专利名称：小干扰rna及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗神经性疼痛药物的制备技术，尤其涉及一种小干扰RNA及筛选方 法及制备治疗神经性疼痛药物的应用。
背景技术：
N型电压依赖性钙通道(VDCCs)在疼痛的传递与调控中具有重要作用。它们密集分布于 脊髓背角伤害感受性神经元突触前末梢，参与主要疼痛介质如谷氨酸和P物质等释放的调 节。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA (dsRNA)介导细 胞内的mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失，属于转 录后的基因沉默机制。近年，随着对RNA干扰现象机制的深入研究，RNAi已经成为一种功能 基因组研究的有效工具。
在N型VDCCs的Cav2.2 mRNA中存在两种外显因子， 一种是e37a;另一种是e37b。 e37a 和e37b为人、大鼠、小鼠共有的保守基因序列，均为97个核苷酸。其中，外显子e37a特异 地表达于背根节神经元，而不表达于脊髓、延髓、中脑、小脑、丘脑、海马及大脑皮层； 另一种外显子e37b在上述所有组织中均表达。
现有技术中，由于e37a与e37b两个外显子的序列之间具有同源性，仅存在微小差距， 此两个外显子编码的氨基酸仅相差14个，因此，临床应用的N型VDCCs阻断剂，如"一Ctx 等，在治疗疼痛时，对e37a和e37b均能产生沉默效应。
上述现有技术至少存在以下缺点
副作用较大，如容易抑制交感神经紧张性，引起体位性低血压、心率减慢等；抑制中 枢突触传递(包括兴奋性和抑制性突触传递)，引起共济失调、眩晕、幻觉、精神错乱、恶 心、呕吐、眼球震颤等症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种副作用较小的小干扰RNA及筛选方法及制备治疗神经性疼痛 药物的应用。
4本发明的目的是通过以下技术方案实现的
本发明的小干扰RNA，该小干扰RNA的序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。 本发明的上述的小干扰RNA的筛选方法，包括步骤
A、 对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37a基因序列设计EGFP-e37a引物，并通过该引物构 建EGFP-e37a融合基因；
所述EGFP-e37a引物包括
L 5' GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3';
Rl 5， AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AAT GAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3';
R2 5' AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AAC GGG TGG CG 3，；
所述EGFP-e37a融合基因包括
5， GAATTC—EGFP报道基因一Cav2.2 e37a基因一AGATCT 3，；
B、 设计多对小干扰RNA，分别用所述多对小干扰RNA与所述EGFP-e37a融合基因进行 RNA干扰试验；
C、 检测所述RNA干扰试验效果，选择使所述EGFP-e37a融合基因受到干扰的程度符合 设计要求的小干扰RNA。
本发明的上述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，该小干扰脂A用于制备治 疗神经性疼痛的药物。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的小干扰RNA及筛选方法及制备 治疗神经性疼痛药物的应用，由于首先对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37a基因序列设计 EGFP-e37a引物，并通过PCR、酶切的方法构建EGFP-e37a融合基因，然后通过干扰试验筛选 出序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干扰RNA，该小干扰RNA仅对外显子e37a产生沉默效 应，用该小干扰RNA制备的治疗神经性疼痛的药物，副作用小。
具体实施例方式
本发明的小干扰RNA (siRNA)，其较佳的具体实施方式
是，该siRNA的序列为 CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC 。
本发明的上述的小干扰RNA的筛选方法，其较佳的具体实施方式
是，包括步骤 步骤A、首先，对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37a基因序列设计EGFP-e37a引物，并通 过该引物构建EGFP-e37a融合基因；所述EGFP-e37a引物包括
L 5， GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3，；
Rl 5' AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AAT GAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3';
R2 5' AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AAC GGG TGG CG 3，；
所述EGFP-e37a融合基因包括
5， GAATTC — EGFP报道基因一Cav2. 2 e37a基因—AGATCT 3，；
步骤B、然后，设计多对siRNA，分别用多对siRNA与EGFP-e37a融合基因进行RNA干扰 (RNAi)试验；
步骤C、检测RNA干扰试验效果，选择使EGFP-e37a融合基因受到干扰的程度符合设计 要求的小干扰RNA。设计要求可以为，小干扰RNA对所述EGFP-e37a融合基因的干扰效率大于 或等于70%，也可以选用其它的设计要求。
在上述的RNA干扰试验，还可以对比小干扰RNA对Cav2.2 e37b基因的干扰效果，具体 包括步骤
步骤D、对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37b基因序列设计EGFP-e37b引物，并通过该引 物构建EGFP-e37b融合基因； 所述EGFP-e37b引物包括
L 5， GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3，；
Rl 5' AAC CCA GAG GTG GGG ACA TGT GTT TCA GCA TCT CAA ACA TGT CAT TGT AAC TGA TGC GCC CAC TTG TAC AGC TCG TC 3，；
R2 5， AGA TCT TTA GTT GTA TGC AAC TCG AGC CGG GCA TTT CTT CCC CAA ACC CAG AGG TGG GG 3'。
所述EGFP-e37b融合基因包括
5， GAATTC—EGFP报道基因—Cav2.2 e37b基因一AGATCT3，。
步骤E、用上述步骤C中选择的小干扰RNA与EGFP-e37b融合基因进行RNA干扰试验；
步骤F、检测RNA干扰试验效果，选择对EGFP-e37b融合基因无干扰的小干扰RNA。
上述的RNA干扰试验可以采用以下两种方法
一种是首先，将融合基因和小干扰RNA分别放入表达载体质粒中进行表达；然后， 用小干扰RNA的表达载体质粒与融合基因的表达载体质粒进行共转染，进行RNA干扰试验； 另一种是首先，用脂质体转染的方法将融合基因表达载体转染到BHK细胞，并挑选
6有绿色荧光的细胞建立单克隆细胞株；然后，用小千扰RNA，以单克隆细胞株为靶细胞进行 RNA干扰试验。
上述的融合基因可以通过PCR和酶切的方法构建，构建完成后，还可以通过PCR方法、 酶切方法、测序方法等一种或多种方法鉴定所构建的融合基因序列是否正确。
本发明的上述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，其较佳的具体实施方式
是，该siRNA用于制备治疗神经性疼痛的药物。这里的神经性疼痛可以是神经性头痛、三叉 神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛等一种或多种，还可以是其它的神经性 疼痛。
具体实施例，包括
步骤l、对照EGFP和Cav2.2 e37a/37b的基因序列设计引物，通过PCR和酶切的方法构 建了EGFP-37a/37b融合基因，通过PCR、酶切、测序等方法鉴定序列为正确。
步骤2、按照siRNA的设计原则(如遵循Tuschl规则等)设计四对siRNA，分别编码为I 号、II号、III号、IV号
siRNA I : AAGGATATGTACAGTTTGTTG; s i RNAII: CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC; siRNAIII: AAGAACTGCCCTCGTAGGTTG; siRNAlV: AACTGCCCTCGTAGGTTGGCC。 步骤3、将这四对si脂A分别与EGFP-37a/37b融合基因进行RNAi试验。
步骤4、用荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测RNAi效果在荧光显微镜下可见 siRNAII使细胞的荧光效率明显受到抑制，流式细胞术可见siRNAII的RNAi效率在48小时达 到了80%以上，其余三条siRNA抑制作用不明显。并且，siRNAII仅对EGFP-37a产生特异性的 沉默效应；
步骤5、将得到的有效且特异性干扰外显子e37a mRNA的表达水平的siRNA序列，用 western blot的方法检测融合基因的蛋白表达情况，结果可见对应蛋白条带明显减弱。
步骤6、以Cav2.2的全基因表达质粒在293FT细胞系中进行表达，并共转染siRNAII表 达质粒，用Western blot的方法检测蛋白表达情况，得到与步骤5—致的结果，从而验证了 si腦AII的有效性和特异性。
本发明通过构建EGFP报道基因和37a/37b的融合基因，遵循Tuschl规则设计siRNA,利 用荧光显微镜和流式细胞仪的方法检测出起作用的siRNA序列，并用western blot的方法验 证，即对融合基因和全基因的蛋白表达情况进行检测，得到有效且特异性干扰外显子e37amRNA的表达水平的s i RNA序列。
该siRNA序列可以对疼痛耙点N型钙通道a l亚基进行干扰，并特异性干扰外显子e37a mRNA的表达水平，不仅是对e37a能产生沉默效应，而且对e37b不起作用，即对e37a有特异 性沉默效应。
在人、鼠的背根节神经元中，外显子e37a的表达水平为外显子e37b的1/10 ， e37a具 有不同于e37b的生物物理特性，激活电压低且钙电流密度大，因此虽然表达较低但具有更 高的生物学效能，这为疼痛治疗提供了一个非常有意义的新靶标。本发明针对该靶标筛选 的siRNA，可以为神经性疼痛治疗提供新的可行性方法和药物。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任 何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都 应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种小干扰RNA，其特征在于，该小干扰RNA的序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。
2、 一种权利要求1所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，包括步骤A、 对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37a基因序列设计EGFP-e37a引物，并通过该引物构 建EGFP-e37a融合基因；所述EGFP-e37a引物包括L 5， GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3';Rl 5' AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AAT GAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3，；R2 5' AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AAC GGG TGG CG 3，；所述EGFP-e37a融合基因包括5， GAATTC — EGFP报道基因一Cav2. 2 e37a基因一AGATCT 3，；B、 设计多对小干扰RNA，分别用所述多对小干扰RNA与所述EGFP-e37a融合基因进行 RNA干扰试验；C、 检测所述RNA干扰试验效果，选择使所述EGFP-e37a融合基因受到干扰的程度符合 设计要求的小干扰RNA。
3、 根据权利要求2所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，所述RNA干扰试验的设 计要求为所述小干扰RNA对所述EGFP-e37a融合基因的干扰效率大于或等于70X。
4、 根据权利要求2所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，还包括步骤D、 对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37b基因序列设计EGFP-37b引物，并通过该引物构建 EGFP-e37b融合基因；所述EGFP-e37b引物包括L 5' GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3';Rl 5， AAC CCA GAG GTG GGG ACA TGT GTT TCA GCA TCT CAA ACA TGT CAT TGT AAC TGA TGC GCC CAC TTG TAC AGC TCG TC 3，；R2 5' AGA TCT TTA GTT GTA TGC AAC TCG AGC CGG GCA TTT CTT CCC CAA ACC CAG AGG TGG GG 3';所述EGFP-e37b融合基因包括5， GAATTC—EGFP报道基因一Cav2.2 e37b基因一AGATCT3，；E、 用所述步骤C中选择的小干扰RNA与所述EGFP-e37b融合基因进行RNA干扰试验；F、检测所述步骤E中RNA干扰试验效果，选择对所述EGFP-e37b融合基因无干扰的小干 扰RNA。
5、 根据权利要求2或4所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，所述RNA干扰试验 包括首先，将所述融合基因和所述小干扰RNA分别放入表达载体质粒中进行表达； 然后，用所述小干扰RNA的表达载体质粒与所述融合基因的表达载体质粒进行共转 染，进行所述RNA干扰试验。
6、 根据权利要求2或4所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，所述RNA干扰试验 包括首先，用脂质体转染的方法将所述融合基因表达载体转染到BHK细胞，并挑选有绿色 荧光的细胞建立单克隆细胞株；然后，用所述小干扰RNA，以所述单克隆细胞株为靶细胞进行所述RNA干扰试验。
7、 根据权利要求2或4所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，所述融合基因通过 PCR和酶切的方法构建，构建完成后，还通过以下至少一种方法鉴定所述融合基因序列是否 正确PCR方法、酶切方法、测序方法。
8、 根据权利要求2所述的小干扰RNA的筛选方法，其特征在于，所述多对小干扰RNA遵 循Tuschl规则设计，所述多对小干扰RNA包括以下4对小干扰RNA:siRNA I : AAGGATATGTACAGTTTGTTG; s i RNAII: CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC; si画II: AAGAACTGCCCTCGTAGGTTG; siRNAIV: AACTGCCCTCGTAGGTTGGCC。
9、 一种权利要求1所述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，其特征在于， 该小干扰RNA用于制备治疗神经性疼痛的药物。
10、 根据权利要求9所述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，其特征在于， 所述神经性疼痛包括以下一种或多种神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经 痛、癌痛、幻肢痛。
全文摘要
本发明公开了一种小干扰RNA及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用，首先对照EGFP和Cav2.2 e37a/37b的基因序列设计引物，通过PCR的方法构建EGFP-e37a/37b融合基因，然后通过干扰试验筛选出序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干扰RNA，该小干扰RNA可以对疼痛靶点N型钙通道α1亚基进行干扰，并特异性干扰外显子e37a mRNA的表达水平，仅是对e37a能产生沉默效应，对e37b不起作用。用该小干扰RNA制备的治疗神经性疼痛药物，副作用小。可以用于制备治疗神经性疼痛(例如神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛等)方面的药物。
文档编号C12N15/11GK101555476SQ20081022575
公开日2009年10月14日 申请日期2008年11月11日 优先权日2008年11月11日
发明者冯泽国, 吴小兵, 砡 张, 李冠华, 维 王, 娜 陈 申请人:冯泽国;吴小兵;陈 娜