一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法。
【背景技术】
[0002] 皮肤是人体面积最大的器官，是机体与外界的机械屏障，具有复杂的组织结构和 多重生理功能。创（烧）伤后皮肤缺损或糖尿病等慢性病所致顽固性皮肤溃疡是临床常见 病症之一，及时有效的创面修复是此类患者救治的基础和核心问题。随着组织工程学的拓 展，应用干细胞技术有望为创面修复提供新的手段。近年来，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)在创伤修复方面的作用日益受到各国学者的广泛关注。MSCs是中胚层 中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体 外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经、汗腺、骨、软骨、脂肪、肝脏、胰腺等多种组织细 胞。脂肪、脐血、脐带、羊水、胎盘来源的MSCs具有取材方便，传代能力强，免疫反应低，被污 染的概率较小，无伦理学限制等优点，逐渐被人们应用于创面愈合等领域。
[0003] 创面愈合是一个非常复杂的病理生理过程，大致分为炎症期、增殖期和重塑期。损 伤严重时，组织持续缺氧、坏死、重度感染等因素使得创面愈合的3个时期被显著延长，愈 合困难。目前的研宄表明，MSCs可以不同程度地影响创面愈合的各个阶段，从而加速创面愈 合。体内研宄表明在炎症期，损伤组织和炎性细胞释放的炎症因子和趋化因子可促进MSCs 迀移归巢到创面，MSCs通过分化为创面修复细胞和旁分泌机制发挥抗炎和抗凋亡作用。在 增殖期，MSCs也可通过旁分泌机制发挥抗菌和促进创面血管形成等作用而加速创面愈合。 在重塑期，MSCs则通过调控创面中I、III型胶原比例实现创面的塑形改造。法舒地尔，英文 名为Fasudil，别名为ΗΑ1077,化学名为六氢-1-(5-磺酰基异喹啉）-I(H)-I, 4-氮杂，为 细胞内Ca2+拮抗剂，蛋白激酶抑制剂。HA1077为Rho激酶特异性抑制剂，它主要是通过抑 制Rho激酶活性而发挥其药理作用。Rho蛋白是细胞的转导通路的信号转换器或分子开关， Rho激活的信号传递与JNK、P38通路有关，而ERK、p38两条信号通路与大鼠骨髓间充质干 细胞诱导向表皮细胞分化相关。研宄表明，HA1077可以促进骨髓MSCs进入S期，增强MSCs 的增殖和分化能力。另外，HA1077也对皮肤缺损创面愈合有促进作用。HA1077联合脂肪、 脐血、脐带、羊水、胎盘来源的MSCs治疗难愈性创面将具有良好临床应用前景。
[0004] 富血小板血浆（PRP)是通过离心全血后得到的血小板的浓缩物，当血小板激活 后，α颗粒释放出多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因 子、血管内皮生长因子等。PRP裂解液中含有较高浓度的生长因子，约为全血中的17倍，其 活性可持5-8天。血小板数与生长因子的浓度呈正相关。PRP裂解液中多种生长因子相互 作用，诱发了细胞内信号传递系统，可促进细胞生长、分化，从而参与一系列组织修复过程。 PRP可促进凝血的作用，也可刺激软组织再生，并促进伤口早期愈合。研宄证实这些生长因 子还可发挥联合作用和协同作用，影响细胞的趋化、增殖和分化。
[0005] 目前，较多的干细胞制剂均单纯采用PBS或生理盐水作为细胞制剂的溶剂，在复 杂的体内环境中，很大程度上限制了干细胞修复创伤愈合的能力，使治疗效果不尽人意。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法。
[0007] 本发明一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂包括间充质干细胞、富血小板血浆裂 解液和法舒地尔溶液，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞或脂肪 间充质干细胞。
[0008] 上述治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
[0009] -、对间充质干细胞传代培养，取P3代~P5代间充质干细胞；
[0010] 二、对P3代~P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能 的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
[0011] 三、制备富血小板血浆裂解液；
[0012] 四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔 溶液，得到干细胞制剂，即完成；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细 胞或脂肪间充质干细胞；重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞（0. 5~5) X IO7 个 /mL〇
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] (1)本发明特点在于汲取了 HA1077、PRP裂解液以及脂肪或脐带或者羊水间充质 干细胞的长处以及三者的最佳配伍，共同完成制剂对皮肤损伤的再生修复功能。
[0015] (2)本发明的间充质干细胞从脐带、脂肪和羊水等组织中获得。间充质干细胞经体 外实验证实具有分化为表皮细胞、成纤维细胞以及血管内皮细胞的潜能，具有取材方便，细 胞数量多，感染风险小等优点，被广泛研宄、应用；脐带和羊水间充质干细胞是从胎儿附属 组织中分离出的多能干细胞，具有更强的增殖分化能力、免疫原性低，因此具有更大的研 宄价值。
[0016] (3)脂肪干细胞具有采集方便、数量多以及对供者伤害小等特点，增加了采集干细 胞的人群数量，在获得干细胞的同时还能达到美容瘦身的效果。
[0017] (4)本发明的富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma，PRP)裂解液中含有高浓度 的生长因子，这些生长因子相互协同可扩大生物效应，促进创面愈合及软组织的修复、提高 创面愈合质量。本实验获得的PRP裂解液可来自患者自身外周血，采用二次离心的方法制 备，可得到更高浓度更高活性的血小板，进而获得高浓度的生长因子，对伤口愈合发挥更大 效用。本方法取材操作简单方便，对患者伤害小，同时避免了应用时的免疫排斥反应，在创 伤修复领域具有良好的应用前景。
[0018] (5)HA1077通过抑制Rho激酶发挥药理作用，而Rho激酶参与了多种细胞功能。 HA1077可促进皮肤缺损创面愈合，与间充质干细胞联合使用可增强其向表皮细胞和脂肪细 胞增殖分化。干细胞、HA1077与血小板血浆中的各种生长因子发挥联合、协同作用，影响细 胞的趋化、增殖和分化，使间充质干细胞发挥更大的作用。
[0019] (6)本发明制备的间充质干细胞制剂可通过肌肉点状注射、皮下组织注射或直接 喷于患处，操作简单，可明显改善伤口愈合并缩短伤口愈合时间，为皮肤溃疡或伤口愈合开 辟新的途径，进而促进皮肤伤口愈合，在临床上具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0020] 图1为试验1中治疗组和对照组的大鼠伤口愈合指数对比情况的柱状图；其中 國为3d后的各组伤口愈合指数，國为7d后的各组伤口愈合指数，Θ为14d后的各 组伤口愈合指数；
[0021] 图2为试验2中治疗组和对照组的大鼠伤口愈合指数对比情况的柱状图；其中 为3d后的各组伤口愈合指数，IB为7d后的各组伤口愈合指数，为14d后的各组 伤口愈合指数；
[0022] 图3为试验3中治疗组和对照组的大鼠伤口愈合指数对比情况的柱状图；其中 _为3(1后的各组伤口愈合指数，?为7d后的各组伤口愈合指数，Θ为Hd后的各组 伤口愈合指数。
【具体实施方式】
[0023] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0024] 一：本实施方式治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂包括间充质干细 胞、富血小板血浆裂解液和法舒地尔溶液，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间 充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
【具体实施方式】 [0025] 二：本实施方式与一不同的是：所述法舒地尔溶液的 浓度为20mM。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0026] 三：本实施方式与一或二不同的是：干细胞制剂中间 充质干细胞的浓度为（〇. 5~5) X IO7个细胞/mL。其它与一或二相同。
【具体实施方式】 [0027] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：干细胞制剂 中法舒地尔溶液的浓度为10~40 μ mol/L。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0028] 五：本实施方式治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下 步骤进行：
[0029] -、对间充质干细胞传代培养，取P3代~P5代间充质干细胞；
[0030] 二、对P3代~P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能 的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
[0031] 三、制备富血小板血浆裂解液；
[0032] 四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔 溶液，得到干细胞制剂，即完成；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细 胞或脂肪间充质干细胞；重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞（0. 5~5) X IO7 个 /mL〇
[0033] 所述脐带间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将脐带通过75%的酒精消 毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2~3cm的段，然后放在平 皿内，剥离华通式胶，再解剖至〇. 2~2mm的块状，然后在细胞培养瓶中培养，原代培养每 3~5d后进行换液，待细胞融合度达到80 %以上后，将细胞培养液收集，然后1300rpm离 心6min，取上清液；将固相物用生理盐水冲洗两次，然后用体积百浓度为0. 25%的胰酶在 37°C下消化3min，加入上清液终止胰酶反应，收集细胞，然后在1300rpm离心6min，再收集 细胞，然后重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终得到脐带间充质干细胞。
[0034] 所述脐带间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将脐带通过75%的酒精消 毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2~3cm的段，然后放在平 皿内，剥离华通式胶，再解剖至〇. 2~2mm3的块状，然后在37°C下经过质量浓度为0. 1 %~ 0. 2%的胶原酶I消化1小时，获得单细胞悬液，计数调节细胞浓度，然后接种于无菌培养 瓶中，置于37°C、C02体积浓度为5%的培养箱中培养，原代培养每3~5d后进行换液，待细 胞融合