专利名称：利用prosaposin衍生多肽缓解神经性疼痛的方法
背景技术：
发明领域本发明总的来说涉及疼痛治疗领域，具体来说涉及使用prosaposin衍生多肽来治疗神经病理性疼痛。
背景信息神经病理性疼痛是神经损伤的结果。和组织损伤引起的锐痛不同，神经病理性疼痛需在创伤性损伤后发展几天或几月。另外，组织损伤引起的疼痛局限于组织修复这段时间，而神经病理性疼痛一般是长期或者慢性的。而且，神经病理性疼痛可是自发的，或者是通常是非疼痛的刺激的结果。
神经病理性疼痛的临床原因很广泛，包括创伤和疾病。例如，创伤性神经压迫或挤碎，以及脑和脊髓的创伤性损伤是神经病理性疼痛的常见原因。另外，创伤性神经损伤也可以引起神经瘤形成，此时，疼痛是畸形神经再生的结果。还有，肿瘤相关的神经病理性疼痛是肿瘤的痛性生长压迫邻近的神经、脑或脊髓引起的。神经病理性疼痛也伴随于糖尿病或酒精中毒之类的疾病。
不幸的是，神经病理性疼痛常常对现有的药物疗法有抗性。另外，现有的药物疗法有严重的副作用，包括，认知改变、镇静作用、恶心和使用麻醉性药物时的药物成瘾等。许多患神经病理性疼痛的受试者年龄较大或有其它疾病，因此他们对现有的药物疗法副作用的耐受性特别有限。在缓解神经病理性疼痛而不经常产生不可耐受的副作用方面，慢性疼痛患者的抑郁和自杀倾向证明了现有疗法的缺陷。
良好的缓解神经病理性疼痛的方法，可以提高创伤和疾病引起的神经病理性疼痛患者的生活质量。然而，既可有效缓解神经病理性疼痛，而无镇静作用或成瘾作用之类的副作用的药物现在还没有。因此，就需要既可以缓解神经病理性疼痛而不产生令人不快的副作用的方法。本发明满足了这种要求，同时也具有相应的优点。
发明概主述本发明提供了一种通过向受试者施用有效剂量prosaposin活性片段来缓解受试者神经病理性疼痛的方法。举例来说，本发明提供了一种方法，它通过向受试者施用有效剂量的具有如下氨基酸序列的prosaposin活性片段Cys-Glu-phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(SEQ IDNO:1)或Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr(SEQ ID NO:2)，可以缓解起因于外周神经、背根神经节、脊髓、脑干、丘脑或皮层疾患的神经病理性疼痛。另外，本发明提供了一种通过向受试者施用有效剂量prosaposin活性片段来预防受试者神经性疼痛的方法。本发明也提供了prosaposin衍生多肽片段以及这些片段在刺激神经轴突赘生(outgrowth)，抑制神经细胞死亡、促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘方面的应用。另外，本发明还提供了一种通过将含有有效剂量prosaposin活性片段的组合物接触神经细胞来抑制感觉性或运动性神经病变的方法。
附图
简述图一显示在Chung氏模型大鼠中，prosaposin衍生的22聚多肽(SEQ ID NO:1)快速浓注前(0时)和注射后不同时间触觉感觉倒错(tactile allodynia)的阈值。
图二显示了在Chung氏模型大鼠中，prosaposin衍生的14聚多肽(SEQ ID NO:2)快速浓注前(0时)和注射后不同时间触觉感觉倒错的阈值。
图三显示了腹腔内给予prosaposin衍生的14聚多肽(SEQ IDNO:2)或盐水后，糖尿病大鼠对0.5％福尔马林的反应出的总的退缩次数。
发明详述本发明提供了一种通过向受试者施用有效剂量prosaposin活性片段来缓解受试者神经病理性疼痛的方法。如说明公开的，本发明提供的方法可以在用药后30分钟内缓解受试者神经病理性疼痛。这种方法可以缓解起因于外周神经、背根神经节、脊髓、脑干、丘脑或皮层疾患的神经病理性疼痛。
用于本发明的多肽衍生自prosaposin,prosaposin是一个517氨基酸的蛋白质，最初做为四种鞘脂激活蛋白的前体而得到分离鉴定(Kishimoto等.，J.Lipid.Res.,33:1255-1267(1992))。prosaposin中四个相邻串联的功能区在溶酶体中加工产生saposinA、B、C、D，它们激活溶酶体水解酶对糖鞘脂的水解(0’Brien和Kishimoto,FASEB J.,5:301-308(1991))。
在人和大鼠脑中发现了高浓度prosaposin的未加工形式，它们定位于神经表面的细胞膜内。在胚胎发育中，prosaposin mRNA在脑和背根神经节中较丰富。另外，prosaposin和神经节苷脂有高亲合力，这可刺激轴突赘生，促进神经节苷脂从分子团向膜的转移。
prosaposin的神经营养活性与它在神经细胞群中的定位是一致的(0’Brien等.，Proe.Natl.Acad.Sci.,USA 91:9593-9596(1994)；Sano等.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,204:994-1000(1994))。prosaposin在体外和体内都可以刺激运动神经元轴突的赘生，prosaposin还可以提高胆碱乙酰基转移酶活性，该活性是神经分化的标志。另外，prosaposin可以抑制神经瘤中神经细胞的死亡(0’Brien等.，见上，1994；0’Brien等，FASEB J.9:68l-685(1995))。
prosgposin的神经营养作用定位于saposin C，这是一个含80个氨基酸的功能区。一个相当于saposin C功能区中氨基酸8-29的22聚多肽(SEQ ID NO:1)可以刺激轴突的赘生，提高胆碱乙酰基转移酶活性，抑制神经瘤中神经细胞的死亡(0’Brien等.，见上，1995)。
prosaposin或prosaposin衍生的22聚多肽(SEQID NO:1)，可以通过促进轴突的赘生来调节运动神经元的功能。在本发明之前，人们不知是prosaposin还是prosaposin的多肽片段可以影响感觉神经元功能。而且，人们只知道在用药24-48小时以后，prosaposin和prosaposin衍生多肽才具有刺激运动神经元轴突赘生的神经营养作用，(例如，见0’Brien等.，见上，1994)。prosaposin和prosaposin衍生多肽在更短时间内的神经营养作用尚未证明。
与之相反，本发明提供了一种缓解神经病理性疼痛的方法，它涉及运动神经元成分和感觉神经元成分。另外，这个方法可以在几分钟内有效缓解神经病理性疼痛，而不是以前证明的prosaposin和prosaposin衍生多肽发挥神经营养作用需要几个小时或是几天。
本方法在缓解神经病理性疼痛方面的有效性，在公认的Chung氏大鼠外周神经疾病模型中得到了证明。Chung氏大鼠模型中，左侧脊神经L-5和L-6的部分连接使受影响的左足产生了对轻压的持久的高敏感性。据Kim和Chung,Pain 50:335-363(1992)中描述，这种高敏感性与有灼性神经痛的受试者体验到的疼痛类似。
在给予prosaposin活性片段以前，Chung氏模型大鼠受影响足应答于压力(Von Frey的头发)而后撤的阈值为3.0-4.0g(见图一)。在给予prosaposin活性片段(prosaposin衍生的22聚多肽；SEQ IDNO:1)之后，神经病理性疼痛得到缓解，这可以由受影响足后撤前耐受压力的增加来证明。如图一所示，在用药后15分钟内发生的prosaposin活性片段的效果维持3小时。这种神经病理性疼痛的快速缓解，与以前报道的prosaposin和prosaposin衍生多肽的迟发的神经营养作用，形成明显的反差。
在痛性糖尿病神经病变的大鼠模型中，prosaposin衍生多肽SEQID NO:2这样的prosaposin活性片段也可以缓解疼痛。如实施例三所述，在选择性β细胞毒素streptozotocin诱导的短期胰岛素缺陷型糖尿病的大鼠中，多肽SEQ ID NO:2可以减轻感觉倒错。这样，本发明的一种prosaposin活性成份，或者说一种prosaposin衍生多肽，可以用来缓解多种神经病理性疼痛，包括机械性疼痛，如Chung氏模型大鼠所演示，和代谢性疼痛，如利用这些多肽减轻糖尿病大鼠疼痛时所演示。
此处使用的术语“神经病理性疼痛”指的是神经损伤导致的疼痛。神经病理性疼痛和感受伤害性疼痛不同，后者是由急性组织损伤引起的，涉及小的皮下神经或者肌肉或结缔组织中的小神经。涉及感受伤害性机制的疼痛，常常局限于组织修复期，一般可以用现有的止痛药和阿片样物质缓解，详细描述见Myers,Regional Anesthesia20:173-184(1995)。
典型的神经病理性疼痛是持久的或者慢性的，一般需在最初的急性组织损伤后发展几天或几月。神经病理性疼痛可以牵涉到顽固的自发性疼痛，也可以牵涉到感觉倒错，后者是对正常情况下为非痛性刺激的痛性反应。神经病理性疼痛也可以表现为痛觉过敏，此时对正常情况下较轻微的痛性刺激比如针刺有异常反应。与感受伤害性疼痛不同，神经病理性疼痛常常对阿片样物质治疗不敏感(Myers，见上，1995)。
本发明提供的方法可用于缓解起因于外周神经、背根神经节、脊髓、脑干、丘脑或皮层疾患的神经病理性疼痛。此处使用的术语“疾病”，指的是任何可以产生神经病理性疼痛的创伤、损伤、疾病或病理状况。
本发明提供的方法可用于缓解不论任何病因的神经病理性疼痛。例如，本发明提供的方法可以用来缓解如下的外周神经病变引起的神经病理性疼痛，比如起因于神经瘤；神经压迫、神经挤碎、神经牵拉或不完全的神经断裂；单神经病变或多神经病变。本发明提供的方法也可以用于缓解如下病变引起的神经病理性疼痛，比如起因于背根神经节压迫；脊髓炎；脊髓挫伤、肿瘤或不完全断裂；脑干、丘脑或皮层肿瘤；或者脑干、丘脑或皮层创伤(举例见表一)。
表一神经神经瘤(切断，神经横断)神经压迫(缠绕类的神经病，肿瘤)神经挤碎、牵拉或不完全的横断(创伤)单神经病糖尿病放射缺血脉管炎多神经病脊髓灰质炎后综合征糖尿病乙醇中毒淀粉样物毒物HIV甲状腺功能低下尿毒症维生素缺乏化疗(长春新碱，顺铂，paclitaxel)ddC(zalcitabine)Fabry氏病背根神经节压迫(椎间盘、肿瘤、瘢痕组织)神经根撕脱炎症(带状疱疹后神经痛)脊髓挫伤肿瘤不完全横断脑干、丘脑、皮层梗塞、肿瘤、创伤本发明提供的方法可以用于缓解源于神经瘤的神经病理性疼痛。神经瘤可以由神经的创伤性损伤，尤其是神经的严重挤碎或断裂发展而来。在神经瘤中，正常情况下可以使外周神经再生的轴突赘生，在疤痕之类的物理阻塞下出现畸形生长或方向有差错。这样，再生的神经纤维在局部缠绕，在机械和物理因素的促进下，出现不正常的电生理活动和疼痛(Myers，见上，1995)。神经切断后形成的神经瘤可以引起阵发性疼痛，也可以导致使用假肢促发的疼痛。如此处所述，根据本发明提供的方法，采用一种prosaposin活性片段，运种神经病理性疼痛可以得到缓解。
神经压迫也可以引起神经病理性疼痛，这种疼痛也可以采用本发明提供的方法来治疗。神经压迫可以是毁灭性的，如创伤性神经挤碎时，也可以是持久的温和的，如继发于大神经束近侧的肿瘤生长或疤痕形成。压迫性神经病可以做为神经血液供应改变的结果而出现，这种血液供应改变可以引起严重缺血和继发的神经损伤(Myers，见上，1995)。
根据本发明提供的方法，使用一种prosaposin活性片段也可以缓解单神经病或多神经病产生的神经病理性疼痛。此处使用的神经病是外周神经系统的功能失衡或病理改变，临床特征为感觉或运动神经元异常。术语单神经病指单个外周神经元受影响，术语多神经病指多个外周神经元受影响。
神经病的病因可能已知，也可能未知(举例见，Myers，见上，1995；Galer,Neurology 45(suppl 9):S17-S25(1995)；Stevens和Lowe,Pathology,Times Mirror International PublishersLimited,London(1995))。已知的病因包括疾病综合征或中毒状态；例如，糖尿病是最常见引起神经病的代谢疾病。本发明提供的方法可以缓解糖尿病、放射病、缺血或脉管炎引发的单神经病伴随的神经病理性疼痛。本发明提供的方法可以缓解脊髓灰质炎后综合征、糖尿病、乙醇中毒、淀粉样物、毒物、HIV、甲状腺功能低下、尿毒症、维生素缺乏、化疗、ddC、Fabry氏病引发的多神经病伴随的神经病理性疼痛(见表一)。本发明提供的方法尤其可以缓解脊髓灰质炎后肌肉痛。本发明提供的方法也可以缓解未知原因引起的神经病理性疼痛。
如此处所述，一种prosaposin活性片段也可以用来缓解神经病理性疼痛或者用于刺激神经轴突赘生，抑制神经细胞死亡，促进髓鞘形成或抑制脱髓鞘，也可以用于抑制感觉性神经病。此处使用的术语“prosaposin活性片段”指的是氨基酸序列对应于prosaposin的序列，而有缓解神经病理性疼痛，或刺激轴突赘生、抑制神经细胞死亡、抑制脱髓鞘或促进髓鞘形成，或抑制感觉或运动神经病等活性的多肽。
此处所用的缓解神经病理性疼痛，指的是减轻神经病理性疼痛的严重性，而减轻受试者的痛苦，提高其生活质量。prosaposin的一种活性片段也可以缓解许多已建立的神经病理性疼痛动物模型的疼痛，见以下详细描述(也可见Bennett，Muscle & Nerve 16:1040-1048(1993))。此处使用的术语“prosaposin活性片段”和“prosaposin衍生多肽”是同义词。
优选的prosaposin活性片段含有氨基酸序列Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(SEQ ID NO:3)，它对应于saposinC氨基酸18-29的序列。更优选的prosaposin活性片段序列是Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-I1e-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(SEQ ID NO:1)，它对应于saposin C氨基酸8-29的序列，或Thr-D-Ala-Leu-1le-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr(SEQ ID NO:2)，它对应于saposin C氨基酸16-29的序列，但2位的赖氨酸残基替换成了D-丙氨酸残基；8位的赖氨酸残基替换成了丙氨酸残基；去除了11位的赖氨酸残基而在C末端添加了酪氨酸残基(见表2)。如下描述，这些修饰可以增加多肽的稳定性或通过血脑屏障的数量。此处使用的D-丙氨酸可以用D-Ala或X表示。
prosaposin活性片段可以有12-80个氨基酸，其中80个氨基酸是saposin C的全长。优选的prosaposin活性片段大约有12-40氨基酸，更优选的为14-22个氨基酸。
对于缓解人类受试者神经病理性疼痛，优选人的prosaposin，比如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。但是根据本发明提供的方法，其它哺乳动物prosaposin衍生的活性片段，也可以用来缓解人的神经病理性疼痛。比如，象SEQ ID NO:4到7罗列的小鼠、大鼠、豚鼠、或牛prosaposin活性片段，也可以用于缓解受试者的神经病理性疼痛。
如表三所示，相当于saposin C氨基酸8-29的人类prosaposin活性片段的氨基酸序列，在其它种属中保守性很强。特别是邻接的天冬胺酰残基(N)的氨基酸残基在人、小鼠、大鼠、豚鼠和牛的prosaposin中是保守的。另外，在距离两个天冬胺酰残基的N-端3-4个残基处有一个保守的亮氨酸残基，在距离两个天冬胺酰残基的C-端2-8个残基处有一个或多个带电性残基(天冬氨酸(D)，赖氨酸(K)，谷氨酸(E)或精氨酸(R))。在表三中每个保守性强的氨基酸残基用下划线标出。
对于prosaposin活性片段在缓解神经病理性疼痛或刺激轴突赘生，抑制神经细胞死亡、抑制脱髓鞘或促进髓鞘形成，或抑制感觉或运动神经病等方面的活性，以上所述的保守的邻接的天冬胺酰残基、亮氨酸残基和带电性残基，可能具有重要的作用。例如，prosaposin衍生的22聚多肽(SEQ ID NO:1)或prosaposin衍生的14聚多肽(SEQ IDNO:2)是prosaposin活性片段，如例一所示(见图一和图二)，它们可以减轻Chung氏外周神经病大鼠模型中可以见到的感觉倒错。相反，在用Chung氏大鼠分析时发现，SEQ ID NO:1中的保守的天冬胺酰残基替换成天冬氨酸残基(见表4)的突变的22聚多肽(SEQ ID NO:8)缺少缓解神经病理性疼痛的活性(见实施例一)。
多肽减轻神经病理性疼痛的活性也可以与神经营养作用相关。实施例如，prosaposin衍生的22聚多肽(SEQ ID NO:1)和prosaposin衍生的14聚多肽(SEQ ID NO:2)可以缓解神经病理性疼痛，也具有神经营养作用。另外，如上所述，突变的22聚多肽(SEQ ID NO:8)没有缓解神经病理性疼痛所得活性，它也不具有神经营养作用的特性，进一步说明减轻神经病理性疼痛的活性也可以与其神经营养作用相关。替换掉第二个保守的天冬胺酰残基而形成的突变的14聚多肽M-1(SEQID NO:9)，缺少神经营养作用，提示SEQ ID NO:9的多肽也不具有缓解神经病理性疼痛的作用。替换掉保守的亮氨酸残基而形成的突变的14聚多肽M-2(SEQ ID NO:10)，缺少神经营养作用，提示SEQ ID NO:10的多肽也不具有缓解神经病理性疼痛的作用。相反，prosaposin衍生的12聚多肽(SEQ ID NO:3)，具有以上所述的邻接的天冬胺酰、亮氨酰和带电性残基，也就具有神经营养因子的活性。这样，根据本发明提供的方法，prosaposin衍生的12聚多肽(SEQ ID NO:3)，也可以缓解神经病理性疼痛。
prosaposin衍生多肽及其神经营养性的类似物，在促进外周或中枢神经系统的毒性、创伤性、缺血性变性性或遗传性损伤后的恢复中，具有明显的治疗用途。另外，这些肽也可以促进髓鞘形成、抑制脱髓鞘，因此可以拮抗脱髓鞘性疾病的有害作用。此外，这些肽刺激神经元的分枝，抑制神经组织的程序性死亡。本发明中，具有神经营养作用和髓鞘营养作用的多肽，具有12或14到大约50个氨基酸，更优选的多肽包括SEQ ID NO:2中非自然存在的序列。例如，本发明的具有神经营养活性的髓鞘营养活性的多肽，具有14至大约50个氨基酸，包括如SEQ ID NO:2所示的非天然prosaposin序列。
本发明的另外一个方案，提供了一种方法通过在分化或未分化的神经细胞中施以有效剂量的、对神经轴突和髓鞘有正向作用含有12或14到大约50个氨基酸的多肽，优选SEQ ID NO:2所示多肽来刺激神经轴突赘生、抑制神经细胞死亡、促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘。在本发明的刺激神经轴突赘生、抑制神经细胞死亡、促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘的方法中，有效剂量的多肽可以具有14到大约50个氨基酸，包括SEQ ID NO:2显示的多肽。
利用实施例四和实施例七中描述的程序，专业人士很容易测定任何这种多肽刺激神经轴突赘生、抑制神经细胞死亡、促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘的活性。分析这些多肽在促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘方面能力的方法，列在下面实施例六和实施例七中。
本发明还提供了一种使用含有有效抑制剂量prosaposin活性片段的组合物接触神经细胞来抑制感觉性神经病变的方法。例如，本发明提供了一种使用含有有效抑制剂量的具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中显示序列的多肽的组合物接触神经细胞来抑制感觉性神经病变的方法。
如实施例十所示，一种prosaposin衍生多肽可以用来抑制感觉性神经病。在一种紫杉醇诱发感觉性神经病的小鼠模型中，通常可以看到热觉丧失。然而，在对taxol处理过的小鼠给以100μg/kg的序列为SEQ ID NO:1的多肽时，热觉丧失的程度得到抑制。这些结果提示prosaposin衍生多肽可以是感觉性和运动性神经元的神经营养因子。
本发明的方法种使用的多肽也可以是SEQ ID NO:11到SEQ IDNO:19。例如，将prosaposin衍生的22聚多肽SEQ ID NO:1和细胞因子以及生长因子进行序列对比，发现它和包括hCNTF、hIL-6、hIL-3、hTL-1γ、红细胞生成素(hEPO)、人白细胞抑制因子(hLIF)、hIL-1β链和oncostatin-M(hONC-M)在内的许多种人(h)细胞因子具有相似的序列。SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:19的多肽，和prosaposin活性片段SEQ ID NO:1一样，含有相邻的或被一个氨基酰残基分开的两个天冬胺酰残基。另外，与prosaposin活性片段(22聚多肽，SEQ IDNO:1)中见到的一样，细胞因子衍生多肽可以在距两个天冬胺酰残基的N端3-4个氨基酸残基的位置，含有一个亮氨酸残基(L)或异亮氨酸残基(I)；在距离两个天冬胺酰残基的C-端2-8个残基处有一个或多个带电性残基(天冬氨酸(D)，赖氨酸(K)，谷氨酸(E)或天冬酰胺(R))。这些残基在表五中用下划线标出。
细胞因子受体结合模型(Sprang和Bazan,Curr.Opin.Struct.Biol.,3:816(1993))突出了在许多细胞因子中共有的四螺旋束结构的进化保守性。每个和prosaposin衍生多肽序列SEQ ID NO:1相关的细胞因子和生长因子的序列定位于螺旋A或螺旋B之间(AB环)或存在于细胞因子的螺旋C内。
结构相美的细胞因子和生长因子衍生多肽SEQ ID NO:11到SEQ IDNO:19也可以用于缓解神经病理性疼痛的方法中。SEQ ID NO:11到SEQID NO:19的多肽缓解神经病理性疼痛的活性的测定，可以用实施例一描述的Chung氏大鼠;也可以用实施例三描述的糖尿病性神经病模型，描述见Wall等.，Pain 7:103-113(1979)；Bennet和Xie,Pain33:87-107(1988)；Lekan等.，Soc.Neurosci.Abstr.18:287(1992)或Palacek等Soc.Neurosci.Abstr18:287(1992)；或者用测定神经病理性疼痛的其它方法。
细胞因子和生长因子衍生多肽SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:19也可以用于刺激神经轴突赘生、抑制神经细胞死亡、促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘以及抑制感觉性或运动性神经病变的方法中。对于具有14到大约50个氨基酸含有SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:19的一种序列中活性神经营养区的多肽，可以根据实施例四的描述测定其刺激神经轴突赘生的活性；可以根据实施例五的描述测定其抑制神经细胞死亡的活性；可以根据实施例六的描述测定其促进髓鞘形成的活性；可以根据实施例七的描述测定其抑制脱髓鞘的活性；可以根据实施例十的描述测定其抑制感觉性神经病的活性。
一种prosaposin活性片段或一种可以用来缓解神经病理性疼痛的多肽，可以利用神经病理性疼痛动物模型的一种，通过筛选一组随机多肽或感兴趣的一大组多肽，或者文库而得到。这种感兴趣的多肽，举例来说，可以是细胞因子和生长因子衍生多肽SEQ ID NO:11到SEQ IDNO:19，它们含有和prosaposin活性片段(SEQ ID NO:1)相关的序列。感兴趣的多肽，举例来说，还可以是一群氨基酸序列和SEQ ID NO:1相关，也就是在SEQ ID NO:1相应位置上含有保守天冬胺酰残基，亮氨酰/异亮氨酸残基和一个或多个带电性残基的多肽，这些位置在SEQID NO:1中存在，但含有一个或多个区别于SEQ ID NO:1的氨基酸。
多肽文库，举例来说，包括含有多肽和模拟肽分子的标记的化学文库。多肽文库还包括由噬菌体展示技术产生的那些。噬菌体展示技术包括多肽分子在噬菌体表面的表达以及使蛋白配基与其编码核酸相联系或者可以联系的其它方法。产生噬菌体展示文库的方法，包括专业人士熟知的使表达多肽产物多样化的载体和方法(举例可见，Smith和Scott,Methods Enzymol.217:228-257(1993)；Smith和Scott,Science 249:386-390(1990)；以及Huse,WO91/17141和WO91/07149)。这些和其它熟知的方法可以用来产生噬菌体展示文库。如本申请所述，噬菌体展示的多肽可以从文库中裂解出来，用来测定缓解神经病理性疼痛的活性，或其它神经营养或髓鞘营养活性。如果需要，可以拿一群多肽来测定活性，然后再将其细分，重复测定以便从此群多肽中分离到活性多肽。其它用于本发明的产生多肽的方法，举例来说，包括基于如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2等这类prosaposin活性片段的氨基酸序列进行的合理设计和突变。
如此处所示，一种prosaposin活性片段或者一种可用于缓解神经病理性疼痛的多肽，可以通过其在多种成功建立的神经病理性疼痛的动物模型中的缓解神经病理性疼痛的活性来鉴定(Bennet，见上，1993)。例如，利用通过大鼠脊髓节神经连接而产生的外周神经病模型可以鉴定prosaposin活性片段。Chung氏大鼠模型模拟了因为外周神经的损伤而患有灼性神经痛的受试者的症状(Kim和Chung，见上，1992)。Kim和Chung的手术程序使受影响足产生持久的针对有害热和机械感觉倒错的病觉过敏。如实施例一所述，根据Kim和Chung发展的手术程序获得的脊神经连接的大鼠，可以用于鉴定一种prosaposin活性片段是否可以用于缓解神经病理性疼痛。
prosaposin活性片段或者一种可用于缓解神经病理性疼痛的多肽，可以通过其在痛性糖尿病性神经病大鼠模型中缓解神经病理性疼痛的活性来鉴定。也有人报道了streptozotocin这样的选择性β细胞毒素诱导产生的短期胰岛素缺陷型糖尿病大鼠，对热、机械和有害的化学刺激产生的痛觉过敏(Calnutt等，Pain 68:293-299(1996))。这样的大鼠模型很好地模拟了糖尿病受试者显见的病觉，它们可以表现出多种异常感觉，包括自发性疼痛、轻触激发痛、和痛觉过敏。streptozotocin和另一种选择性β细胞毒素处理的大鼠，可以用一种感兴趣的prosaposin活性片段处理；然后，测定它对有害刺激，比如0.5％伏尔马林的反应。反应减弱可以用来鉴定一种prosaposin活性片段或一种可用于缓解神经病理性疼痛的多肽。
prosaposin活性片段或者一种可用于缓解神经病理性疼痛的多肽，也可以利用Wall等的神经瘤模型来鉴定。这个公认的神经病理性疼痛模型，复制了人类截肢或完整肢体的神经横断后可以见到的症状(Wall等，见上，1979)。如上所述，神经截断后，由于轴突新枝生长受阻，很容易形成神经瘤。
慢性压迫损伤模型也可以用于鉴定prosaposin活性片段或者一种可用于缓解神经病理性疼痛的多肽。Bennet和Xie，见上，1988的慢性压迫损伤模型，是外周神经病大鼠模型，它可以产生在人类中可见到的类似的痛觉紊乱。在Bennet模型中，神经损伤是通过对大鼠坐骨神经实行松驰的压迫性绑扎来产生的，这造成压迫远端的神经变性。这种压迫使大鼠产生自发性疼痛，以及感觉倒错和痛觉过敏。
灵长类动物神经病理性疼痛模型也可以用于鉴定prosaposin活性片段或者一种可用于缓解神经病理性疼痛的多肽(见，Leken等，见上，1992；Palacek等，见上，1992)。
本文中，代表prosaposin活性片段，prosaposin衍生多肽或本发明提供方法中使用的多肽的术语“多肽”，指的是一种含有天然氨基酸、非天然氨基酸或化学修饰氨基酸的化合物，只要它具有此处描述的缓解神经病理性疼痛或其它神经营养或髓鞘营养活性。prosaposin衍生多肽，也可以是肽模拟物，它具有非氨基酸化学结构，但模拟了prosaposin衍生多肽的结构，具有了后者的活性。这样的模拟物的特征是一般具有在其prosaposin衍生多肽等同物的空间排列的相应位置的类似的物理特性，比如大小、电荷或亲水性。多肽模拟物的具体例子是氨基酸之间的肽键被碳-碳键或其它的专业人士熟知的键替换形成的化合物(例如，见，Sawyer,Peptide Based DrugDesign,ACS,Washinton(1995))。
本文中的“氨基酸”，指的是二十种天然氨基酸中的一种，除非特别指出，包括L-氨基酸和D-氨基酸。氨基酸这个术语也指另外一些化合物，比如化学修饰的氨基酸，它包括氨基酸类似物、正亮氨酸这样不掺入蛋白的天然氨基酸和专业人士清楚的具有氨基酸特性化学合成物，只要用它替代后多肽保持生物学活性。例如，谷氨酰胺可以做为天冬酰胺的氨基酸类似物，只要这个天冬酰胺被替换后仍然保持此处描述的缓解神经病理性疼痛或其它神经营养、髓鞘营养的活性。其它氨基酸和氨基酸类似物的例子罗列在Gross和Meienhofer,ThePeptideAnalysis,Synthesis,biology,Academic Press,Inc.,NewYork(1983)。此处的氨基酸还可以是氨基酸模拟物，它是表现出基本与氨基酸相同的官能团空间排列，但不一定含有氨基酸特征性的α-氨基和α-羰基的一种结构。
prosaposin活性片段或者用于本发明的多肽，可以利用专业人士熟知的方法来分离或合成。这样的方法包括产生多肽的重组DNA技术和化学合成技术。在适宜的宿主中，通过表达编码多肽的核酸序列来生产多肽的重组方法为专业人士所熟知，例如描述可见Sambrook等，Molecular Cloning:A laboratory Manual，第二版，第一卷到第三卷，Cold Spring Harbour Laboratory press,New York(1989)。
prosaposin活性片段或者用于本发明的多肽，也可以通过化学合成来产生，例如，通过Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964)描述的固相多肽合成法来合成。专业人士熟知的标准液相法也可以用来合成用于本发明的多肽(例如可见，Bodanszky,Principles ofPeptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin(1984)和Bodanszky,Peptide Chemistry,Springer-Verlag,Berlin(1993))。新合成的多肽可以用如高效液相色谱(HPLC)等方法纯化，可以用如质谱或氨基酸序列分析来鉴定。
现在的理解是，对prosaposin活性片段可以做有限的修饰，而不破坏它的生物学功能。因此，针对prosaposin活性片段的不破坏缓解神经病理性疼痛的生物学功能的修饰，是包括在prosaposin活性片段的概念中的。修饰可以包括，如氨基酸残基的添加、去除或替代；利用可模拟氨基酸结构或功能的化合物的替代；氨基或乙酰基化学半体的添加。修饰的多肽在缓解神经病理性疼痛方面的活性，可以利用神经病理性疼痛动物模型来分析，比如用上面描述的这些或者用实施例一中演示的这些。
可以增加稳定性的的修饰对prosaposin活性片段特别有用。例如，掺入一个或多个D-氨基酸或者将赖氨酸残基替代或去除，可以保护多肽不被降解，进而增加prosaposin活性片段的稳定性。例如，如此处所示，prosaposin衍生的14聚多肽SEQ ID NO:2的序列衍生自saposin C氨基酸16-29，但通过替换或者去除天然的三个赖氨酸残基之每一，在C端添加了一个酪氨酸残基而进行了修饰。特别是，prosaposin衍生的14聚多肽，它是SEQ ID NO:2用D-丙氨酸残基替换了2位的赖氨酸残基；用丙氨酸残基替换了8位的赖氨酸残基，去除了11位的赖氨酸残基。专业人士都知道，2位的D-丙氨酸残基替换，通过保护多肽不被内蛋白酶降解而增加了稳定性(例如可见，Partridge,Peptide Drug Delivery to the Brain 247页，Raven Press,New York(1991))。专业人士都知道，赖氨酸残基的替代或删除可以增加多肽对胰蛋白酶样蛋白酶类的抗性(Partridge，见上，1991)。这些替代可以增加多肽SEQ ID NO:2的稳定性，这样也就可以增加其生物利用度，但并不影响其缓解神经病理性疼痛的活性。
促进多肽穿越血脑屏障的修饰也是有用。比如，增加亲脂性或减低氢键。例如，酪氨酸残基添加到prosaposin衍生多肽(SEQ ID NO:2)的C端，可以增加其憎水性和透过血脑屏障的能力(例如可见，Bank等，Peptides 13:1289-1294(1992)和Partridge，见上，1991)。再比如，可以增加生物学稳定性和透过血脑屏障的能力的嵌合的多肽-药剂，也可以用于本发明提供的方法。
专业人士很容易分析prosaposin活性片段在体内通过血脑屏障的能力，比如实施例二所示。另外，prosaposin活性片段通过血脑屏障的能力，也可以在体外利用根据脑微血管内皮细胞培养系统建立的血脑屏障模型来检测，举例描述见Bowman等，Ann.Neurol.14:396-402(1983)或Takahura等，Adv.Pharmacol.22:137-165(1992)。
此处使用的术语“有效剂量”，指的是可以用来缓解神经病理性疼痛或者预防神经病理性疼痛的prosaposin活性片段的剂量。以日为基础的有效全身用药剂量，取决于受试者的体重。优选的以日为基础的有效全身用药剂量，在0.1μg/kg到1000μg/kg之间。更常选的是以日为基础的有效全身用药剂量是10μg/kg至100μg/kg。多肽的有效剂量，可以利用专业人士熟知的比如实施例一中的描述，或上面揭示的包括在灵长类分析的方法，经验性地测定(Lekin等，见上，1992，以及Palacek等，见上，1992)。
本发明中，在细胞培养液中多肽营养神经和营养髓鞘的典型的最少剂量是5ng/ml。这些多肽的这个剂量或更多一些的剂量，可以用于体外用途。通常，多肽可以使用0.1μg/ml到10μg/ml的浓度。处理具体组织的有效剂量可以利用实施例四和实施例六中的方法测定。
神经细胞可以通过在体内或体外直接给细胞给以多肽来处理。这可以通过如将具体细胞培养在合适的细胞培养液中，然后给培养液中添加多肽的方法来实现。当需要处理的神经细胞在体内，通常在脊椎动物，特别是哺乳动物内时，本发明的多肽可以通过以下描述的技术中任一种来给药。
此处使用的术语“受试者”，指的是一个脊椎动物，通常是一个哺乳动物，尤其是一个人。
本发明提供了通过通过静脉内、肌肉内、皮内、皮下、颅内、脑脊液内、局部、口腔、经皮、经粘膜、鼻内给以有效剂量的prosaposin活性片段缓解神经病理性疼痛或刺激轴突赘生，抑制神经细胞死亡、抑制脱髓鞘或促进髓鞘形成，或抑制感觉或运动神经病等方面的活性的方法。众人皆知的药理学上可以接受的载体，可以和prosaposin活性片段一起使用。这类载体包括如磷酸盐缓冲液(PBS)。
优选的方法是将有效剂量的prosaposin活性片段直接注射入受试者的血流。例如，在外周或脊髓，在静脉内注射prosaposin活性片段。因为如实施例二所述，碘标的prosaposin衍生的，由prosaposin衍生的22聚多肽SEQ ID NO:1中氨基酸12-29的序列组成，而12位的缬氨酸残基替换成酪氨酸残基的18聚多肽Tyr-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu(SEQ IDNO:20)(MW=2000)，可以通过血脑屏障，进入中枢神经系统。脑的摄入大约是0.03％，与和其大小相近的多肽相比，其通过血脑屏障的量属于中等(Bank等，见上，1992)。
如果prosaposin活性片段可以修饰得足以抵抗胃肠消化而且可以吸收，人们通常希望能够口服给药。一个或多个D-氨基酸替代可以增加本发明中prosaposin衍生多肽的稳定性。
直接颅内注射或注射进脑脊液也可以用于将有效剂量的prosaposin活性片段施给受试者的中枢神经系统。另外，prosaposin活性片段可以直接注射或者局部使用或者全身使用用药到外周组织。不同的传统给药方式，包括静脉内、肌肉内、皮内、皮下、颅内、硬膜外、局部、口腔、经皮、经粘膜、鼻内给药也可以使用。
prosaposin活性片段也可以通过持续释放的形式给药。持续释放prosaposin活性片段具有可长时间缓解神经病理性疼痛而不需重复给药的优势。
持续释放可以通过一种持续释放的材料，比如多孔吸附材料、免疫珠、显微泵或其它可以有控制地慢速释放prosaposin活性片段的材料。这种控制释放的材料，为专业人士所熟知，而且可以从商业来源获得(Alza Corp.,Palo Alto CA；Depotech,La Jolla CA；也可见Pardoll,Ann.Rec.Immunol.13:399-415(1995)。另外，可以和prosaposin活性片段配成制剂的生物腐败性或生物降解性的材料，比如聚乳酸、聚半乳糖酸、再生胶原、多层脂质体或其它传统的储备剂型，可以植入人体，来缓释prosaposin活性片段。混合泵、基质附着系统和跨真皮传递装置也在本发明的需要之列。
prosaposin活性片段也可以优先包裹在微团或脂质体中。脂质体包裹技术为人熟知。通过结合靶组织的受体、配体或抗体，脂质体可以到达靶组织，比如神经系统。制备这些制剂为专业人士所熟知(例如可见，Pardridge，见上，1991，以及Radin和Metz,Meth.Enzymol.98:613-618(1983))。
本发明的多肽组合物可以以单位剂量形式包装和施用，比如以相当于受试者每天剂量的量做成注射组合物或局部用制剂，如果需要还可以做成控释剂型。单位剂量形式，比如，可以是含有溶于PBS的或冻干的一日剂量药品的有中隔的封口的玻璃瓶。治疗神经疾病的合适的每日全身用药量，基于脊椎动物的体重，为10-100μg/kg，虽然0.1-1000μg/kg的剂量也可使用。这样，通常70kg的人，全身用药的剂量为7-70,000μg/每日，优选700-7,000μg/每日。局部用药的每日剂量，要比全身用药低一个数量级。口服用药也可以采用。
本发明还提供了一种通过将遗传修饰后可以表达和分泌prosaposin的细胞移植进受试者，来缓解其神经病理性疼痛的方法。移植可以提供prosaposin活性片段的持续来源，这样，也就可以持续缓解神经病理性疼痛。对于遭受长久或慢性神经病理性疼痛的患者来说，这样的方法有其可以免除或减少重复给以prosaposin活性片段的优势。
利用专业人士熟知的方法，很容易用含有编码prosaposin活性片段核酸的表达载体转染细胞(Chang,Somatic Gene Therapy,CRCPress,Boca Raton(1995))。比如移植入脑后，转染的细胞可以表达分泌prosaposin活性片段，这样可以缓解神经病理性疼痛。根据对移植可分泌止痛物质的细胞的描述，这样的方法可以用于缓解神经病理性疼痛。(例如可见，Czech和Sagen,Prog.Neurobiol.46:507-529(1995))。
细胞可以是任何移植后可以存活，改造后可以表达prosaposin活性片段的细胞。实际上，细胞应该是与受试者免疫学上相容的。例如，特别有用的细胞是分离自患者的细胞，因为这样的细胞与受试者是免疫学上相容的。
如果采用显微包裹或免疫抑制等方法，可以保护细胞免于免疫排斥，也可以使用受试者以外来源的细胞。有用的显微包裹膜材料包括藻酸盐-聚L型赖氨酸-藻酸盐和琼脂(例如可见，Goosen,Fundamentals of Animal Cell Encapsulation andImmobilization,CRC Press,Boca Raton(1993)；Tai和Sun,FASEB J.7:1061(1993)；Liu等，Hum.Gene Ther.4:291(1993)；以及Taniguchi等，Transplant.Proc.24:2977(1992))。比如，将聚合物包裹的细胞移植进大鼠的蛛网膜下腔，达到了减轻痛觉的目的(Wang等，Soc.Neurosci.Abstr.17:235(1991))。
治疗人类受试者，细胞可以是人细胞，虽然非人细胞也可以采用。具体地说，人的成纤维细胞、肌肉细胞、神经胶质细胞、神经前体细胞或神经元可以用表达和分泌SEQ ID NO:1类prosaposin活性片段的表达载体转染。原代成纤维细胞比如可以从患者皮肤活检样品获得，在标准的培养条件下维持。原代肌肉细胞也可以用于移植。对神经移植的考虑的描述，举例可见Chang，见上，1995。
从中枢神经系统获得的细胞对于移植到中枢神经系统特别有用，因为在自然环境下细胞的存活率明显增加。在本发明提供的方法中，神经前体细胞更有用，因为神经前体细胞可以在培养物中生长，用表达载体转染，然后引入受试者，在那里它可与整入受试者。可以增殖并分化成神经元的神经前体细胞的分离，在Renfranz等，Cell66:713-729(1991)中有描述。
体外转染的方法为专业人士所熟知(Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual,W.H.Freeman & Co.,New York(1990))。对于可以持续分裂的细胞，如成纤维细胞、肌肉细胞、角质细胞或神经前体细胞，优选逆转录载体。将表达载体转入有丝分裂后细胞如神经元，优选复制缺陷的单纯疱疹病毒1型(HSV-1)载体(During等，Soc.Neurosci.Abstr.17:140(1991))；Sable等，Soc.Neurosci.Abstr.17:570(1991))。
编码prosaposin活性片段的核酸的表达可以在多种专业人士熟知的启动子控制下，包括组成性启动子和诱导性启动子。例如可见，Chang，见上，1995。特别有用的高效表达的组成性启动子是Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列(MLV-LTR)、巨细胞病毒立即早期区(CMV-IE)或猿病毒40早期区(SV40)。
此处揭示了编码prosaposin活性片段的核酸序列。例如，编码SEQID NO:1的核酸序列是5`-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTGACAACAACAAGACTGAGAAAGAAATACTC-3`(SEQ ID NO:21)(Dewji等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 848652-8656(1987))。为了指导表达多肽SEQ ID NO:1的分泌，编码信号序列，比如β-乳糖酶的核酸，可以连接到SEQ ID NO:21上，如Simon等，J.Cell.Biol.104:1165(1987)所描述。
本发明还提供了一种通过使用有效剂量的prosaposin活性片段来预防受试者神经病理性疼痛的方法。预防神经病理性疼痛的方法可用于疼痛发生以前，比如在知道可以引起疼痛的化疗和手术以前。
举以下实施例是为了解释本发明而不是为了局限其范围。
实施例一缓解Chung氏模型大鼠神经病理性疼痛本实施例描述了在外周神经病理性疼痛Chung氏实验模型中，鞘内快速浓注prosaposin活性片段的效果。
三种多肽都由化学合成得到纯品，溶解在灭菌的PBS中，缓冲液PH为中性。
采用Kim和Chung，见上，1992早先描述的过程，在重120-150克的Sprague-Dawley大鼠施行手术，诱发感觉倒错状态。简单来说，大鼠用氟烷麻醉；然后分离临近脊柱的左侧L-5和L-6脊神经，用6.0缝合线在背根神经节远侧连接。在10-14天的手术恢复期后，引入脊髓导管。在第二次手术完五天后，用连接到通过头状骨骨孔插入的脊髓导管而由泵驱动的显微注射器进行鞘内注射。在测试以前，大鼠放置在干净的塑料-金属网笼内，让其适应。
为了测定爪回收的50％机械阈，用一根yon Frey毛去触后足而不碰到足掌。用足以引起毛轻弯的力，把经过校正而折弯力逐渐增加的每一根yon Frey毛竖直压到足上，维持六到八秒。快速收足计为一个阳性反应。每点收集六个数据，并记录每个时间点的最大和最小刺激强度。得到的反应样式制成表格，计算50％反应阈。图中给出了反应对标出的单次鞘内块状注射多肽量的关系。X轴显示的是注射后测定压力对足掌的高敏感性的时间点。
所有的手术处理的大鼠在注射prosaposin活性片段前都表现出触觉倒错。在图一中，在无多肽的0时，测到的阈值少于3.0-4.0g。鞘内注射0.7μg或0.07μg的prosaposin延伸的22聚多肽(SEQ IDNO:1)，抑制了感觉倒错，并表现出剂量依赖关系。大鼠在收足以前耐受的压力增加，这种压力阈值的增加证明了感觉倒错的抑制。
在注射15分钟以后，观察到了有意义的结果。注射后120分观察到最大有效结果。注射了最大量prosaposin衍生的22聚多肽(SEQID NO:1)的大鼠，在测定的最后一个时间点(180分钟)仍然表现出有意义的感觉倒错减弱。注射0.007μgprosaposin衍生的22聚多肽(SEQ ID NO:1)的大鼠，就表现出明显的感觉倒错减弱。在任何浓度都未观察到比如镇静等副作用。
prosaposin衍生的14聚多肽(SEQ ID NO:2，见表一)减轻Chung氏模型大鼠感觉倒错的活性也得到了测量。如表二所示，prosaposin活性片段(SEQ ID NO:2)是可以有效减轻感觉倒错的。prosaposin衍生的14聚多肽(SEQ ID NO:2)的最佳效果出现在注射后15-30分钟，在60分钟内恢复到注射前的水平(图二)。对于prosaposin衍生的14聚多肽，在任何浓度都未观察到副作用。
突变的22聚多肽(SEQ ID NO:8)与prosaposin衍生的22聚多肽(SEQ ID NO:1)的不同在于其含有一个替代天冬酰胺的天冬氨酸(见表4)。它减轻Chung氏模型大鼠感觉倒错的活性也得到了测量。注射17.5μg突变的22聚多肽(SEQ ID NO:8)后，没有观察到Chung氏模型大鼠感觉倒错反应的改变。
虽然没有经历根据Chung氏模型的手术带来的疼痛，正常的大鼠也注射了prosaposin衍生多肽(SEQ ID NO:1)，根据Bennett和Xie，见上，1988发展的程序来测定它们对热刺激的反应。为了简单，从热源回收受影响足以前的时间命名为热板反应潜伏期，并把它做为对热刺激引起的疼痛耐受的指标。
鞘内导管放入正常雄性Sprague-Dawley大鼠。手术完五天后，给大鼠鞘内注射prosaposin活性片段(SEQ ID NO:1)。检查大鼠在热板(52.5℃)上的反应。测定注射前和注射后不同时间到180分钟的热板反应潜伏期。没有发现明显的热板反应潜伏期延长。这样，prosaposin衍生多肽(SEQ ID NO:1)不影响正常动物的痛觉。
实施例二中枢神经系统对prosaposin衍生多肽的摄取本实施例描述的结果，标明了通过血脑屏障的prosaposin衍生多肽。
在APPlied Biosystem Model 430多肽合成仅上，合成含有saposinC氨基酸12-29并含有一个替代12位缬氨酸残基的酪氨酸残基的18聚多肽1(SEQ ID NO:20)。然后用乳过氧化物酶方法对多肽进行放射性碘标。20×106cpm的放射性标记的多肽注射入大鼠的耳廓。在一小时和24小时分别处死动物，用等张的盐水进行心脏灌流，以去除脑中的血液。为了测定多肽摄取的百分比，在gamma计数仅上对脑进行计数。另外，将脑匀浆，并在葡聚糖离心后分成毛细血管丰富部分(团块)和实质部分(上清)(Triguero等，J.Neurochem.,54:1882-1888(1990))。这个方法可以区分血管中和脑实质中的的放射性标记的多肽。24小时后，在全脑检测到注射蛋白(SEQ ID NO:20)的0.017％。其中，75％在脑实质，而25％在毛细血管部分。一小时后，注射剂量的0.03％出现在全脑。
prosaposin衍生多肽SEQ ID NO:2也被用如下的方法分析了其穿越血脑屏障的能力。雌性Sprague-Dawley大鼠用甲氧氟烷麻醉，静脉注射大约20μg的多肽SEQ ID NO:2(3.2×108cpm)。40分钟后，大鼠用乙醚麻醉处死，用大约250mlPBS进行心脏灌流。计算了脑、肝脏和血中多肽的总量占总注射量的百分比，结果如表6所述。为了测定多肽在脑的定位，采用了Triguero,J.Neurochem.,54:1882(1990)的毛细血管去除法，将脑组织分成脑实质部分和脑毛细血管部分。区分组分的结果显示存在于脑中的SEQ ID NO:2的87％在脑实质，而13％在脑毛细血管。
在类似的实验中，大鼠在SEQ ID NO:2处理后三小时后处死，0.06％的多肽出现在脑，大约85％在实质。这些结果显示，至少某些prosaposin衍生多肽SEQ ID NO:2可以通过血脑屏障，浓集在脑实质而不是血管内皮(血管)。通过血脑屏障的百分比在Bank等，见上，1992罗列的可以通过血脑屏障的多肽中属于中等。
为了测定完整的多肽在脑、肝、血中的百分比，用高压液相色谱测定了分离自组织的放射标记材料(SEQ ID NO:2)。为了校正组织匀浆过程中的降解作用，在组织匀浆中加入了SEQ ID NO:2。观察到的添加多肽的降解程度，用来校正的组织加工过程中的降解作用。校正后的结果如下SEQ ID NO:2在脑中大约60％是完整的，肝中大约80％是完整的，在血中大约40％是完整的。在二次实验中，在脑中的多肽SEQ ID NO:2大约有68％是完整的。这些结果提示多肽SEQ ID NO:2可以通过血脑屏障，而且在脑中大部分是完整的。
实施例三缓解糖尿病大鼠的神经病理性疼痛这个实验描述了在糖尿病性神经病模型大鼠的腹膜内给予序列号为SEQ ID NO:2的多肽后的效果。
如Calcutt等，Pain 68:293-299所述，单次腹膜内注射streptozotocin(50mg/kg体重，新鲜配置于0.9％灭菌盐水中)，去除胰腺β细胞，诱导胰岛素缺陷，制得糖尿病大鼠。两天后，通过测定注射streptozotocin的大鼠血中糖的浓度，确证糖尿病。根据普遍接受的研究大鼠糖尿病时采用的非禁食高血糖的定义，在以后的实验中，去除注射streptozotocin而血中糖的浓度低于15mmol/l的大鼠。
以大鼠对有害的化学品伏尔马林的行为反应为指标，研究在8周时的糖尿病大鼠和对照大鼠的感觉倒错(Calcutt，见上，1996)。简单来说，在大鼠右后足的背面皮下注射新鲜配置伏尔马林(溶于灭菌盐水的0.5％溶液50μl)。在对照大鼠中，这个浓度的伏尔马林诱导次最强的行为反应，这使在Q期和2期检测糖尿病大鼠的痛觉过敏成为可能(Calcutt等，Eur.J.Pharmacol.285:189-197(1995)。动物转移到特制的观察室内，以利持续观察足爪。在随后的60分钟内，每隔5分钟，由不清楚动物处理组的观察者记录一次1分钟内收足的次数。如糖尿病大鼠研究中以前命名的一样，收足的最初计数称为1期(注射后1-2和5-6分钟)；10-11、15-16、20-21分钟的计数称为Q(静止)期；随后的计数称为2期(例如可见，Malmberg等，Neurosci,Lett.161:45-48(1993))。把每期内各测量点的收足次数相加，比较了大鼠各期的活动。与以前报道类似，糖尿病大鼠的收足反应不正常。
多肽SEQ ID NO:2由化学合成得到纯品，溶解在灭菌的PBS中，缓冲液PH为中性。糖尿病大鼠分成两组，每组四只，分别给以盐水或多肽SEQ ID NO:2。在用0.5％伏尔马林处理前两个小时，给糖尿病大鼠腹膜内注射盐水或200μg/kg的多肽SEQ ID NO:2。如图三所示，给以多肽SEQ ID NO:2完全防止了糖尿病大鼠在1期的不正常的收足反应，而2期的反应减轻了70％。如此看来，腹膜给以多肽SEQ ID NO:2可以缓解糖尿病行神经病大鼠模型中伏尔马林注射产生的疼痛。
实施例四体外刺激神经轴突赘生本实施例描述了序列为SEQ ID NO:2的多肽在体外刺激神经轴突方面的用途。
在含10％胎牛血清的DMEM中培养NS20Y神经瘤细胞。细胞用胰酶消化下来后，铺入30mm的petri平皿中的玻璃盖玻片上。20-24小时后，培养液用2ml含0.5％胎牛血清及0、0.5、1、2、4、8ng/ml序列为SEQ ID NO:2的多肽或者一种序列打乱的蛋白的DMEM替换。细胞继续培养24小时，然后用PBS洗涤，用Bouin氏溶液(水饱和苦味酸/伏尔马林/乙酸15∶5∶1)固定30分钟。固定液用PBS洗掉后，在相差显微镜下，计数神经轴突赘生。含有一个或多个长度相当于或长于细胞直径的明显可以称为轴突的细胞，计为阳性的轴突赘生。在每个平皿的不同位置最少计数200个细胞，重复测定给以每个待测多肽时有轴突细胞的百分比。
与有相同的氨基酸组成而顺序不同的序列打乱的蛋白相比，SEQ IDNO:2显示的多肽在NS20Y细胞中明显可以增加神经轴突赘生。用少至0.5 ng/ml的多肽就可以明显增加神经轴突赘生。
实施例五在体外抑制神经细胞死亡本实施例描述了序列为SEQ ID NO:2的多肽在抑制神经细胞死亡方面的用途。
NS20Y细胞如实施例四所述接种，用0.5％的胎牛血清在玻璃盖玻片上培养2天，其中含或不含8ng/ml序列为SEQ ID NO:2的多肽或序列打乱的多肽。然后移走培养液，每孔加入含胎盘蓝的PBS。死细胞被胎盘蓝染成蓝色，在倒置显微镜下计为一个总数的百分点，在每孔的4个位置计数400个细胞。重复测定的平均误差是±5％。序列为SEQ ID NO:2的多肽明显可以减少苔盼蓝阳性(死)细胞的数目。这提示序列为SEQ ID NO:2的多肽可以抑制程序性死亡。
实施例六体外髓鞘形成分析本实施例描述了序列为SEQ ID NO:2的多肽在刺激轴突赘生和促进髓鞘形成方面的用途。
根据Satomi,Zool.Sci.9:127-137(1992)制得新生小鼠小脑外植片(enplant)。在22天的培养期，也就是新生小鼠小脑进行正常神经分化的时间内，观察神经轴突赘生和髓鞘形成。在外植片制备的第二天，序列为SEQ ID NO:2的多肽以10μg/ml的浓度添加到三个外植片上，序列打乱的多肽也以10μg/ml的浓度添加到三个外植片上。在带照相机的亮视野显微镜下，分析三个对照和三个处理的外植片上，神经轴突的赘生和髓鞘形成。在第八天，与对照相比，含多肽的外植片更薄更铺展。在第15天，用多肽SEQ ID NO:2处理的培养物在边缘有许多有长突出的细胞。在对照培养物中，这样的突出却没有或不明显。用多肽SEQ ID NO:2处理的培养物中在皮层下白质中，有髓鞘的轴突明显比对照更多。这样，本发明多肽在体外可以诱导分化的小脑中髓鞘形成。
实施例七脱髓鞘的抑制减少Schwan细胞的死亡，和抑制脱髓鞘相应。Schwan细胞包括了广泛的髓鞘。将SEQ ID NO:2的多肽添加到Schwan细胞培养液中，可以以剂量依赖的方式减少Schwan细胞的死亡，在添加序列打乱的蛋白的对照组没有发现这种现象。如此来说，本发明序列为SEQ ID NO:2的多肽可以抑制脱髓鞘。
实施例八治疗创伤性缺血性中枢神经系统损伤让脊髓有创伤性损伤的人，接受脑脊髓内注射或直接在损伤部位注射大约100μg/ml的序列为SEQ ID NO:2溶解在盐水中的或者在可以缓慢持续释放的储存形式的多肽。运动神经功能的获得比如肢体运动的增加做为改善的指标。治疗可以重复，直到不能再改善状况。
实施例九治疗脱髓鞘疾病直接将序列为SEQ ID NO:2的多肽，按实施例八中同样剂量静脉内注射进诊断为早期MS的受试者的脑脊液中。每日或每周重复此剂量，可观察到肌肉力量、肌肉骨胳协调性以及髓鞘形成(用MRI测定)方面的改善。
实施例十治疗感常神经病小鼠给以taxol来诱导感觉神经病。taxol处理的小鼠给以100μg/kg,200μg/kg或1mg/kgprosaposin衍生多肽。用Hargreaves感觉测试仅测定的热觉减弱，做为感觉性神经病的指标。给予的三个剂量的多肽SEQ ID NO:2都可以有效抑制taxol处理的小鼠中热觉的减弱。对prosaposin衍生的22聚多肽SEQ ID NO:1也进行了同样的分析，发现可以有效抑制taxol处理的小鼠中热觉的减弱。这些结果表明，prosaposin衍生多肽比如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2可以用来有效抑制感觉性神经病。
虽然用以上的实施例对本发明进行了描述，但可以理解，可以对本发明进行不离开本发明的主要思想的改良。相应地，本发明不局限于以下权利要求。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请者The Regents of the University of California(ⅱ)发明题目利用prosaposin衍生多肽缓解神经性疼痛的方法(ⅲ)序列数目21(ⅳ)通讯地址(A)收件人Campbell and Flores(B)街道4370 La Jolla Village Drive,Suite 700(C)城市San Diego(D)州California(E)国家USA(F)邮政编码92122(V)计算机可读类型(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.25(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)填表日期05-MAR-1997(C)分类(ⅷ)代理人/委托人信息(A)姓名Campbell,Cathryn A.(B)登记号31,815(C)文献/摘要号FP-UD 2474(ⅰⅹ)通讯信息(A)电话(619)535-9001(B)传真(619)535-8949(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:1:Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys1 5 10 15Thr Glu Lys Glu Ile Leu20(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅸ)特征(A)名字/关键词多肽(B)位置2(D)其它信息/注意=“Xaa 是D-丙氨酸”(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:2:Thr Xaa Leu Ile Asp Asn Asn Ala Thr Glu Glu Ile Leu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:3:Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:4:Cys Gln Phe Val Met Asn Lys Phe Ser Glu Leu Ile Val Asn Asn Ala1 5 10 15Thr Glu Glu Leu Leu Tyr20(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:5:Cys Gln Leu Val Asn Arg Lys Leu Ser Glu Leu Ile Ile Asn Asn Ala1 5 10 15Thr Glu Glu Leu Leu20(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:6:Cys Glu Tyr Val Val Lys Lys Val Met Leu Leu Ile Asp Asn Asn Arg1 5 10 15Thr Glu Glu Lys Ile Ile20(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:7:Cys Glu Phe Val Val Lys Glu Val Ala Lys Leu Ile Asp Asn Asn Arg1 5 10 15Thr Glu Glu Glu Ile Leu20(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:8:Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asp Asn Lys1 5 10 15Thr Glu Lys Glu Ile Leu20(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:9:Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asp Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:10:Thr Lys Ser Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:11:Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Val1 5 10 15Asp Gly Val Pro20(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:12:Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:13:Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu1 5 10 15Thr(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:14:Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:15:Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Thr Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:16:Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys1 5 10 15Val(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:17:Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu Lys Leu Cys1 5 10 15Ala Pro(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:18:Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:19:Arg Pro Asn lle Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln1 5 10 15Leu Leu(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:20:Tyr Lys Glu Val Thr Lys Leu lle Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu1 5 10 15Ile Leu(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特征(A)长度66碱基对
(B)类型核酸(C)链类型双链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:21:TGTGAATTCC TGGTGAAGGA GGTGACCAAG CTGATTGACA ACAACAAGAC TGAGAAAGAA60ATACTC6权利要求
1．具有从14个到大约50个氨基酸，含有SEQ ID NO:2中的序列的prosaposin衍生多肽。
2．权利要求1中的多肽，此处所说的多肽具有SEQ ID NO:2中的序列。
3．在药剂学上可以接受的载体中的、用于治疗神经组织中神经性疾病或脱髓鞘疾病的权利要求1或权利要求2中多肽的药剂组合物。
4．权利要求3中组合物的控释制剂。
5．脂质体形式的权利要求3的组合物。
6．冻干形式的权利要求3的组合物。
7．单位剂量形式的权利要求3的组合物。
8．包括给受试者以有效剂量的prosaposin活性片段来缓解受试者神经病理性疼痛的方法。
9．权利要求8的方法，其中所说的活性片段选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
10．权利要求8的方法，其中所说的神经病理性疼痛是外周神经疾病的结果。
11．权利要求10的方法，其中所说的外周神经疾病选自神经瘤；神经压迫；神经挤碎、神经牵拉或不完全神经横断；单神经病和多神经病。
12．权利要求8的方法，其中所说的神经病理性疼痛是选自背根神经节、脊髓、脑干、丘脑和皮层疾病的结果。
13．权利要求8的方法，其中所说的给药方式包括静脉内、肌肉内、皮内、皮下、颅内、脑脊内、局部、口腔、经皮、经粘膜、鼻内给药。
14．包括给受试者以有效剂量的一种prosaposin活性片段的预防受试者神经病理性疼痛的方法。
15．权利要求14的方法，其中所说的活性片段具有选自SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
16．缓解受试者神经病理性疼痛的方法，包括给予此受试者有效剂量的多达大约50个氨基酸，包括以下序列所含有的神经营养活性区的多肽SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19。
17．多达大约50个氨基酸，包括以下序列所含有的神经营养活性区的多肽SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19在治疗神经病理性疼痛方面的用途。
18．包括用含有有效刺激或抑制剂量的具有14到50个氨基酸而且含有SEQ ID NO:2中的序列的多肽的组合物接触神经细胞来刺激神经轴突赘生、抑制神经细胞死亡、促进髓鞘形成或抑制脱髓鞘的方法。
19．权利要求18的方法，此处所说的组合物包括序列为SEQ ID NO:2的多肽。
20．权利要求18的方法，此处所说的神经细胞在体外接触组合物。
21．权利要求18的方法，此处所说的神经细胞在体内接触组合物。
22．权利要求1或权利要求2的多肽在治疗神经组织的神经疾病或脱髓鞘疾病中的用途。
23．一种抑制感觉或运动性神经病的方法，包括用含有有效抑制剂量的prosaposin活性片段的组合物接触神经细胞的步骤。
24．权利要求23的方法，此处所说的活性片段是有14到50个氨基酸，具有SEQ ID NO:2中序列的多肽。
25．权利要求24的方法，此处所说的活性片段是序列为SEQ ID NO:2的多肽。
26．权利要求23的方法，此处的所说的神经细胞在体外接触组合物。
27．权利要求23的方法，此处的所说的神经细胞在体内接触组合物。
全文摘要
本发明提供了一种使用有效剂量prosaposin活性片段来缓解或预防受试者神经病理性疼痛的方法。本发明也提供了prosaposin衍生多肽片段以及这些片段在刺激神经轴突赘生(outgrowth),抑制神经细胞死亡,促进髓鞘形成和抑制脱髓鞘方面用途。另外,本发明还提供了一种使用含有有效剂量prosaposin活性片段的组合物接触神经细胞来抑制感觉性或运运性神经病变的方法。
文档编号A61K38/10GK1224430SQ97194378
公开日1999年7月28日 申请日期1997年3月5日 优先权日1997年3月5日
发明者J·S·奥布里恩 申请人:加州大学评议会