。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通 技术人员容易实现的任何改动或改变，都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0019] 实施例1 :皮肤干细胞的分离。
[0020] 1.将皮肤组织以PBS清洗干净，放入5ml Ep管中，用眼科剪剪成1mmX 1mmX 1mm 大小，加入3~4ml胶原酶III酶液中，此酶液中含有1. Omg/ml胶原酶III，并在含有双抗 的DMEM中溶解。将上述酶液与细胞的混合液放置2h。
[0021] 2.用200目过滤网过滤细胞到圆底聚苯乙烯管内，收集滤液，用等量的含10%FBS 的DMEM中和酶的活性。剩余组织块用0. 25%胰酶/0. 02%EDTA 37°C消化lOmin。用200目 过滤网过滤细胞到圆底聚苯乙烯管内，合并两次滤液，细胞计数。
[0022] 3.从上述细胞中，先应用磁珠标记的Dlk抗体（SIGMA公司），以磁珠筛选法筛选 出Dlkl+细胞。具体步骤为将收集到的细胞用计数板计数，将细胞数控制在10 7~108之间， 然后按照分选试剂盒说明书操作。
[0023] 4.从分选出的Dlkl+细胞中，应用磁珠标记的Seal抗体（SIGMA公司），以磁珠筛 选法筛选出Dlkl +/Scar细胞。具体步骤为将收集到的细胞用计数板计数，将细胞数控制在 107~10 8之间，然后按照分选试剂盒说明书操作。
[0024] 5.用流式细胞仪技术鉴定筛选后Dlkl+/Scar皮肤干细胞的纯度，结果显示，提取 的Dlkl+/Scar皮肤干细胞纯度可以达到92. 0% (图1)。
[0025] 实施例2 :皮肤干细胞的培养。
[0026] 1.将分选后的细胞接种于25mm培养瓶上，加皮肤干细胞无血清专用培养基，培养 基组成为DMEM，其中含有50ug/ml牛垂体提取物和5ng/ml hEGF，pH = 7. 0~7. 4。隔2天 换液，培养环境保持在湿度多95%，温度37°C，0)2体积浓度5%。
[0027] 2.待细胞80%融合后可传代，用0. 25%胰酶和0. 02%EDTA消化传代。
[0028] 3.多次重复此培养、扩增过程，获得大量表皮干细胞(细胞生长状况见图2)。
[0029] 实施例3 :皮肤干细胞活性物质的获取。
[0030] 1.收集皮肤干细胞上清，l〇〇〇r/min离心5min，弃去细胞沉淀。
[0031] 2.将收集到的上清移入50ml离心管中，使用低温高速离心机控制温度，离心收集 皮肤干细胞上清中的皮肤干细胞活性物质，离心速度9000r/min，离心时间15min。
[0032] 3.弃去离心后50ml离心管中的液体，用lml PBS液重悬离心管底部的沉淀物，将 含有皮肤干细胞活性物质的PBS移入1. 5ml EP管中，并在-20°C保存。
[0033] 应用例1 :本发明上述实施例得到的皮肤干细胞活性物质的药效性实验。
[0034] 1. 1本发明皮肤干细胞活性物质对脱毛C57BL/6小鼠的作用。
[0035] 雄性C57BL/6小鼠，6周龄，毛发处于休止期（皮肤呈粉红色）。适应饲养一周，背 部松香石蜡（1:1)脱毛，随机分为6组，每组10只。空白组，不给于任何受试物；辅料组，给 予70%乙醇，每次用量0. lml/只；皮肤干细胞活性物质低剂量组、皮肤干细胞活性物质中剂 量组、皮肤干细胞活性物质高剂量组，分别每次给药量0. 05mg/只、0. lmg/只和0. 2mg/只； 米诺地尔酊剂组，给予市售米诺地尔酊剂，每次给药量0. lml/只。
[0036] 各组小鼠每日早晚给药一次，取适量均匀涂抹于脱毛区域，连续用药至皮肤进入 休止期（观察终点）。记录每只小鼠由静止期进入生长期的转变时间和观察终点时间。于 观察终点时间，小鼠断颈处死，取背部相同部位面积2. 5cmX2. 5cm的新生毛发，称重。统计 分析各受试物小鼠转变时间、观察终点时间和毛重差异，结果见表1。
【主权项】
1. 一种皮肤干细胞活性成分，所述活性成分由皮肤干细胞分泌，存在于培养皮肤干细 胞所产生的上清中，以Dlkr/Scar形式表达，通过下述方法获取：按照皮肤组织与酶液的 体积比为1:3,将剪碎的皮肤组织加入溶解在含有双抗的DMEM中的浓度1.0 mg/ml的胶原 酶III酶液中放置2h，以200目过滤网过滤细胞，收集滤液，用等量的含10wt%FBS的DMEM 中和酶的活性；剩余组织块以〇. 25wt%胰酶/EDTA在37°C消化，用200目过滤网过滤细胞， 收集滤液；合并两次滤液，分别应用磁珠标记的Dlk抗体和Seal抗体，以磁珠筛选法筛选出 Dlkl+/SCar皮肤干细胞。
2. 根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分，其特征是其中所述剪碎的皮肤组织是 以PBS清洗后，剪成ImmX ImmX Imm大小的皮肤组织。
3. 权利要求1获得的皮肤干细胞活性成分的培养方法，包括： 1) 、将分选出的皮肤干细胞接种于培养瓶中，加入5ml皮肤干细胞无血清专用培养基， 在湿度彡95%，温度37°C，0)2体积浓度5%环境下培养，隔2天换液； 2) 、待细胞80%融合后，以0. 25wt%胰酶和0. 02wt%EDTA消化传代，将传代产生的细胞 移入新的培养瓶中； 3) 、重复以上培养、扩增过程，培养过程中根据需要调整最佳的细胞数量； 其中，所述的皮肤干细胞无血清专用培养基为含有50ug/ml牛垂体提取物和5ng/ml hEGF 的 DMEM，pH = 7. 0 ~7. 4。
4. 权利要求1获得的皮肤干细胞活性成分作为治疗脱发的药物的应用。
5. 权利要求1获得的皮肤干细胞活性成分作为治疗脂溢性脱发的药物的应用。
6. 权利要求1获得的皮肤干细胞活性成分作为治疗斑秃的药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种皮肤干细胞活性成分，所述活性成分由皮肤干细胞分泌，存在于培养皮肤干细胞所产生的上清中，以Dlk1+/Sca1?形式表达。本发明获得的皮肤干细胞活性成分应用于治疗脱发中，可以活化机体干细胞，促进毛发的成长增殖，在正常模型和病理模型下的生发效果均好于市售药品米诺地尔或非那雄胺，且具有较高的安全性。
【IPC分类】A61P17-08, A61P17-14, C12N5-071, A61K35-36
【公开号】CN104622904
【申请号】CN201510060414
【发明人】解军, 王登高, 王哲, 牛璐婷, 崔文静, 弓辉, 程海琴, 卜兆丽, 李仁科, 于保锋, 郭睿, 张悦红
【申请人】山西医科大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月5日