例包括白细胞介素-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。肥大细胞生长因子与前体多谱系生长因子或谱系特异性生长因子如促红细胞生成素结合还可以影响细胞生长。例如，认为在诱导高度富集的鼠造血干细胞增殖时肥大细胞生长因子与IL-3有协同作用。Galli等人，“The biology of Stem Cell Factor，a NewHematopoietic Growth Factor Involved in Stem Cell Regulation，”Int.J.Clin.Lab.Res.，23，pp.70-77(1993)。
在本发明的另一方法中，通过提供抑制细胞增殖或诱导分化的化合物或生长因子可以控制BAO中的细胞分布。根据该方法，可以使用任何适宜的增殖抑制或分化诱导化合物。
应当理解，不同类型的细胞对不同的化合物有不同的反应。本领域专业人员可以用常规方法筛选特定的化合物以确定其在影响给定细胞类型之增殖或分化中的有效性。
在一个实施方案中，可以用细胞因子，包括例如转化生长因子β1(TGFβ1)抑制细胞增殖或诱导细胞分化。例如通过暴露于TGFβ1和抗坏血酸可以降低在BHK细胞中的增殖并增强分化。相似地，可以用TGFβ1诱导成纤维细胞中的分化，而且还可作为角质化细胞和内皮细胞的生长抑制剂。Phillips等人“ Ascorbic Acid and Transforming growthFactor-β 1Increase Collagen Biosynthesis via DifferentMechanismsCoordinate Regulation of Proα(III)Collagens，”Archiyesof Biochemistry and Biophysics，295，pp.397-403(1992)。
在另一实施方案中，可以用TGFβ1，血清素或FGF控制神经内分泌细胞的生长。通过在自分泌方式中其自身的产物可以调节神经内分泌细胞的生长。TGFβ1是人胰类癌细胞(BON)的自分泌生长抑制因子，而FGF和血清素是自分泌生长调节因子。TGFβ1对BON细胞生长的抑制作用可以通过加入血清素而逆转。Townsend Jr等人，“studies ofGrowth Regulation in a Neuroendocrine Cell Line”ActaOncologica，32，pp.125-130(1993)。
根据本发明的方法，还可以使用各种其他的化学物质以抑制细胞增殖或诱导细胞分化。这些化学物质包括丝裂霉素C，5-溴-脱氧脲苷(BrdU)，前列腺素E1(PEGE1)，二丁酰cAMP，1-β-D-阿糖呋喃细胞因子(Ara-C)，烟酰胺和肝素。丝裂霉素特别适用于控制被囊的βHC细胞系的增殖。参见例如，Radvanyi等人，Mol.Cell.Biol.，13，pp.4223-27(1993)。
有时可以使用化学物质的组合。用丝裂霉素C和BrdU或PGE E1或二丁酰cAMP处理后，可以诱导人神经胚细胞瘤细胞IMR-32分化。Gash等人，“Amitotic N euroblastoma Cells Used for Neural Implants inMonkeys，”Science，233，pp.1420-22(1986)。用Ara-C系列预处理人胚胎横纹肌肉瘤细胞系还导致体外明显的生长抑制，体内致瘤性的丧失，而且甚至在除去所述化合物后还有进一步分化的表型。Crouch等人，“Ara-CTreatment Leads to Differentiation and Reverses the TransformedPhenotype in a Human Rhabdomyosarcoma Cell Line，”ExperimentalCell Research，204，pp.210-16(193)。认为烟酰胺(NIC)诱导人胎儿胰岛细胞的分化和成熟。Otonkoski等人，“Nicotinamide is a Potnet Inducerof Endocrine Differentiation in Cultured Human Fetal Pancreatic Cells，”J.Clin.Invest.，92，pp.1459-66(1993)。
还已经报道加入dbcAMP还影响正在发育组织的分化。例如认为dbcAMP调节星形细胞前体分化，诱导PC12细胞中轴突的形成，刺激施旺氏细胞增殖。Baron-Van Evercooren等人，“Schwann CellDifferentiation in vitroExtracellular Matrix Deposition and Interaction，”Dev.Neurosci.8，pp.182-96(1986)。相似地，可以通过暴露于抗坏血酸诱导施旺氏细胞的分化，出处同上。
此外，可以用涎腺糖肽(“ SGP”)分子抑制细胞增殖。例如从完整大脑皮层细胞分离的18 kDa的细胞表面涎腺糖肽抑制处于指数生长的Swiss3T3细胞的增殖。参见例如，Toole-Simms等人，Jour.Cell.Physiol.147，pp.292-97(1991)；Fattaey等人，Exp.Cell.Res.，194，pp.62-68(1991)。已经有许多转化的和未转化的细胞类型表明对某些SGP是敏感的。这些细胞包括来自宽范围的脊椎动物和无脊椎动物种的内皮样和成纤维细胞。参见例如Fattaey等人，Jour.cell.Physiol.139，pp.269-74(1989)(引入本文作为参考)。
应理解上述的某些处理对增殖和分化仅有暂时的作用。在这种情况下，植入到宿主体内后，需要连续地给被囊细胞补充化合物或生长因子。这可以通过利用生长因子或化合物的生物可侵蚀聚合物非细胞源，或通过共被囊生长因子或化合物的细胞源或任何其他适宜的装置来完成。参见美国专利5106627和5156844。通过辐射控制生长还可以通过将细胞暴露于适宜剂量的辐射如X射线，紫外线(UV)照射等来控制细胞增殖。在细胞经辐射后，其通过细胞循环的进程就会受到抑制。可以用已知方法，根据所选的细胞类型来确定临界剂量率或最小剂量率。参见例如Stanley and Lee，Radiat.Res.133，pp.163-9(1993)；Mitchell等人，Radiat.Res.79，pp.537-51(1979)。例如用5和10mJ/cm2紫外线B(UVB)照射的正常人表皮角质化细胞显示其在辐射后3-5天，增殖有显著(高达78％)的降低。Prystowsky etal.，J.Invest.Dermatol.，101，pp.54-58(1993).Yi et al.，Radiation Research，133，pp.163-69(1993)提供了计算通过暴露于x射线而使细胞增殖停止所需的最低剂量的方法。利用细胞外基质分子控制生长和分化本文提供了通过仅用控制生长的细胞外基质(“ECM”)(或其组分)或与控制生长的生理学基质或其他调节生长的物质组合来修饰生长表面，从而控制BAO中细胞分布的方法。
在活组织中，ECM是从各种有细胞分泌的蛋白质或多糖形成的，然后在靠近分泌它们的细胞附近被组装成网。ECM分子包括氨基葡糖聚糖和蛋白聚糖，如chrondroitin sulfate，纤维蛋白连接素，硫酸肝素，透明质酸酶，硫酸皮肤素，硫酸角质素，层粘连蛋白，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和弹性硬蛋白。具体地说，在体内胶原蛋白是ECM的主要组分。已知ECM分子使细胞增殖降低并能促进细胞分化。另外，在本发明方法中使用的非细胞ECM可以影响在BAO中所被囊细胞的空间位置。
可以通过培养已知沉积ECM的细胞，包括间质的或星形源的细胞得到ECM。用抗坏血酸和cAMP处理后，可以诱导施旺氏细胞合成ECM。这些ECM组分组装成支持施旺氏细胞增殖的基膜的前体形式。此外，从内皮细胞和从Engelbreth Holm-Swarm肿瘤细胞(EHS)重建的基膜凝胶天然生产的ECM支持各种上皮细胞和内皮细胞的生长和分化。Barron-VanEvercooren et al.，“Schwann Cell Differentiation in Interaction，”Dev.Neurosci.，8，pp.182-96(1986)。
在一个实施方案中，通过用ECM包被BAO中的生长表面(或其生长控制组分)来控制生长。我们优选用生产ECM的细胞在BAO中种植生长表面，然后培养细胞至融合。接着用洗涤剂和NH4OH处理细胞。再用所得的BAO(带有包被在生长表面上的非细胞ECM)被囊生产所需生物活性分子的细胞。
在另一实施方案中，用基本相同的方法体外制备ECM，冻干，制成片段，然后与细胞混合作为悬浮液。然后将细胞/ECM片段共载到BAO中。
与在常规单层培养中生长的细胞相比，存在一些ECM分子时生长的细胞，其增殖降低，分化增强。例如，存在胶原蛋白凝胶时，在体外生长的已知合成特定甾类激素例如，醛固酮的肾上腺(adrenocortical)细胞其增殖降低。Fujiyama et al.，“Influence of Extracellular Matrix on theProliferation and differentiation of Adrencocortical Cells in Culture，”Path.Res.Pract.，189，pp.12051-14(1993)。
在胶原蛋白条件下进行培养时，施旺氏细胞还可表现出增殖降低而分化增加。
还知道在用IV型胶原蛋白和HSPG结合包被的表面上生长时，内分泌细胞可在体外分化。IV型胶原蛋白是细胞粘附所必需的，而HSPG诱导分化。de Bruine et al.，“Extracellular Matrix Components InduceEndocrine Differentiation In Vitro in NCI-H716 Cells，”AmericanJournal of Pathology，142，pp.773-782(1993)。
可以将各种生长因子或化合物，包括上文讨论的那些加到ECM组分中以进一步控制细胞的生长和分化。既可以在植入前，在体外将生长因子施用于细胞，或也可以在体内施用于细胞，或两者同时施用。参见例如，美国专利5156844和5106627，这两篇文献涉及传递生长因子的方法，利用共被囊的细胞或非细胞源的生长因子。另外，根据已知技术，用控制生长的肽可以衍生ECM分子。
例如，可以将调节细胞在其自身上生长，可逆地与特定ECM分子(如核心蛋白聚糖)结合的转化生长因子β加到ECM中以促进ECM分子的生长抑制作用。
同样地，也表明肝素可以抑制非转化细胞和转化细胞系生长。Matuoka et al.，Cell Structure and Function，9，p.357(1984)。
已经报道抗碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与ECM组分一起加入时可以促进内分泌细胞的分化。参见de Bruine et al.，“ExtracellularMatrix Components Induce Endocrine Differentiation In Vitro in NCI-H716 Cells，”American Journal of Pathology，142，pp.773-782(1993)。
当生长因子与不同的ECM组分结合时，可以对细胞表现出不同的作用。例如，已经表明，成纤维细胞生长因子对在层粘连蛋白上生长的嗜铬细胞是有效的分化因子和弱分裂素。但是当将FGF加到在胶原蛋白上生长的嗜铬细胞时，FGF是弱分化因子和强分裂素。环AMP类似物8-(4-氯苯基硫代)环AMP也有这种行为。 Chu etal.，Neuroscience，95，pp.43-54(1994)。
表1是已知影响特定类型细胞之增殖和分化的ECM分子生长因子和化合物的部分表。
表1影响增殖或分化的ECM分子，生长因子和化合物细胞类型分化诱导剂/生长抑制剂 增殖促进因子施旺氏 抗坏血酸；胶原蛋白(VitrogenTM) TGF-β；dbcAMPCultisphers/琼脂糖PC12NCF；dbcAMP；SGP成纤维细胞 TGF-β-1；Cultisphers/琼脂糖； VitrogenTM抗坏血酸；SGP成肌细胞胶原蛋白；抗坏血酸神经干细胞 层粘连蛋白；EGF；bFGF；
肽2000；Cultisphers/肽2000佛波醇酯；肝素；FGF和 TGF-α；(CNTF或NGF) 双调蛋白人胚胎横纹肌 Ara-C肉瘤细胞系人胎儿胰岛细胞 烟酰胺(NIC)成星形细胞 dbcAMPSwiss 3T3SGP肾上腺 胶原蛋白内分泌IV型胶原蛋白+HSPG；bFGF+ECM组分嗜铬细胞 FGF+层粘连蛋白；FGF+胶原蛋白；8-(4-8-(4-氯苯基硫代)氯苯基硫代)环AMP+环AMP+层粘连蛋白胶原蛋白造血干细胞肥大细胞生长因子BHK TGF β-1+抗坏血酸；来自E15大鼠脑膜细胞的ECM角质化细胞TGF β-1内皮细胞 TGF β-1神经内分泌TGF β-1TGF β-1+抗坏血酸；(人胰类癌 血清素；FGF细胞(BON))成神经细胞瘤 丝裂霉素C+BrdU；细胞系IMR-32 PGE1+dbcAMP；SGPSCT-1 胶原蛋白；抗坏血酸BAO内的生长表面包括BAO的腔表面，另外还包括可被囊在BAO中的其他生长表面，如内支持物。
微载体可以提供用于细胞生长的表面。利用微载体可以使被囊的细胞数目更多，均匀地分布在BAO内，特别是对于生长接触抑制的细胞。数种类型的微载体是市售的，包括Cytodex(Sigma，St.Louis，MO)葡聚糖微载体，和CultiSpherTM(HyClone Labs，Logan，UT)大孔明胶微载体和玻璃微载体。通常用这些微载体培养锚依赖性细胞。在大孔明胶微载体上生长的细胞系包括0BHK，BHK-21，L-929，CHO-K1，rCHO，MDCK，V79，F9，HeLa和MDBK。还可以用其他ECM分子(如FACT胶原蛋白包被的微载体(Solo Hill Labs，AnH arbor，MI))或非细胞ECM(基本如上所述)制备微载体。
在优选的实施方案中，在被囊和植入前，可以将生产所需上文活性分子的细胞种植到ECM包被的微载体表面并在微载体上体外培养。Cherksey(WO 93/14790)涉及在玻璃和塑料微珠上培养细胞，然后将微珠植入到受体的脑中。
在本发明的另一实施方案中，可以将在微载体上种植的细胞于存在适宜生长抑制基质的条件下悬浮，然后被囊在BAO中。所述基质材料(如用于成纤维细胞的琼脂糖或琼脂；用于肾上腺细胞的胶原蛋白)可在生理学上进一步抑制细胞的赘疣。在例如Dionne Wo 92/19195中描述了所述水凝胶基质，该文献引入本文作为参考。
根据本发明的另一方面，通过用影响细胞附着于所述基质的肽序列衍生，可以用琼脂糖作为ECM的替代物。例如，用层粘连蛋白或纤维蛋白连接素的肽序列衍生琼脂糖水凝胶。
用该方法，将细胞悬浮在由琼脂糖组成的3-D基质中，所述琼脂糖是用识别与细胞粘附有关的细胞表面受体分子之肽序列衍生的。已经表明有数种肽序列可促进细胞粘附。参见例如，Pierschbacher etal.，science，309，pp.30-33(1984)；Graf et al.，Biochemistry，26，pp.6896-900(1987)；Smallheiser et al.，dev.Brain Res.，12，pp.136-40(1984)；Jucket etal.，J.Neurosci.Res.，28，pp.507-17(1991)。本发明衍生的琼脂糖基质允许存在适宜的分子记号，所述记号用于3-D中的细胞粘附。琼脂糖浓度优选1.25％w/v或更少，最优选约1.0％。我们优选含RGD的序列(即ArgGlyAspl； SEQ ID NO 2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg； SEQ ID NO1的AA5-AA9)，含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的AA1-AA15)等。可以用双功能偶联剂，如1’1羰基二咪唑或任何其他适宜的方法完成衍生。
用琼脂糖代替ECM的一个特别的优点是天然产生的ECM在体内时间过长时会酶促降解，而琼脂糖则不容易降解。使用琼脂糖的优点还有，因为它是一种确定的产物，不象MartrigelR，是一种从肿瘤细胞系中衍生的，是一种不确定的混合物。具体地说，已经表明MartrigelR含bFGF，对于许多细胞来说是一种强分裂素。琼脂糖是一种有多糖组成的透明的，热可逆的水凝胶。除在生理学上限制细胞赘疣外，琼脂糖本身可抑制增殖并诱导分化。参见例如Aulthouse，in“ Expression of the Human ChondrocytePhenotype In Vitro，”In vitro Cellular & Developmintalbiology，25，pp.659-668(1989)。
可以通过衍生物如PEO-PDMS(优选对细胞没有毒性作用)将琼脂糖化学改性以进一步抑制细胞赘疣。
应该理解，不同类型的细胞对给定的ECM分子或对来自特定来源的非细胞ECM有不同的反应。参见例如，End and Engel，“MultidomainProteins Of The Extracellular Matrix And Cellular Growth”，pp 79-129，in Receptors for Extracellular matrix，[Eds] McdDonald andMecham，Academic Pree，New York(1991)，该文献引入本文作为参考。本领域专业人员很容易对细胞进行筛选以确定其对ECM分子或来自特异性来源的非ECM的反应性，确定其在控制细胞分布中的有效性。通过在BAO中的生长表面修饰来控制生长本文提供了通过化学修饰生长表明以控制BAO中的细胞数目和细胞位置，从而控制BAO中细胞生长的方法。可以修饰在BAO中的生长表明可控制细胞向生长表面的粘附。BAO内的生长表面可以是BAO的腔表面或内膜，微载体或BAO内放置的内支持物。根据微载体和内支持物的的实施方案，可以在这些结构上体外培养细胞，然后将其被囊在BAO中用于植入。
可以通过许多不同的方法(包括化学修饰)修饰BAO膜以产生羧酸基团，胺基或羟基或其他反应功能团，或通过吸附对其进行修饰。可以用这些反应功能基团(不存在于聚合物骨架上)作为位点进行进一步的衍生。
在一个实施方案中，修饰BAO的腔表面以促进细胞与该表面的粘附。控制细胞向腔表面的粘附在提高细胞存活中是有用的。通过使细胞与膜优先附着，用比利用水凝胶悬浮之固定技术少的细胞就可以使细胞均匀分布在被膜内。使用的细胞越少，产生的细胞碎片量越少。另一个好处是由于细胞与膜近距离接触，因而可以提高营养物质向细胞的扩散。如果使用膜修饰，而在被膜内没有基质材料，还可以避免通过凝胶运输的并发问题和蛋白质或细胞产物与基质材料的吸附。通过用各种分子量的聚(d-赖氨酸)处理BAO的腔表面可以促进细胞附着。从pH11缓冲的溶液中，可以将聚(d-赖氨酸)吸附到BAO腔表面。我们优选约67000g/mol的聚(d-赖氨酸)。
另外，已经发现，肽衍生物，例如含RGD的序列(即ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1的AA5-AA9)， 包括CDPGYIGSR(CysAspProGlyTyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1)， 以及含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的AA11-AA15)(优选CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAlaSerIleLysValAlaValSerAlaAspArg(SEQID NO3))在促进细胞附着方面是特别有用的。例如，用已知技术，可以将这些肽中最常用的RGD (ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)化学附着到BAO膜上。有些含RGD(ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)的分子是市售的，例如，PepTite-2000TM(Telios)。
在另一实施方案中，可以修饰BAO膜以抑制通过例如PEO-PDMS或聚(d-赖氨酸)-藻酸盐吸附的细胞附着。我们优选PEO-PDMS修饰，特别是当生长表面是孔状的时。这是因为，PEO-PDMS倾向于通过孔扩散并在其通过孔时经疏水-疏水结合吸附到表面上。具体地说，低分子量(600-3000g/mol)PEO-PDMS是优选的。
当细胞在微载体上生长并被囊在BAO中时，该实施方案是特别有用的。用该方法，可以达到均匀的细胞分布，可以控制细胞数目，可以将细胞粘附限于微载体上。
另外，可以结合使用促进并抑制细胞附着的化合物。例如可以用抑制细胞附着的化合物处理BAO的腔表面，用促进细胞附着的化合物处理细胞周围的基质(如果使用的话)。
在另一实施方案中，通过在负载细胞前，在BAO内放一惰性支架可改变BAO的低劣性。所述支架提供了在被膜内粘附并均匀分布细胞的结构。在制备惰性支架中有用的化合物包括聚(羟基乙基异丁烯酸酯)(“PHEMA”)和聚(羟基乙基异丁烯酸酯-共-甲基异丁烯酸酯)(“ PHEMA/MMA”)。此外，可以用各种化学物质或蛋白质，包括上文讨论的那些衍生支架以进一步控制生长和分化。根据该方法，将适宜的支架材料的溶液在BAO中沉淀以用于所需的支架。
另一实施方案完成了在作为内支持物成分上的培养。可以用任何实质上生物相容材料，如钛或适宜的聚合物制备所述内支持物。所述支持物可以是支柱或经过设计用来作为支架以给细胞生长提供大量的表面积。所述支架材料的一个实例是非编织的聚酯纤维(NWPF) (ReemayTennessee)。有许多种NWPF，单编织的密度和每片的厚度不同。所述技术使得可以精确地控制BAO中的细胞数目，以及在插入到BAO中之前，鉴定细胞/支架的能力。此外，在将所述材料插入到所述装置中前，可以使在所述材料上培养(在装置外)的细胞分化。可以修饰所述支架，例如用细胞粘附肽，以诱导细胞分化。另外，所述材料增加了BAO的强度。在待审批申请SN 08/105,728中描述了含内支持物之BAO的编织。
在本发明中有用的BAO通常至少含有一个包围含细胞核的可半渗透的外表面膜或外套。所述外套可以使营养物质，生物学活性分子以及其他所选的产物扩散到BAO。BAO是生物可相容的，而且优选免疫隔离的。所述核含分离的细胞，可以悬浮在液体培养基中或固定在水凝胶基质中。
应该理解，前述控制BAO内细胞分布的方法和组合物不是唯一的。可以结合使用数种方法和组合物以达到所需的控制生长的目的。
例如，根据本发明方法，可以生产已经遗传方法修饰的细胞以使其包含控制生长的基因，所述细胞在ECM微载体上生长，然后被囊在BAO中的细胞/微载体簇中，已经修饰了所述BAO中的一个或多个生长表面以控制细胞分布。
BAO的被囊膜可以是用与核相同的材料制成，或可以用不同的材料制成。在另一中情况下，将形成选择性渗透的且生物相容性的BAO周围或外周膜区。如果需要，还可以构建免疫隔离的膜。
根据数种因素选择用于构建BAO的材料，，而且在Dionne WO92/19195中有描述。简而言之，可以用各种聚合物或聚合物混合物制造被膜外套。形成BAO和其中生长表面的聚合物膜可包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)，聚乙烯，聚氯乙烯共聚物，聚氨基甲酸乙酯，聚苯乙烯，聚酰胺，乙酸纤维素，硝酸纤维素，聚砜，聚磷嗪(polyphosphazenes)，聚丙烯腈，聚(丙烯腈/共氯乙烯)以及其衍生物，共聚物和混合物。
可以用本领域已知的任何适宜的方法生产BAO。如在Dionne WO92/19195和美国专利5158881和5284761(引入本文作为参考)中描述的，一种所述方法涉及共挤压聚合物浇铸溶液和混凝剂，这可包含生物组织，器官，或细胞悬浮液和/或其他治疗剂。
所述外套可以是单层(1，2型)或双层(4型)。可以通过在复合挤压时，只淬火一种聚合物溶液的表面，可生产单层空心丝。可通过淬火两种聚合物溶液的表面，可生产双层空心丝。通常与4型空心丝相比，1型空心丝的外表面有更大比例的大孔。2型空心丝介于中间。
各种被膜构型，如圆柱体的，圆盘形或球形都是可能的。
BAO外套的孔径大小将决定选择性渗透膜的正常分子量截断(nMWCO)。大于nMWCO的分子不能通过所述膜。正常分子量截断的定义是在对流条件下有90％的被排除。在需要BAO是免疫隔离的情况下，要选择膜孔径大小以使由细胞生产的特定因子扩散出载体，但阻止宿主免疫反应因子进入BAO中。通常nMWCO的范围在50到200kD之间，优选90到150之间。最适宜的膜组合物还能使在所选植入位点的宿主免疫效应物分子与BAO外膜组分之间的反应性最小。
构建BAO的核，以给隔离在其中的特定细胞提供适宜的局部环境。所述核可包含足以保持细胞生长的液体培养基。液体核特别适用于保持像PC12细胞这样的转化细胞系。另外，所述还可含有凝胶基质。凝胶基质可以由水凝胶(藻酸盐，“VitrogenTM”，等)或细胞外基质组分组成。参见如Dionne WO 92/19195。
形成水凝胶的组合物分三类。第一类带净的负电荷(如藻酸盐)。第二类带净正电荷(如胶原蛋白和层粘连蛋白)。市售细胞外基质组分包括MatrigelTM和VitrogenTM。第三类是带净中性电荷(如高度交联的聚环氧乙烷或聚乙烯醇)。
可以使用任何适宜密封BAO的方法，包括适宜聚合物胶合剂和/或卷曲，打结和热密封。这些密封技术是本领域熟知的。另外，可以使用适宜的“干”密封方法。用这种方法得到一基本上无孔的套筒，含细胞的溶液可以通过该套筒导入。填充后，密封BAO。在待审批美国申请系列No.08/082407(引入本文作为参考)中描述了所述方法。
优选使用一种或多种体外检测方法在植入体内前确定BAO的功能度。本领域熟知的检测方法或诊断试验可用于该目的。参见，例如MethodsIn Enzymology，abelson[Ed]，Academic Press，1993。例如对分泌产物可用ELISA(酶联免疫吸附剂试验)，层析或酶检测，或特异性的生物试验。如果需要，在从受体收集适宜样品(如血清)并检测它们可以监测植入体的分泌功能。如果受体是灵长类，可以使用微透析。
BAO的数目和BAO的大小应足以在植入后产生治疗作用，这可通过特定应用所需的生物活性量来确定。在分泌细胞释放治疗物质的情况下，用本领域熟知的标准剂量考虑和标准确定所需分泌物质的量。在Dionne，WO 92/19195中讨论了需要考虑的因素。
在无菌条件下植入BAO。通常，将BAO植入宿主内的位点，这可以将分泌的产物或功能适宜地传递给宿主并将营养物质传递给被囊细胞或组织，而且还可以出入BAO进行补充和/或替代。优选的宿主是灵长类，最佳为人。
设想了许多不同的植入位点。这些植入位点包括中枢神经系统，包括脑，脊索，眼的房水和玻璃体。脑中的优选位点包括纹状体，大脑皮层，丘脑底部核和迈内特核基底。其他优选位点是脑脊髓液，最佳为蛛网膜下隙和侧心室。肾囊下位点和腹膜内和皮下位点或任何其他有治疗益处的位点。
为了更好地说明本发明，列举了下列实施例。这些实施例只是说明目的的，不以任何方式对本发明范围构成任何限制。实施例实施例1-用Mx1启动子控制生长将小鼠Mx1启动子与SV40早期区融合，用嵌合挤压产生转基因小鼠。由于在INFα或INFβ存在下可诱导Mx1启动子元件，所以可以控制在从转基因动物制备的组织或细胞培养物中的癌基因表达。因此，产生条件性不死的细胞系。生产转基因小鼠我们所用的Mx1-Tag构建体由与完整SV40早期区cDNA融合的约2kb的Mx1启动子(即Xba1-EcoR1片段)组成，它编码大T和小T抗原并与小鼠β球蛋白3’非翻译区和poly-A信号的上游(BamH1-Xba1片段)融合。包含β球蛋白序列是为了提供剪接位点，同时提高cDNA在转基因动物中的表达。图1列出了Mx-1构建体的质粒图谱。
通过将原核微注射到单细胞受精的小鼠卵细胞中的标准技术来生产含Mx1-Tag构建体的转基因小鼠(brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，pp.4438-4442(1985))。来自建立者动物之组织的Southern印迹分析证实在基因组中整合了完整拷贝的转基因。
用识别SV40早期区序列的PCR扩增产物确定来自这些小鼠的后代是“DNA阳性”。条件性不死的干细胞从E15转基因小鼠胚胎中除去纹状体，将DNA阴性littermates放在于含EGF神经球(neuroshperes)培养基(每100mlDDH2O 50ml，10XDMEM/F12 10ml，30％葡萄糖2.0ml，NaHCO31.5ml，1M HEPES 0.5ml，L谷氨酰胺1.0，10X激素混合物10ml，DDH2O 25ml(以洗涤过滤))的初级(个体)细胞培养物中。按照Weiss，PCT CA92/00283和Reynolds and Weiss，J.Neuroscience 12，pp.4565-74(1992)的方法制备神经球。每周将细胞传代7次，然后分成2组有和没有外源干扰素(IFN)。以500,000细胞/5ml的密度将细胞放在含EGF神经球培养基的T25烧瓶中。将1000单位/mlIFN加到1/2的细胞中。对照神经球不加IFN。将细胞在37℃，5％CO2中保温并每周传代。
传代30次后(有IFN23次)，以15ml 1.25百万个细胞的密度，将细胞放在有1000单位IFN的含血清培养基(DMEM，5％胎牛血清，和1X L-谷氨酰胺)中。每隔一天加入新鲜IFN。
7天后，除去培养基，用Hanks’平衡的盐溶液(HBSS)洗涤细胞，用胰蛋白酶稍微作用一下烧瓶。将细胞重悬在10ml含血清的培养基中，以1000 RPM离心2分钟，吸出培养基。然后用火抛光的吸管通过研磨将细胞重悬在2ml的血清培养基中。
将约25000个细胞放在含5％FBS DMEM的聚鸟氨酸处理的盖片上。每隔一天将IFN加到半部盖片上(1000单位/ml)。根据下列方法，以不同的间隔将细胞进行SV40 T抗原(Tag)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(一种在星形细胞中特异性表达的中间产物丝蛋白)染色。
在室温，将盖玻片在0.1M磷酸盐缓冲盐(PBS)的4％对甲醛中浸20分钟，然后用PBS5分钟洗涤两次。用100％EtOH，将细胞渗透2分钟，然后用0.1 MPBS费时5分钟再洗涤两次。用在0.1MPBS中稀释的5％NGS(正常山羊血清)在室温将细胞至少阻断30分钟。收集一级抗体，用1％NGS稀释2小时，然后在室温将下述用于盖片将抗-Tag(小鼠单克隆)以1∶10稀释，抗-GFAP(兔多克隆)以1∶500稀释。除去一级抗体，然后用PBS将盖玻片费时5分钟洗涤两次。
收集二级抗体，用1％NGS稀释，然后按如下，在室温黑暗中用于盖片30分钟GAM-FITC(1∶128)；GAR-Texas Red(1∶100稀释的)。除去二级抗体，在黑暗中将盖玻片费时5分钟洗涤两次。
用CitiflourTM(或其他抗啮齿动物封固培养基)将盖玻片封固在斜面上并于4℃贮存直到用备有若丹明和荧光素镜片的荧光显微镜观察。
在这组试验中，我们着手确定从除去干扰素后，T-抗原水平的下降有多快。另外，我们要确定T-抗原水平对细胞增殖和分化的影响。通过监测GFAP水平评价分化。GFAP是在成熟星形细胞中特异性表达的中间产物丝状蛋白。观察到下列免疫荧光结果。天IFN(1000单位/ml)对照(无IFN)Tag GFAP TagGFAP1 +++ - +++-4 +++ - + +/-7 +++ - +/-+/-10+++ - - +因此，正如由Tag和GFAP免疫染色所表明的，在血清培养基中经过一段时间后，IFN处理的细胞连续表达T-抗原，连续增殖，而且无GFAP表达的迹象，而对照(无IFM)开始分化(上调GFAP表达)并停止分裂。这可以通过肉眼观察盖玻片来证实--在4天末，细胞数目有明显的不同。在10天末，IFN处理的细胞比对照要多很多。
在该构建体中SV40T抗原的表达以剂量依赖方式受到调节。在我们已生产的细胞系中，在500-1000单位/ml的IFN剂量观察到最大的T-抗原表达(由免疫荧光测量的)。在100单位/ml，我们观察到最小到没有表达。正如所期望的，增殖率与IFN剂量相关；在IFN为100单位/ml时，几乎没有或没有细胞分裂。
在用上述Mx1 Tag EGF-反应性中性干细胞进行的进一步研究中，我们还表明可以控制增殖和分化。通过除去EGF，而加入IFN而迫使这些干细胞种群分化。随着1000单位/ml α/β IFN的加入，平的，星形细胞样细胞簇开始增殖，而且最终填满培养皿。我们已将这些细胞在IFN中连续保持70代以上，在这一时期，有24-36小时保持了双倍的速率。当用一组中性和胶质特异性抗体检测时，这些IFN处理的细胞实际上都是nestin-和T-抗原阳性，但对谷氨酰胺合成酶有弱反应性，而且是GFAP阴性。
在除去IFN后，这些平细胞的分裂速率迅速降低，失去了T-抗原免疫反应性，而谷氨酰胺合成酶和GFAP免疫反应性逐渐提高。这些细胞在体外存活数月，在持续缺乏IFN的情况下，没有增殖迹象。令人惊奇的是，加入IFN可以重新诱导T-抗原免疫反应性和细胞增殖。这提供了以受控制的方式有增殖或分化能力的细胞系。实施例2将实施例1中制备的细胞被囊并植入人宿主中。制备PAN/PVC纤维用干喷射-湿拔丝技术(Cabasso，Hollow Fiber Membranes，vol.12，Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，Wiley，NewYork，3 rd Ed.，pp.492-517，1980；Dionne，WO 92/19195；美国专利No.5,158,881)制备选择性渗透的空纤维。从12.5％聚丙烯腈聚乙烯氯化物(PAN/PVC)共聚物二甲亚砜(w/w)溶液中铸造不对称的空纤维。生产单层或双层纤维。将这些纤维收集到非溶剂的水浴中，甘油处理，然后干燥。将细胞以25000细胞/μl的密度负载到PAN/PVC单层空纤维中，通过热捏紧密封。植入到宿主中将被囊的细胞植入到人宿主中。植入位点包括侧心室和脑纹状体。将BAO植入到脑中的方法在Aebischer等人的WO 93/00127(引入本文作为参考)中有描述。实施例 3-新生星形细胞的条件性不死将含小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)之启动子元件的片段与SV40早期区cDNA融合。通过电穿孔转染E15大鼠脑衍生的新生星形细胞，通过试验筛选转化体进行增殖。取出正在分裂的细胞，增殖，然后用抗大T抗体检测大T-抗原的表达。将转化的细胞被囊在BAO中，然后基本上按实施例2所述植入宿主。将BAO在体内保持一个月。取出BAO，将在BAO中的细胞分布与同时保持在体外的BAO进行比较。实施例4-胶原蛋白降低的SCT-1细胞增殖和由抗坏血酸诱导的SCT-1细胞分化从pO-SV40转基因小鼠(Messing et al.，J.Neuroscience，14，pp.3533-39(1994))的坐骨神经肿瘤中克隆SCT-1细胞。这些SCT-1细胞对施旺氏细胞标记S100和Po以及SV40 T-抗原有免疫反应性。
在下列三种条件下使SCT-1细胞生长 (1)在不含抗坏血酸的组织培养塑料上，(2)在存在50μg/ml抗坏血酸的组织培养塑料上以诱导分化，和(3)悬浮在I型胶原蛋白中。
在没有抗坏血酸的塑料基层上，大多数细胞呈成纤维细胞样形态。但是，存在一些两极细胞。细胞在18-20小时内加倍，但细胞不存在接触抑制。
存在抗坏血酸时生长的SCT-1细胞生长更慢，对荧光素和IV型胶原蛋白染色更强。另一方面，层粘连蛋白免疫反应性与对照和抗坏血酸诱导的分化培养物相似。在I型胶原蛋白中悬浮的SCT-1细胞呈两极形态，而且有丝分裂活性显著降低(即加倍的时间≥30天)。实施例 5-用抗坏血酸和TGF-β抑制BHK细胞增殖使分泌CNTF的BHK细胞在DMEM(高葡萄糖)培养基中生长。用TGF-β(2.5ng/ml)和抗坏血酸(100μM)处理亚汇合的BHK培养物后，降低了有丝分裂。另外，细胞似乎延长了，有些细胞排成一列。这样的数据表明TGF-β和抗坏血酸抑制BHK细胞的增殖并诱导其分化。
在进一步的试验中，在被囊到BAO并植入前，用2.5ng/ml TGFβ和100μM抗坏血酸处理分泌hNGF的BHK细胞。用未处理的细胞作对照。具体变量包括a)TGFβ/抗坏血酸，没有VituogenTM，b)TGFβ/抗坏血酸，VituogenTM，c)无TGFβ/抗坏血酸，有VituogenTM，d)无TGFβ/抗坏血酸，没有VituogenTM。另外使用数种不同的聚合物。将被膜植入到成年大鼠的纹状体中。在3mos后杀死大鼠。实施例 6-存在EGF时神经干细胞增殖和在其不存在时的分化用Weiss等人(PCT/Ca 92/00283)方法制备神经球。收集并分裂传代68代的神经球。将一半的神经球研磨成单细胞悬浮液，将另一半保留为簇。对单细胞悬浮液进行单细胞计数，然后推测成簇的细胞有相同的浓度。将单细胞和簇分别悬浮在等量的VituogenTM和含20ng/ml EGF为对照的神经球培养基或PC-1培养基中。
将细胞以25000细胞/μl的密度负载到单层空纤维PAN/PVC BAO(基本上按实施例2中所述制备的)中，然后套密封。将BAO保持在神经球+EGF培养基或PC-1培养基(不含EGF)中。
3天和7天后放弃BAO，通过免疫细胞化学进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色。GFAP反应性表明神经干细胞已分化成星形细胞。观察到下列结果时间(天) GFAP反应性单细胞无EGF 3 小％+GFAP单细胞，EGF 3 阴性细胞簇，无EGF 3 小％+GFAP细胞簇，EGF 3 阴性单细胞，无EGF 7 强+GFAP单细胞，EGF 7 阴性细胞簇，无EGF 7 强+GFAP细胞簇，EGF 7 阴性在第7天，EGF不存在的情况下被囊神经干细胞分化成星形细胞。实施例 7-ECM对BHK细胞的作用制备无细胞ECM将从15天龄大鼠胚胎得到的E15大鼠脑膜细胞置于多孔皿中并使其融合。2星期后收集单层细胞并使其接着生长。
无细胞ECM如下提取先用0.1％三硝基甲苯X-100洗涤剂处理30分钟，然后用5mM NH4OH处理3分钟。BHK-hNGF细胞按下述生产分泌NGF的BHK细胞系。将含约37bp的第一内含子的3’末端，认为是前原NGF蛋白质和完整编码序列的翻译起始位点的双链ATG序列以及人NGF基因(Hoyle et al.，Neuron，10 pp.1019-34(1993))的完整3’非翻译区亚克隆到DHFR-为基础的pNUT表达载体中，该载体紧位于小鼠金属硫蛋白-1启动子(-650到+7)和大鼠胰岛素II基因(Baetge et al.，Proc.Natl.Cacd.Sci.，83，pp.5454-58(1986))第一内含子的下游。
用磷酸钙方法，用pNUT-βNGF构建体转染幼仓鼠肾(BHK)细胞。使BHK细胞在含10％胎牛血清，1x青霉素/链霉素/氨苄青霉素B(0.8g/l)的DMEM中生长。用含200μM氨甲蝶呤(Sigma)的培养基将转染的BHK细胞选择3-4星期，用或不用200μM氨甲蝶呤将抗性细胞保持为多克隆种群。
以1.0×104细胞/孔的密度，将转化的BHK-hNGF细胞铺在含从脑膜细胞提取之ECM的平板中。以相同的密度将BHK-hNGF细胞铺在不含ECM的对照平板上。在分裂(DIV)6次后，用血细胞计数器计数细胞。
对照孔的平均细胞计数为4.5×106+/-4.5×105细胞。提取的ECM平板的细胞计数平均为9.9×105+/-4.9×105细胞。这些结果表明，在处理的平板上，细胞生长降低了4.5倍。实施例8-细胞粘附到在内支持物上的无细胞ECM上在进一步的试验中，将初级脑膜细胞种到TECOTM聚氨基甲酸乙酯纤维上。所述纤维在BAO中用作内支持物。用以10％FBS补充的DMEM为培养基。2星期后，用0.1％三硝基甲苯x-100将所述纤维提取30分钟，然后用25mM NH4OH提取3分钟。用抗荧光素抗体将部分纤维免疫染色以确定在纤维上是否存在无细胞ECM。在使用BHK细胞的细胞粘附试验中使用其他纤维。实施例 9-BHK细胞在被囊在用PEO-PDMS改性的BAO中的微载体上的生长制备PEO-PDMS衍生的BAO按实施例2所述制备单层PAN/PVC空纤维BAO。这些BAO的ID为642.6±36.7μM，OD为787.8±32.2μM，壁厚为67.8±16.2μM，BSA排斥系数为100％，液压渗透性为约21.8ml/分/m2/mmHg。
在无菌条件下，用PEO-PEMS衍生PAN/PVC BAO。通过用去离子水将1ml或5mlEPO-PDMS稀释到100ml来制备1％或5％(v/v)PEO-PDMS溶液(Huls，PS073，MW＝3126g/摩尔；82重量％PEO。在注射到“湿”PAN/PVC膜之前，将溶液无菌过滤(0.2μm)。将所述膜热挤压，然后浸在水溶液中。72小时后以及在用细胞使用前，用Hanks’缓冲的盐溶液漂洗纤维。
将在实施例7中所述的分泌NGF的BHK细胞负载到下述PEO-PDMS衍生的纤维上。负载和密封方法用PBS(不含钙和镁)漂洗生长到90％汇合的，生产NGF之BHK细胞的单细胞悬浮液，胰酶消化约1分钟，以1000rpm离心3分钟沉淀。将细胞重悬在培养基中达到2×107细胞/ml的终细胞浓度。
将细胞直接负载到EPO-PDMS衍生的纤维上，或与0.15％Vitrogen基质溶液或0.5％琼脂糖溶液混合，然后负载。用24号斜角导管针和Hamilton注射器将约2.5ul细胞或细胞/基质浆(10000细胞/ul)负载到各纤维中。
通过将1-1.1cm长的干空纤维封固到套上来密封被膜，所述套在远端有一中隔的固定物，其中有一使细胞注射到所述装置腔中的负载通道。在流注2.5ul细胞悬浮液后，将所述隔膜裂掉，然后有轻微卷曲的丙烯酸酯(LuxtrakTMLCM 24，ICI Resins US，wilmington，MA)密封通道(“套”密封)。随后在丙烯酸套外放一1.5cm 0.200”硅橡胶管来将被膜“栓住”。
用该方法制备下列BAO1 对照非衍生的套，无基质；2 对照非衍生的套，Vitrogen基质；3 对照非衍生的套，琼脂糖基质；4 1％PEO-PDMS衍生的套，无基质；5 1％PEO-PDMS衍生的套，Vitrogen基质；6 1％PEO-PDMS衍生的套，琼脂糖基质；7 5％PEO-PDMS衍生的套，无基质；8 5％PEO-PDMS衍生的套，Vitrogen基质；9 5％PEO-PDMS衍生的套，琼脂糖基质；在被囊后，将BAO在O2保持4天，然后在研究期保持在低O2水平(50mmHg)。图2表示在4，11和25天后NGF的分泌(用ELISA测量的)。
NGF释放数据表明，如果只有基质，则对细胞的输出没什么影响。然而，存在PEO-PDMS时，当与琼脂糖而不是基质一起使用时，NGF的释放基本上较低，但与VitrogenTM一起使用时不受影响。另外，在改变时，PEO-PEMS的百分比显然对NGF的释放没什么影响。从组织学数据看，用琼脂糖被囊的BHK细胞有延长的形态，而且沿装置壁排列；但是，在琼脂糖本身中，几乎没有细胞是活的。在PEO-PDMS改性的纤维中，用琼脂糖负载的BHK细胞还沿被膜的内腔表面排列，但为圆形。在PEO-PDMS-PAN/PVC改性的纤维中的细胞比在含琼脂糖的未改性纤维中的少，这表明细胞生长受到控制。在VitrogenTM负载的装置中，细胞不受纤维改性的影响，没有基质时，被囊的细胞也不受影响。
在含VitrogenTM基质的未改性纤维中，BHK细胞分布均匀，存活率为约75％。在装置中央有一些细胞坏死。PEO-PDMS改性不会影响细胞分布，存活率或形态。用琼脂糖作为基质，细胞分布非常好，存活率接近90％。当使用琼脂糖基质时，BHK细胞的细胞形态受膜的PEO-PDMS衍生作用的影响(1％和5％)。在未改性的P(AN/VC)中，细胞延长，而在改性的P(AN/VC)中，细胞更圆。细胞不在琼脂糖基质中，而在纤维和琼脂糖“棒”之间的空间。没有基质时，细胞分布不太令人满意，细胞形成了大簇，而且存活率较低(约)60％。实施例10-BHK细胞在CultiSphersTM上的生长使实施例7中所述的分泌NGF的BHK细胞在胶原蛋白包被的CultiSphersTM上生长。用50ml PBS (CMF)将CultiSphersTM(1g)再水合。将15×106细胞悬浮在1ml再水合的CultiSphersTM中。将细胞/CultiSphersTM悬浮液直接负载到单层PAN/PVC空纤维中，或以1∶1的比例与1％琼脂糖混合，然后负载到单层PAN/PVC空纤维中。基本上按实施例2中所述制备所述纤维，然后基本上按实施例9中所述负载和密封。
在2，15和56天，用ELISA检测被囊细胞NGF分泌的情况。培养基每星期补充3次。图3表示了结果。NGF释放数据表明，当被囊在BAO中时，BHK细胞可以在CultiSphersTM微载体上生长(图3，图注n-mat-008，0709-n-m)。此外，NGF释放数据表明可以将BHK细胞/CultiSphersTM悬浮在琼脂糖基质中，对NGF分泌几乎没有或没有影响(图3，图注琼脂糖-008，琼脂糖-0709)。实施例11-用肽衍生物控制细胞数目和细胞分布在本实施例中，用PEO-PDMS，聚(d-赖氨酸)或PepTite 2000TM(一种市售的细胞粘附蛋白质)修饰BAO的腔表面。
在该研究中，使用幼仓鼠肾(BHK)细胞，因为它们是锚依赖性细胞，而且以前已经表明粘附于空纤维膜。纤维基本上按实施例2所述制备单层PAN/PVC BAP。纤维的大小为625μM ID，50μM壁厚。通过将这些纤维浸在70％乙醇中过夜而进行消毒，然后重复用HBSS漂洗。衍生作用1 PDMS-PEO如下用PDMS-PEO衍生BAO。用去离子水，通过将1ml PEO-PDMS稀释到100ml来制备1％PEO-PDMS(从Huls购买，PSO73，MW＝3126g/摩尔；82重％PEO)溶液。在注射到无菌膜之前，将溶液过滤(0.2μm)灭菌。在1％PEO-PDMS水溶液中，于室温将所述膜浸24小时。在注射细胞前，用水(3次)和HBSS漂洗纤维。
2PdL如下用聚(d-赖氨酸)衍生BAO。在2mg/ml的分子量为67000的聚(d-赖氨酸)的水溶液中，于室温将纤维浸24小时。在注射细胞前，用水将纤维漂洗3次，然后用HBSS洗3次。
3 PepTide 2000TM如下用PepTide 2000TM衍生BAO。在预先溶解在乙醇中的100mg/ml PepTide 2000TMPBS溶液中浸纤维。在室温将所述纤维浸24小时，然后在注射细胞前，用PBS漂洗3次。
4 PAN/PVC在注射细胞前，在室温用HBSS将对照纤维浸24小时。细胞将BHK细胞以5000细胞/ul的浓度负载到衍生的纤维中。密封纤维，然后将其放在含无血清培养基(PC1培养基)的螺旋帽试管中，在37℃的保温箱中，在一旋转盘上放2星期。所述盘的速度为2rpm。在适宜的时间，用4％对甲醛固定纤维，用梯度乙醇脱水，用苏木精和曙红(H&E)染色，用四氧化锇进行细胞分布的组织学分析。
正如用四氧化锇染色确定的，当用聚(d-赖氨酸)衍生时，PAN/PVC衍生的膜有良好的细胞分布，当用PepTide 2000时，细胞分布更均匀。
对于PAN/PVC膜，用两种方法进行PepTide 2000TM改性。第一种，只改性膜的内腔表面，第二种，处理内腔表面和外表面。分析空BAO(即无细胞)的总氨基酸以确定聚(d-赖氨酸)和PepTide 2000TM的结合。与对照未改性膜结合的总氨基酸为约0.2ug/BAO。对于改性的内腔表面膜，与聚(d-赖氨酸)-改性的膜结合的总氨基酸为约0.8ug/BAO，而对于内腔表面和外表面均改性的膜来说，为约2.6ug/BAO。将用BHK细胞负载的相似BAO保持14天，然后进行组织学检测。在对照未改性BAO中，细胞在纤维全长上，以大簇不均匀地分布。相反，在两种改性的纤维中，细胞沿膜的腔表面均匀分布。
这些结果表明，聚(d-赖氨酸)和PepTide 2000TM在促进细胞附着于BAO腔表面方面是有效的，因此，对于控制BAO内的细胞分布是有效的。实施例12-用ECM负载控制神经球的生长基本上按实施例1制备71代神经球。用0.5％琼脂糖(Sea-PrepTM)预包被多孔平皿以使神经球不附着在塑料平皿上。将细胞以约50000个细胞/孔的密度铺在设计用来试验的基质中。每种基质条件用三个孔；其中两个孔含PC-1培养基(对照)，一个含神经球+EGF培养基(EGF)。
评价只有皮衍生的I型胶原蛋白(ZydastTM；(CollagenBiomedical，Palo Alto))，腱衍生的I型胶原蛋白(OrganogenesisTM)，I型胶原蛋白(VitrogenTM，Celtrix，Santa Clara)和琼脂糖，或与层粘连蛋白或PepTide 2000TM结合，或同时结合两者在控制细胞生长方面的有效性。
在4和14天，用荧光素二乙酸盐/propidium碘化物(FDA/PI)染色检测细胞，评价细胞的活力，生长和分化。暴露于OrganogenesisTM胶原蛋白，PepTide 2000TM和层粘连蛋白组合的细胞表明，分化量最高，约90％的细胞进行了分化。约80％暴露于琼脂糖，PepTide 2000TM和层粘连蛋白组合的细胞进行了分化。实施例13-用惰性支架控制BHK细胞在BAO中的数目和细胞分布使用两种类型的PAN/PVC纤维(基本上按实施例2所述)有选择性渗透膜的单层纤维在外表面，有选择性膜的单层纤维在内表面。
首先，将PAN/PVC纤维去甘油处理，通过浸在70％无菌过滤乙醇中过夜而将其消毒。然后用无菌水在约1-2小时内将纤维漂洗三次。
其次，通过将1.5gPHEMA溶解在10ml 95％乙醇(190proof，Quantum)中制备浓度为15％的聚(羟乙基异丁烯酸酯)(“PHEMA”)支架基质。另外，通过将1.0gPHEMA溶解在10ml 95％乙醇中制备浓度为10％的聚(羟乙基异丁烯酸酯-共-甲基异丁烯酸酯)(“ PHEMA/MMA”)支架基质。为了更容易溶解聚合物，搅拌并加热溶液。
用针管将PHEMA或PHEMA/MMA溶液负载到PAN/PVC纤维中，然后将其浸入无菌水中。将负载的纤维在水中放1小时以上以确保支架沉淀和乙醇从核中扩散出来。切掉纤维的末端，因为它们经常塞满了PHEMA或PHEMA/MMA。将所述纤维转移到含无菌HBSS的平皿中。用这种方法制备用PHEMA，PHEMA/MMA负载的BAO和对照BAO。
使分泌NGF的BHK细胞(实施例7中所述的)在含谷氨酰胺的10％DMEM中生长，然后加入抗生素。用0.25％胰酶将细胞缓慢拖出烧瓶，洗涤，以1×107细胞/ml的密度重悬在PC1培养基中。
用22号Teflon导管，以10000细胞/ul的密度将BHK-NGF细胞负载到纤维中。热挤压密封BAO。
每中类型各制备5个BAO。四个放在含1ml PC-1培养基的24孔平板中。第五个放在垂直试管的约3-4ml PC-1培养基中。24小时后，将放在垂直试管中的BAO沿腔(纵向交叉切)切开，24小时后，通过荧光素二乙酸酯/propidium碘化物(FDA/PI)染色分析纤维内的细胞分布。在荧光显微镜下观察时，FDA染色的活细胞是绿的，PI染色的非活细胞是红的。
将剩余的BAO再培养2星期。被囊后，将BAO在O2中保持4天，然后在研究期间保持在低O2水平(50mmHg)。
在4，7和14天后测量NGF分泌(用ELISA)来检测BHK-NGF细胞的功能性。在研究期间，含BAO含PHEMA或PHEMA/MMA支架的BAO继续分泌NGF。组织学和NGF释放数据均表明PHEMA和PHEMA-MMA支架可以保持沿BAO分布的有功能活性的活细胞。用10％PHEMA-MMA支架试验的结果最好。实施例14-用惰性支架控制BAO中PC12A细胞的数目和细胞分布评价PHEMA和PHEMA/MMA惰性支架在控制BAO中PC12分布方面的效力。
基本上按实施例2所述制备单层纤维。这些纤维通常有下列特征ID642μm，OD为787μm，壁厚68μm，排斥系数100％(BSA)，水合渗透性22ml//m2/mmHg。
基本上按实施例13所述用这些纤维制备惰性PHEMA和PHEMA/MMA支架。
将在HL-1培养基中的PC12A细胞(1×107细胞/ml)注射到纤维腔中，将纤维加热密封以得到约1cm长的BAO。在37℃常压，将所述装置放在HL-1培养基中。为了评价被囊细胞的功能性，检测在1，14和28天BAO释放的基础的和K+-引发的儿茶酚胺。在图4A和5A(基础释放)和图4B和5B(K+-引发释放)中列出了结果。这些结果表明，正如有儿茶酚胺释放所测量的，被囊在含有惰性PHEMA和PHEMA/MMA支架之BAO中的PC12细胞保持了其功能性。
在5小时和4天后，通过垂直切割一半的纤维，然后用FDA/PI染色来评价在BAO中的细胞分布。这些结果表明PHEMA和PHEMA/MMA支架是无毒的，而且支持PC12细胞的细胞存活和功能性。实施例15-用NWPF促进BAO中的细胞粘附和分化试验六种NWPF(Reemay，Tennessee)#2470，#2295，#2024，#2055，#2033，#2250(Reemay #s)。接受的织物是平片形式将圆片打孔以嵌在24孔平板中。将NWPF圆片在1％十二烷基磺酸钠(SDS)，w/v中浸6小时，然后用水漂洗(3次)。接着将圆片在1％硫酸(v/vH2O中)浸13小时(过夜)，然后用水漂洗3次。将圆片在纸巾上干燥，然后高温高压消毒。
用3种类型的细胞培养圆片以检测细胞粘附BHK，AT-3和TSA细胞。将约100000个细胞加到在PC1培养基中含上述6种之一之NWPF的24孔平板中。用无血清培养基检测细胞粘附，没有血清的干扰(除TSA细胞外)。4天后，用PDA/PI检测BHK和AT-3细胞的粘附。细胞有延长的形态，而且粘附在Reemay#2250和#2055上。在10天，BHK在#2250上生长最好。AT-3细胞与2020和2295粘附最好。在10天时，AT-3细胞在2024上生长最好。当在#2250，#2055上生长时，1天后，TSA细胞(在10％FCS中)有延长的形态，而在#2024上生长最好。在7天时，TSA细胞在#2055上生长最好。买施例16-在悬浮于基质材料中的微载体上的SV40/DβH-NGF细胞用多巴胺β-羟化酶(DβH)基因(Hoyle etal.，J.Neurosci.，14，pp.2455-63(1994))指导转基因小鼠中SV40 T-抗原(tsa 58)(DβH-SV)和人生长因子(DβH-hNF)的共表达。嵌合基因的共表达导致在肾上腺髓质和去肾上腺交感神经节中产生肿瘤。切下这些小鼠一只中腹腔区的肿瘤，将肿瘤组织机械溶解，然后放在细胞培养基(DMEM，10％FBS，37℃，5％CO2)中。在开始培养期，有两种不同的细胞类型，大而平的成纤维细胞样细胞和有延长的轴突突起的小而亮的细胞。小细胞表现出儿茶酚胺(catecholaminergic)能神经元的特征，包括对神经丝-L和-M以及酪氨酸羟化酶的免疫反应性。在这些细胞中也存在对SV 40 T抗原的免疫反应性，成纤维细胞样细胞相反，它们对这些标记是阴性的。将这些细胞每星期传代。
按实施例10所述使细胞在CultiSphersTM上生长，然后将其悬浮在藻酸盐(1.5％)或琼脂糖(1％)基质中。在藻酸盐基质的情况下，在被囊后，通过将装置在1％氯化钙水溶液中浸5分钟而交联藻酸盐。按实施例10中所述将细胞/CultiSphersTM/基质负载到PAN/PVC空纤维中。
将负载细胞的BAO保持在无血清培养基中。以选定的时间间隔，在于HBSS中保温30分钟前，洗涤装置。收集基础培养基，用HPLC-ED进行L-多巴检测。在体外80天时，所述装置继续分泌L-多巴。实施例17-遗传修饰的成肌细胞在分化后分泌NGF小鼠C2C12成肌细胞的优点在于是迅速分裂的细胞，在体外可以大量生长，将其转移以表达蛋白质并可分离所选的克隆。在暴露于含少量血清的培养基后，小鼠C2C12细胞可分化到有丝分裂后状态。因此有利于将这些细胞与其组织不受控制的正在分裂的细胞进行被囊比较--后者继续分裂直到它们充满了被膜，而且在数月后观察到碎片的积累。
我们检测了转染的C2C12成肌细胞系在融合成肌小管后继续分泌hNGF的能力。
按制造商的说明，用Lipofectamine试剂(脂质转染胺试剂)(Gibco)，用hNGF基因转染C2C12成肌细胞(ATCC)。在1mg G418中将细胞筛选2周，然后检测NGF输出。将细胞以约260细胞/cm2铺在带或不带盖片的T75烧瓶和24孔平板中。用DMEM和10％FBS每周给细胞补充两次。在1，5，8和13天收集细胞，并测量NGF分泌。在表2中列出了结果。表2对NGF分泌的C2C12筛选的时间表细胞系分泌培养时间％汇合％融合NGF
亲本第一天250nt3/23/95+NGF第一天250nt3/23/95亲本第5天 400nt+NGF第5天 300nt亲本第8天 985***+NGF第8天 901 0.0018亲本第13天1000 80 ND+NGF第13天100 50 0.014％融合＝形成肌小管的成肌细胞％“+NGF指用hNGF基因转染的C2C12”“亲本”指未转染的C2C12细胞以pg/ml/细胞/24小时测量NGF分泌nt＝未试验ND＝未检测*天8细胞在增大，制备用于融合*天8在培养皿中不在T烧瓶中更融合(在烧瓶中完成流式细胞计数)这些结果表明在终止分化成肌小管后，转染的成肌细胞继续分泌所需的异源产物，即NGF。实施例18-遗传修饰的成肌细胞在分化后分泌CNTF我们用含人CNTF基因的pNUT表达载体(Baetge etal.，proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp.5454-58(1986))转染小鼠C2C12成肌细胞。用Northern印迹，ELISA试验，和对胚胎脊髓运动神经元培养物的ChAT活性分析hCNTF基因表达水平和所述因子的生物活性。发现一个C2C12克隆分泌约0.2g NCTF/10个细胞/天。在C2C12成肌细胞分化后，hCNTF的分泌率并未改变。最后，C2C12-hCNTF可以从axotomy-诱导的细胞死亡中救活运动神经元。axotomy1周后，面(facial)核新生率的形态学研究表明，在对照动物中只保持了13.4％的面部运动神经元，而hCNTF的连续释放可使运动神经元的存活率为22.7％。
序列表(1)总的信息(i)申请人Cytotherapeutics，Inc.(ii)发明题目对在生物人工器官中被囊细胞的生长控制(iii)序列个数4(iv)相应地址(A)地址James F.Haley，Jr.，FISH & NEAVE(B)街道1251 Ave.of the Americas(C)城市New York(D)州New York(E)国家USA(F)邮编10020-1104(V)计算机阅读形式(A)界面类型Floppy桌面(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本发明数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)优先申请数据(A)申请号US 08/279,773(B)申请日20-JULY-1994(C)申请号US 08/432,698(D)申请日09-MAY-1995(viii)律师/代理人信息(A)姓名Haley Jr.，James F.(B)登记号27，794(C)对照/卷号CTI-22 CIP PCT(ix)通讯信息(A)电话(212)596-9000(B)传真(212)596-9090(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类单链(D)拓扑线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(xi)序列说明SEQ ID NO1cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类单链(D)拓扑线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(xi)序列说明SEQ ID NO2Gly Arg Gly Asp Ser Pro1 5(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类单链(D)拓扑线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(xi)序列说明SEQ ID NO3Cys Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ala Asp1 510 15Arg(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类单链(D)拓扑线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(xi)序列说明SEQ ID NO4Gly Gly Gly Gly Gly1 5
权利要求书按照条约第19条的修改32 用重组DNA分子转化的细胞，所述DNA分子含有a)在表达时能够诱导细胞分裂的增殖-促进基因，b)与增殖-促进基因可操纵相连的Mx-1启动子，其中通过暴露于足以表达增殖-促进基因量的干扰素，可诱导所述细胞增殖。
33 权利要求32的细胞，其中所述增殖-促进基因是SV40大T抗原。
34 权利要求32的细胞其中所述细胞衍生于神经干细胞。
35 权利要求32的细胞其中所述细胞分泌生物活性分子。
36 权利要求35的细胞其中用含有编码生物活性分子之基因的表达载体遗传转化所述细胞。
37 权利要求35或36的细胞，其中所述生物活性分子选自神经递质，激素，细胞因子，生长因子，营养因子，淋巴因子，血管生成因子，抗体，血管凝集因子和酶。
38 用重组DNA分子转化的转基因哺乳动物，所述DNA分子含有a)在表达时能够诱导细胞分裂的增殖-促进基因，b)与增殖-促进基因可操纵相连的Mx-1启动子。
39 权利要求38的转基因哺乳动物，其中所述增殖-促进基因是SV40大T抗原。
40 权利要求38之转基因哺乳动物的后代。
41 从权利要求38或40的转基因哺乳动物分离的细胞。
42 权利要求41的细胞，其中所述细胞是神经干细胞。
43 生产条件性不死之细胞的方法，包括如下步骤a)用重组DNA分子转化的细胞，其包括在表达时能够诱导细胞分裂的增殖-促进基因，及与增殖-促进基因可操纵相连的Mx-1启动子，以便通过暴露于足以表达增殖-促进基因量的干扰素，可诱导所述转化细胞增殖；b)培养所述转化细胞。
权利要求
1 在生物人工器官中控制细胞分布的方法，包括将所述细胞暴露于抑制细胞增殖或促进细胞分化的处理，所述处理在植入宿主体内后是有效的。
2 根据权利要求1的方法，其中所述处理包括用与可调节启动子可操纵相连的促进增殖的基因转化细胞以便在植入宿主体内后可以抑制增殖促进基因的表达。
3 根据权利要求2的方法，其中所述增殖促进基因是癌基因。
4 根据权利要求3的方法，其中所述癌基因选自c-myc，v-mos，v-Ha-ras，SV40早期区和E1-A。
5 根据权利要求2的方法，其中，所述可调节启动子选自四环素-反应性启动子，干扰素-反应性启动子，糖皮质激素-反应性启动子和反转录病毒长末端重复启动子。
6 根据权利要求5的方法，其中所述启动子是Mx1启动子，而增殖-促进基因是SV40早期区。
7 根据权利要求1的方法，其中，所述处理包括用与可调节启动子操纵相连的增殖-抑制基因转化细胞以便在植入宿主体内后表达增殖-抑制基因，但在体外受到抑制。
8 根据权利要求7的方法，其中所述增殖-抑制基因是选自p53基因和RB基因的肿瘤抑制基因。
9 根据权利要求1的方法，其中所述处理包括用与可调节启动子操纵相连的分化-诱导基因转化细胞以便在植入宿主体内后表达分化-诱导基因，但在体外受到抑制。
10 根据权利要求9的方法，其中所述分化-诱导基因是高迁移率的染色体蛋白质14。
11 根据权利要求1的方法，其中所述处理包括将细胞暴露于增殖-抑制化合物或分化-诱导化合物。
12 根据权利要求11的方法，其中增殖-抑制化合物或分化-诱导化合物选自佛波醇酯，肝素，TGF-β，抗坏血酸，分裂素，brdU，PGE1，dbcAMP，Ara-C，烟酰胺和SGP。
13 根据权利要求1的方法，其中所述处理包括从暴露于增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物中取出细胞。
14 根据权利要求13的方法，其中增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物选自EGF，TGF-α和双调蛋白，所述细胞是神经干细胞。
15 根据权利要求13的方法，其中增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物是FGF生长因子家族成员和至少CNTF或NGF生长因子家族中一个成员的混合物，所述细胞是神经干细胞。
16 根据权利要求13的方法，其中增殖-刺激化合物或分化-抑制化合物是多谱系生长因子，所述细胞是造血干细胞。
17 在生物人工器官中控制细胞分布的方法，包括将所述人工器官的至少一个生长表面暴露于抑制细胞增殖或促进细胞分化的处理，所述处理在植入宿主体内后是有效的。
18 根据权利要求17的方法，其中所述处理包括用有效量的至少一种细胞外基质分子包被生长表面。
19 根据权利要求18的方法，其中用细胞外基质分子包被的生长表面包括生物人工器官的内腔表面。
20 根据权利要求18的方法，其中用细胞外基质分子包被的生长表面包括生物人工器官内被囊的微载体。
21 根据权利要求1的方法，其中所述处理包括将细胞悬浮在生物人工器官内的水凝胶基质中，所述基质是用增殖-抑制或分化-诱导肽或肽序列衍生的。
22 根据权利要求21的方法，其中所述水凝胶基质是由肽序列衍生的琼脂糖组成，所述肽序列选自含RGD的序列(ArgGlyAsp；SEQ ID NO2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1的AA5-AA9)，含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的A11-AA15)。
23 根据权利要求20的方法，其中将所述微载体悬浮在权利要求21-22的任一种水凝胶基质中。
24 控制生物人工器官内细胞分布的方法，包括将生物人工器官内的至少一个生长表面暴露于促进细胞粘附于其上的处理。
25 根据权利要求24的方法，其中所述处理包括将化合物衍生或吸附到生长表面上，所述化合物选自聚(d-赖氨酸)含RGD的序列(ArgGlyAspl；SEQ ID NO2的AA2-AA4)，含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg；SEQ ID NO1的AA5-AA9)，含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal；SEQ ID NO3的A11-AA15)。
26 根据权利要求24的方法，其中所述处理包括在生物人工器官内形成惰性支架。
27 根据权利要求26的方法，其中所述惰性支架是由选自聚(羟乙基异丁烯酸酯)和聚(羟乙基异丁烯酸酯-共-甲基异丁烯酸酯)的化合物形成的。
28 控制生物人工器官内细胞分布的方法，包括将生物人工器官内的至少一个生长表面暴露于抑制细胞粘附于其上的处理。
29 根据权利要求28的方法，其中所述处理包括在生长表面上衍生或吸附PEO-PDMS。
30 根据权利要求1的方法，其中所述处理包括将细胞暴露于增殖-抑制剂量的UV辐射。
31 生物人工器官包括(a)生物可相容的，选择性渗透的套；和(b)活细胞核，其中将细胞暴露于权利要求1-30的任一处理中，以便在植入宿主体内后可以控制生物人工器官内的细胞分布。
全文摘要
本发明涉及通过将细胞暴露于一种处理而在生物人工器官中控制细胞分布的方法和组合物，所述处理在所述生物人工器官中抑制细胞增殖，促进细胞分化或影响细胞粘附于生长表面。所述处理包括(1)遗传操作细胞，(2)将所述细胞暴露于增殖抑制化合物或分化诱导化合物或从暴露的增殖刺激化合物或分化抑制化合物中取出所述细胞；将所述细胞暴露于辐射，和(3)用ECM分子影响细胞增殖或粘附的分子，或惰性支架，或其组合修饰BAO的生长表面。可以组合使用这些处理。在生物人工器官中对被囊细胞的生长控制。
文档编号C12N15/12GK1152938SQ95194187
公开日1997年6月25日 申请日期1995年7月20日 优先权日1994年7月20日
发明者M·施恩斯廷, M·S·舒彻特, F·T·根泰尔, J·P·哈曼格, L·M·霍兰德, B·M·卡恩, E·J·多赫逖, S·R·温, P·阿比舍尔, A·麦辛 申请人:细胞治疗公司