度达到80%以上后，将细胞培养液收集，然后1300rpm离心6min，取上清液；将固相 物用生理盐水冲洗两次，然后用体积百分比为0. 25%的胰酶在37°C下消化3min，加入上清 液终止胰酶反应，收集细胞，然后在1300rpm离心6min，再收集细胞，然后重新接种到另一 培养瓶中进行扩增，最终得到脐带间充质干细胞。
[0035] 所述羊水间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，取羊水40mL，1300rpm离心 6min，弃上清取沉淀，用AmnioMAX II complete羊水专用细胞培养基重悬细胞，按照细胞数 为5X IO4个接种于T25瓶，用AmnioMAX II complete细胞培养基补齐至5ml，置于37°C、C02 浓度为5%的CO2培养箱中培养。细胞培养4~6d后换液，当细胞生长融合度达到80%~ 90%时，收集细胞重新接种到另一个的培养瓶中进行扩增，最终得到羊水间充质干细胞。
[0036] 所述脂肪间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将抽脂获得的脂肪组织分 装在离心管中，1300rpm离心6min，将离心后的上层的大块脂肪组织倒入另一离心管中，加 入生理盐水或PBS清洗，于1300rpm离心6min，弃上清取沉淀，以同样的方式反复清洗3-5 次。然后加入3倍体积的质量百分含量为0. 075%的I型胶原酶（取7. 5g胶原酶溶于100mL 灭菌的去离子水中，0. 22微米滤器过滤分装于新的50ml离心管中，使用时100倍稀释）。 于37°C水浴锅中，消化15-30min，每5min轻轻晃动摇匀一次。消化结束后，加入与管中液 体等量的DMEM终止消化，200目筛网滤过，去除消化后产生的碎片组织，然后1300rpm离心 6min，弃上清，加入20ml生理盐水重悬细胞，计数。于1300rpm离心6min，弃上清并加入含 10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，按2~3 X IO6个细胞/T75培养瓶中，并用含有10% FBS 的DMEM将培养瓶中液体补足至11ml，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养。原代培养每3~ 5天换液一次，当细胞生长融合度达到80%时，收集细胞重新接种到另一培养瓶中进行扩 增，最终得到脂肪间充质干细胞。
[0037] 所述富血小板血浆（PRP)裂解液的制备方法：在无菌工作台内，取无传染性、肿瘤 性、血液系统疾病病史的外周静脉血200ml，先测全血血小板数>105X 109/L，全血以200~ 7001300r/min离心10min，此时采血管中全血分为三层，即上层上清液，乳白色中间层和下 层红细胞，收集上清液、乳白色中间层以及2mm红细胞层置于新的离心管中，再次700r/min 下离心15min，收集1/4黄色上清液即为PRP，全自动血细胞分析仪检测合格后。将PRP分 装于EP管中，存于-80 °C冰箱内，使用时将PRP从-80 °C冰箱取出，迅速投入37 °C水浴锅，使 其快速解冻。然后离心，取上清液经〇. 22 μπι无菌滤器过滤即为富血小板血浆裂解液；其中 PRP合格的标准为PRP血小板数要为全血时血小板数的4倍以上。
【具体实施方式】 [0038] 六：本实施方式与五不同的是：步骤二中指标的合格 是指：病毒和细菌检测均为阴性，免疫表型阳性表达率在95%以上，阴性表达率低于2%， 细胞活率至少为95%。其它与五相同。
[0039]
【具体实施方式】七：本实施方式与【具体实施方式】五或六不同的是：步骤三干细胞制 剂中法舒地尔溶液的终浓度为10~40 μ mol/L。其它与【具体实施方式】五或六相同。
[0040] 为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
[0041] 通过以下试验验证本发明的有益效果：
[0042] 试验1、本试验治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法按以下步骤进行：
[0043] 一、对脂肪间充质干细胞传代培养，取P3代脂肪间充质干细胞；
[0044] 二、对P3代脂肪间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的 检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；
[0045] 三、制备富血小板血浆裂解液；
[0046] 四、脂肪间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒 地尔溶液得到干细胞制剂，即完成；干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为（0. 5~5) X IO7 个细胞/mL，干细胞制剂中法舒地尔溶液的浓度为15 μ mol/L，重悬后的富血小板血浆裂解 液中含间充质干细胞（〇. 5~5) X IO7个/mL。
[0047] 步骤一所述脂肪间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将抽脂获得的脂肪 组织分装在离心管中，1300rpm离心6min，将离心后的上层的大块脂肪组织倒入另一离心 管中，加入生理盐水清洗，于1300rpm离心6min，弃上清取沉淀，以同样的方式反复清洗4 次。然后加入3倍体积的质量百分含量为0. 075%的I型胶原酶（取7. 5g胶原酶溶于100mL 灭菌的去离子水中，0. 22微米滤器过滤分装于新的50ml离心管中，使用时100倍稀释）。于 37°C水浴锅中，消化25min，每5min轻轻晃动摇匀一次。消化结束后，加入与管中液体等量 的DMEM终止消化，200目筛网滤过，去除消化后产生的碎片组织，然后1300rpm离心6min， 弃上清，加入20ml生理盐水重悬细胞，计数。于1300rpm离心6min，弃上清并加入含10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，按2~3X IO6个细胞/T75培养瓶中，并用含有10% FBS的 DMEM将培养瓶中液体补足至11ml，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养。原代培养每5天换 液一次，当细胞生长融合度达到80%时，收集细胞重新接种到另一培养瓶中进行扩增，最终 得到脂肪间充质干细胞。
[0048] 为证明间充质干细胞制剂能够治疗慢性皮肤溃疡的疗效，分别将制备后含有间充 质干细胞、PRP裂解液和法舒地尔的干细胞制剂；含有间充质干细胞和富血小板血浆裂解 液的干细胞制剂；间充质干细胞和法舒地尔的干细胞制剂；含等量间充质干细胞的制剂分 别采用皮内注射进入大鼠皮肤患处。本实验采用SD免疫缺陷鼠，雌雄各半，体重约200~ 250g，随机分为对照组和治疗组。通过化学方法灼伤建立皮肤损伤模型，随机将治疗组分为 A、B、C、D组，分别隔离相同环境下饲养。注射2X IO6个细胞的间充质干细胞混合液，对照 组注入等量生理盐水，隔日追加1次用药，药量同第一次。以上各组治疗开始后3d、7d、14d 观察伤口愈合情况，计算伤口愈合指数（WCI):
[0049] WCI (%) = (1-现创面面积/原创面面积）X 100%
[0050] 具体试验分组如下：
[0051] 对照组：生理盐水；
[0052] 治疗A组：本试验制备的脂肪间充质干细胞；
[0053] 治疗B组：本试验制备的脂肪间充质干细胞+本试验制备的PRP裂解液；
[0054] 治疗C组：本试验制备的脂肪间充质干细胞+本试验制备的HA1077 ;
[0055] 治疗D组：本试验制备的干细胞制剂。
[0056] 表1各组大鼠创面愈合WCI的比较（平均数土标准差X土 s，％ )
[0057]
【主权项】
1. 一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于该制剂包括间充质干细胞、富血 小板血浆裂解液和法舒地尔溶液，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干 细胞或脂肪间充质干细胞。
2. 根据权利要求1所述的一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于所述法舒 地尔溶液的浓度为20mM。
3. 根据权利要求1所述的一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于干细胞制 剂中间充质干细胞的终浓度为（〇. 5~5)XIO7个细胞/mL。
4. 根据权利要求1所述的一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于干细胞制 剂中法舒地尔溶液的终浓度为10~40ymol/L。
5. 如权利要求1所述治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于该方法 按以下步骤进行： 一、 对间充质干细胞传代培养，取P3代~P5代间充质干细胞； 二、 对P3代~P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检 测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备； 三、 制备富血小板血浆裂解液； 四、 间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入浓度为20mM的法舒地尔溶 液，得到干细胞制剂，即完成；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、羊水间充质干细胞 或脂肪间充质干细胞；重悬后的富血小板血浆裂解液中含间充质干细胞（〇. 5~5)XIO7个 /mL〇
6. 根据权利要求5所述的治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于 步骤二所述各项指标合格是指：病毒和无菌检测均为阴性，免疫表型的阳性表达率大于 95 %，阴性表率达小于2 %，细胞活率达到95 %以上，具有分化功能。
7. 根据权利要求5所述的治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步 骤三干细胞制剂中法舒地尔溶液的终浓度为10~40ymol/L。
【专利摘要】一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法，涉及一种干细胞制剂及其制备方法。本发明提供一种治疗慢性皮肤溃疡的干细胞制剂及制备方法。该制剂包括间充质干细胞、富血小板血浆裂解液和法舒地尔溶液。方法：一、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测；三、制备富血小板血浆裂解液；四、间充质干细胞重悬于富血小板血浆裂解液，然后加入法舒地尔溶液，即可得到干细胞制剂；本发明可明显改善伤口愈合并缩短伤口愈合时间。本发明用于治疗慢性皮肤溃疡。
【IPC分类】A61K35-50, A61K31-551, A61K35-16, A61K35-51, A61P17-02, A61K35-28
【公开号】CN104784209
【申请号】CN201510204930
【发明人】张怡, 孟庆雪, 付寅生, 芦慧颖, 刘艳青
【申请人】黑龙江天晴干细胞股份有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月27日