一种皮肤干细胞活性成分及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种皮肤干细胞活性成分，以及该皮肤干细 胞活性成分的获取方法。本发明所获取的皮肤干细胞活性成分可应用于治疗脱发。
【背景技术】
[0002] 脱发是指头发病理性脱落而致头发稀疏或形成脱发斑块，严重的可致毛发全部脱 落，发病原因不清楚，是皮肤科的常见病，多发病。在西方，30岁男性发病率约为30%，40岁 时为40%，50岁时为50%，而70岁的白人至少80%患有脱发。在中国，脱发患病率约30. 29%， 其中25岁至55岁男性中25%有雄激素源性脱发。随着社会压力的增加，脱发向低龄化发 展，且患病人群逐年上升。脱发虽然不会危及人的生命，但却明显影响美观，给患者带来很 大的精神压力和心理负担，尤其对于生长期的儿童。
[0003] 近30年来，美国药监局仅批准了米诺地尔和非那雄胺两种治疗脱发的药物，且自 批准后一直为一线药物，对大多数患者有较好的生发效果。但是，两种药物在长期的应用 中，逐渐暴露出了一些不足之处，如对少部分患者无效、起效缓慢、停药后易复发等。更让患 者困扰的则是两种药物的副作用。米诺地尔有高发皮肤过敏现象，严重的会造成心跳加快， 血压升高等副作用，也有报道与使用因果关系尚不明确的非特异性过敏反应如风团、过敏 性鼻炎、面部肿胀、过敏气短、头痛、神经炎等不良反应。非那雄胺治疗雄激素性脱发，仅适 用于男性患者，长期服用常见性功能障碍（阳萎、性欲减退、射精障碍）、乳房不适（乳腺增 大、乳腺疼痛）和皮瘆，尚有其它包括骚痒感、风瘆及面唇部肿胀等过敏反应和睾丸疼痛等 不良反应。部分患者在药物治疗效果不满意的情况下，采用了费用昂贵的毛囊移植手术，但 是对于本身头发稀少的患者，毛囊移植手术难以实施，易出现感染、表皮囊肿等并发症，且 外观往往不自然。
[0004] 干细胞（Stem Cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群 体，是形成人体各种组织、器官的"祖宗细胞"、"万能细胞"。干细胞可以产生和分泌大量 的生物活性因子，这些干细胞生物活性因子可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细 胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老细胞。例如，干细胞可以产生干细胞生长 因子（SCF)、神经生长因子（NGF)、基质细胞源性生长因子（SDF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、表皮生长因子（EGF)、 白介素-6与白介素-7 (IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子（M-CSF)、肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素（IFN)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细 胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界 因素对机体细胞造成的损伤。
[0005] 利用干细胞分泌产生的生物活性因子激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理 性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，从而治疗脱发的问题，在疾病防治与保健美容 领域具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种皮肤干细胞活性成分，以及该皮肤干细胞活性成分的获 取方法。
[0007] -种皮肤干细胞活性成分，所述活性成分由皮肤干细胞分泌，存在于培养皮肤干 细胞所产生的上清中，以Dlkl+/Scar形式表达，通过下述方法获取：按照皮肤组织与酶液 的体积比为1:3,将剪碎的皮肤组织加入溶解在含有双抗的DMEM中的浓度1. Omg/ml的胶原 酶III酶液中放置2h，以200目过滤网过滤细胞，收集滤液，用等量的含10wt%FBS的DMEM 中和酶的活性；剩余组织块以〇. 25wt%胰酶/EDTA在37°C消化，用200目过滤网过滤细胞， 收集滤液；合并两次滤液，分别应用磁珠标记的Dlk抗体和Seal抗体，以磁珠筛选法筛选出 Dlkl +/Scar皮肤干细胞。
[0008] 其中，所述剪碎的皮肤组织是以PBS清洗后，剪成lmmXlmmXlmm大小的皮肤组 织。
[0009] 用流式细胞仪技术鉴定筛选后Dlkl+/Scar皮肤干细胞的纯度，结果显示，提取的 Dlkl +/Scar皮肤干细胞纯度可以达到92. 0%。
[0010] 本发明同时也提供了上述获得的皮肤干细胞活性成分的培养方法，包括： 1) 、将分选出的皮肤干细胞接种于培养瓶中，加入5ml皮肤干细胞无血清专用培养基， 在湿度彡95%，温度37°C，0)2体积浓度5%环境下培养，隔2天换液； 2) 、待细胞80%融合后，以0. 25wt%胰酶和0. 02wt%EDTA消化传代，将传代产生的细胞 移入新的培养瓶中； 3) 、重复以上培养、扩增过程，培养过程中可根据需要调整最佳的细胞数量。
[0011] 其中，所述的皮肤干细胞无血清专用培养基为含有50ug/ml牛垂体提取物和5ng/ ml hEGF 的 DMEM，pH = 7. 0 ~7. 4。
[0012] 收集上述培养后的皮肤干细胞上清，1000r/min离心5min，弃去细胞沉淀，上清移 入50ml离心管中，9000r/min离心15min，弃去液体，用lml PBS液重悬离心管底沉淀物，即 皮肤干细胞上清中的皮肤干细胞活性成分，将收集到的含有皮肤干细胞活性成分的PBS移 入1.5ml EP管中，置于-20°C保存。
[0013] 本发明上述获得的皮肤干细胞活性成分可以作为一种药物的有效成分，应用于治 疗脱发的药物中，经试验取得了显著的作用。
[0014] 本发明通过体外培养、扩增，维持皮肤干细胞的高增殖能力和稳定性状，并在皮肤 干细胞拥有高增殖能力和稳定性状的时期里收集皮肤干细胞上清，低速离心弃去细胞，通 过低温分离、纯化等现代生物技术手段，获得了高纯度的皮肤干细胞活性成分。
[0015] 本发明的生物活性因子或物质可以开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用 于人体后可以活化机体干细胞，从而促进毛发的成长增殖。本发明在正常模型和病理模型 下的生发效果均好于市售药品米诺地尔或非那雄胺，说明本发明生发效果显著。安全性试 验表明，本发明未表现出皮肤刺激性和过敏性，具有较高的安全性。本发明采用再生医学技 术完成皮肤美容修复，具有操作方法简单、安全，患者易于接受，而且省时、疗效快、疗效显 著等优点，从而实现促进头发增殖，消除毛发稀疏人群困扰的目的。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明Dlkl+/Scar皮肤干细胞的流式细胞术结果图。
[0017] 图2是本发明Dlkl+/Scar皮肤干细胞的生长状况图。
【具体实施方式】
[0018] 以下通过具体实施例对本发明进行进一步的举例描述，但下述实施例并不构成对 本发明的任何限制