用于改善角蛋白表面的细胞中的选择性分解代谢和活力的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于改善角蛋白表面的细胞中的选择性分解代谢和活力的 方法和组合物
[0001] 相关申请的夺叉引用 本申请要求2013年1月07日提交的美国临时申请号61/749, 633的优先权。
技术领域
[0002] 本发明处于增强皮肤细胞中的选择性分解代谢（catabolysis)的用于施用于皮 肤的组合物的领域中。
[0003] 发曰月背景 众所周知，应激和环境侵害因素诸如UV光、污染和香烟烟雾可对皮肤非常有害，并且 加速衰老的出现。暴露于应激和环境侵害因素经常引起对细胞DNA、线粒体和细胞蛋白、月旨 质和组织的损害。细胞内发现的受损细胞物质，例如，细胞质或细胞器碎片可以通过阻止其 正常代谢过程对细胞施加毒性作用。
[0004] 健康细胞具有正常的清洁过程，其消除受损的细胞材料和碎片。此类解毒经 常通过被称为自体吞噬的吞噬过程发生，其中细胞碎片被吞噬在液泡内，并且用细胞酶 诸如溶菌酶降解。自体吞噬和皮肤细胞中自体吞噬活化的机制描述于美国专利公开号 2011/0243983 A1，其以其整体通过引用并入本文。存在很大兴趣配制皮肤处理组合物以含 有刺激细胞自体吞噬的成分，因为细胞自身清洁和解毒碎片的能力得到改善，所述碎片否 则妨碍健康的代谢功能。通过自体吞噬的清洁为细胞功能生成新的能量来源，因为降解产 物释放可以由细胞再循环的构建块（building blocks)，诸如氨基酸。改善的细胞代谢功 能进而意指改善的细胞健康和长寿，和对衰老的不期望的副作用（诸如细纹、皱纹、皮肤斑 驳、色素沉着、松弛等）的更大抗性。
[0005] 已知DNA修复酶以各种方式修复DNA。此类酶通常根据修复的DNA碱基诱变损伤 的类型分类。
[0006] 已经发现，DNA修复酶和自体吞噬活化剂的组合最意料之外地将有利地影响正常 细胞清洁过程，促进细胞的健康和长寿，且最大限度地减少皮肤上的环境、UV光、污染和其 它环境损害的不利影响。
[0007] 因此，感兴趣的是，通过用刺激自然细胞修复过程的成分处理它们通过，例如，消 除细胞碎片和毒素，最大限度地增加细胞健康和细胞（特别是皮肤细胞诸如角化细胞或成 纤维细胞）的长寿，并且另外，通过确保解毒机制的最大数量是可操作的而最大限度地增 加此类细胞解毒的有效性。还感兴趣的是，刺激解毒过程，其中细胞碎片和毒素的降解导致 产生可以被细胞再循环的氨基酸或其它生物分子。
[0008] 因此，有必要通过刺激细胞中的选择性分解代谢而最大限度地增加细胞的健康和 长寿，使得去除细胞碎片和毒素且可以再循环此类降解的副产物。更优选地，选择性分解代 谢是由于增强自体吞噬活性和促进使用DNA修复酶的DNA修复。
[0009] 已经发现，含有至少一种自体吞噬活化剂和至少一种DNA修复酶的组合物用于选 择性细胞分解代谢，即，通过将废产物降解为在正常代谢功能中可由细胞再循环和使用的 分子而清洁细胞的毒性废产物。
[0010] 发明概沐 本发明涉及用于处理角蛋白表面以刺激选择性分解代谢的组合物，其包含至少一种自 体吞噬活化剂和至少一种DNA修复酶。
[0011] 本发明进一步涉及通过将包含至少一种自体吞噬活化剂和至少一种DNA修复酶 的组合物施用于角蛋白表面而刺激此类表面的细胞中的选择性分解代谢的方法。
[0012] 详沭 I.宙义 本文提及的所有百分率是重量百分率，除非另有说明。
[0013] 本文提及的所有文件都以其整体通过引用并入。
[0014] "自体吞噬"意指细胞通过在碎片周围形成膜、将其与细胞的剩余部分分离、且将 形成的液泡与细胞溶酶体接合而自身清洁毒素和碎片的过程，所述细胞溶酶体是含有酸性 水解酶的细胞器，所述酸性水解酶降解液泡中发现的细胞碎片和废物。
[0015] "自体吞噬活化剂"意指刺激正常细胞自体吞噬过程的成分。
[0016] "CLOCK基因活化剂"意指活化角化细胞中存在的一种或多种CLOCK基因的成分。
[0017] 术语"DNA修复酶"意指可操作修复DNA碱基诱变损伤的酶。此类酶经常通过其修 复的DNA损伤的类型分类，例如，BER(碱基切除修复）酶、核苷酸切除修复（NER)酶；错配 修复（MMR)酶；DNA解旋酶；DNA聚合酶等。例如，突变诸如8-氧代-7, 8-二氢-2' -脱氧 鸟苷可以通过OGGl (8-氧代鸟嘌呤糖基化酶）修复；可以通过（核苷酸切除修复（NER)光 解酶）修复的T-T二聚体；6-4光产物（其可以通过NER修复）；和06-甲基鸟嘌呤（其可 以通过06-烷基鸟嘌呤转移酶（AGT)修复）。
[0018] 术语"角蛋白表面"意指皮肤、毛发和指甲。
[0019] "PER1基因活化剂"意指活化角化细胞中发现的一种或多种PERl基因的成分。
[0020] "蛋白酶体"意指通常位于细胞的细胞核或细胞质中的蛋白复合物，其通过蛋白水 解成较小亚单位、所述较小亚单位然后可以进一步消化成单个氨基酸而可操作降解受损细 胞蛋白。这些再循环氨基酸可以在新蛋白的合成中由细胞使用。
[0021] "蛋白酶体活化剂"意指刺激角蛋白表面的细胞（诸如角化细胞、成纤维细胞等） 中的蛋白酶体的活性的活性成分。
[0022] "再循环"意指，关于细胞碎片和毒素的降解，该碎片和毒素可被降解成分子，诸如 蛋白、脂质、氨基酸或由细胞在其正常健康代谢过程中可用的其它生物材料。
[0023] "修复"意指，关于皮肤细胞，细胞的受损部分诸如DNA、线粒体、蛋白、脂质或其它 细胞材料得到减少或消除。
[0024] "选择性分解代谢"意指，关于角蛋白表面的细胞，该细胞能够选择性自身清洁碎 片、废物和毒素，而不损害健康的细胞成分，且优选通过机制诸如活化细胞的自体吞噬或活 化细胞的蛋白酶体过程中的一者或两者而实现。
[0025] II.自体吞噬活化剂 本发明的组合物含有至少一种成分，所述成分可操作活化正常细胞的自体吞噬过 程。所述自体吞噬活化剂以范围为约0.00001% -20%、优选0.0001 % -15%、更优选约 0. 001% -10%的量存在。通常，细胞的自体吞噬过程包含四个一般步骤。步骤1是液泡形 成的起始；步骤2,初始液泡或自体吞噬体（其隔离待降解的细胞质材料）的形成。步骤3 是自体吞噬体成熟为降解的液泡。步骤4是隔离材料的实际降解。
[0026] 具有自体吞噬活化活性的成分可以通过其刺激或抑制各种细胞代谢途径的能力 来鉴定。例如，刺激MAP-LC3、ATG5-12、蛋白p53、AMPK或DRAM的表达的成分是合适的自体 吞噬活化剂。抑制mTOR的表达的成分也是合适的自体吞噬活化剂。
[0027] 基因MAP-LC3编码微管相关蛋白1轻链3,即起始自体吞噬体的形成的蛋白。 ATG5-12还刺激自体吞噬体的形成。mTOR，也被称为雷帕霉素的哺乳动物目标，也被称为雷 帕霉素或FK506结合蛋白12-雷帕霉素相关蛋白I(FRAPl)的机械目标。FRAPl由FRAP基 因编码。抑制mTOR的表达且参与自体吞噬体生成的任何成分将具有自体吞噬活化特性。 也适合作为自体吞噬活化剂的是刺激角化细胞中的蛋白p53、AMPK和/或DRAM(损害补救 自体吞噬调节蛋白）的表达的成分。蛋白 P53,也被称为肿瘤抑制蛋白，由p53基因编码。 AMPK意指AMP活化蛋白激酶和DRAM，损害相关的自体吞噬调节剂。两者都已知刺激角化细 胞中的自体吞噬活化。
[0028] 因此，对所述基因具有上述作用的任何成分可以是合适的自体吞噬活化剂。在自 体吞噬过程期间，细胞碎片诸如氧化蛋白和过氧化脂质被降解。此类细胞碎片经常影响正 常的代谢功能。筛选成分以通过上述刺激或抑制细胞、优选角化细胞、基因和/或蛋白的能 力测定效力可以根据如美国专利公开号2011/0243983或本领域中已知的其它方法记载的 方法来进行。
[0029] 例如，用于鉴定可以是自体吞噬活化剂的成分的一种通用方法是通过首先在培养 细胞诸如角化细胞中诱导营养应激。例如，细胞首先在具有生长因子的完全培养基中培养， 持续约24小时。然后去除培养基，并且用非营养培养基（例如，不含有生长因子的培养基） 替换。细胞在营养应激状态中培养约30分钟至约25小时。然后，去除非营养培养基，并且 用完全培养基替换以促进细胞回收率。此后，通过在那些细胞中测量MAP-LC3 ;ATGS-12 ;磷 酸化的mTOR ;磷酸化的p53 ;DRAM ;或磷酸化的AMPK中的一种或多种的表达评价细胞的自 体吞噬活性。此类表达的测量可以通过免疫荧光测量发生。此外，该表达可以通过与表达 的基因相关的磷酸化蛋白的Western印迹分析来验证。
[0030] 已知对上面提及的基因施加刺激或抑制作用（其进而刺激自体吞噬）的成 分的实例是酵母提取物，所述酵母提取物包括但不限于来自诸如以下的属的那些：石 枝藻属（Zi从〇 腫)、草木樨属植物JrO ()、柑橘属植物（CY tras)、念珠菌属 (CaWit/a)、Ze/751、尊麻属（Cr(ica)、杨桃属、苦瓜属（#c_〇T￡/ica)、耶氏酵 母属（7ar/wia)、白花丹属植物等。进一步的具体实例包括嗜1?石枝藻 {Lithothamniumncalcareum) {Melilotusofficinalis) {Citrus 腫)、saitoana 念珠菌(Candidasaitoana)>Lensculinaria^^ j#{Urticat/ioica)、杨桃（JFerrAoa caraffi/w/a)、苦瓜ca 、解脂耶氏酵母 {YarrowiaIipolyticd)UjIumbagozeylanicd)等。
[0031] 还合适的是成分诸如盐酸胺碘酮，GF 109203X，其也被称为（3-(N-[二甲基氨 基]丙基-3-吲哚基）-4-(3-吲哚基）马来酰亚胺3-[1-[3-(二甲基氨基）丙基]IH-吲 哚-3-基]-4- (1H吲哚-3-基）IH-吡咯-2, 5二酮二吲哚基马来酰亚胺I ;N-己酰 基-D-鞘氨醇；氯硝柳胺；来自吸水链霉菌（的雷帕霉 素；咖马林（Rottlerin)，其也被称为（I-[6-[(3-乙酰基-2, 4, 6-三羟基-5-甲基苯基） 甲基]-5, 7-二羟基-2, 2-二甲基-2H-1-苯并吡喃-8-基]-3-苯基-2-丙烯-1-酮， Mallotoxin) ;STF-62247,也被称为5-吡啶-4-基-噻唑-2-基-m-甲苯基-胺；他莫昔 芬（Tamoxifen);替西罗莫司（Temsirolimus)，其也被称为42-[3_羟基-2-甲基丙酸醋， CCI-779，雷帕霉素；ATGl自体吞噬相关1同源物；ATG1，丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶ULK1， 051-样激酶；或236，其也被称为（(2)-5-氟-1-(3'-二甲基氨基）丙基-3-[(5'-甲氧 基吲哚-3-亚基）甲基]-吲哚啉-2-酮；或1-[3-(二甲基氨基）丙基]-5-氟-1，3-二