专利名称：用于防止和改善代谢性骨病的食品材料和包含这些材料的用于代谢性骨病的预防药/治疗药的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防或改善由骨质疏松症导致的代谢性骨病的饮料和食品，也涉及用于这样代谢性骨病的预防药和/或治疗药。
背景技术：
骨骼是重要的组织，它用作结构支架以支撑身体，也支撑用于体液的矿物质控制系统，该系统作为各种矿物质如钙和磷的贮存库。在骨组织中，骨发生或骨形成和吸收总是保持活性以用新的骨骼代替旧的骨骼。特别是在生长已经完成的骨骼中，骨形成系统中的成骨细胞和骨吸收系统中的破骨细胞彼此密切相关，以重复骨形成和骨吸收，这样保持骨组织并且体液中的矿物质保持恒定。此骨重建称为“骨改造”。此骨改造由身体因素，激素，细胞因子等精确控制，同时保持一定的平衡。然而，如果此平衡受到扰乱和骨吸收超过骨形成，骨质量降低。在骨质量的这些病理性降低中，骨组分正常的那一个称为“骨质疏松症”。
已知骨质疏松是健康问题之一，当逐渐老化时许多人受到骨质疏松的困扰，特别是经常发生在绝经后妇女身上。骨质疏松倾向于导致股骨颈的骨折，象脑血管意外一样，是许多“卧床不起老人”的原因，对社会造成不利影响。因此，迫切需要对骨质疏松进行适当治疗，以避免它的恶化，也迫切需要建立有效的预防方法。迄今为止已经开发和在临床上应用维生素D制剂、降钙素制剂、二磷酸盐制剂等，作为用于骨质疏松症的药物。然而，目前的情况是这些努力还没有开发出令人满意的有效药物。
在目前情况下，还没有建立起令人满意的上述骨质疏松症的治疗方法，它的预防是重要的。理论上，即使当逐渐老化时，也可以保持骨质量在较高的水平，条件是在青春期和成熟期骨质量可以尽可能地增加，这样增加的骨质量可以保持较长的时间和可以将绝经后骨质量的降低抑制到甚至很少。为达到此目的，必须在整个儿童期，青春期和成熟期摄取合适的钙。然而，仅有钙的摄取是不足够的。如果有具有防止或改善骨质疏松症等功能的食品材料，希望向日用食品中加入这些材料，通过每日饮食，能够成功地防止或改善骨质疏松症。此外，希望在这些食品材料中活性成分的识别和分离，使得可以使用它们作为骨质疏松症的预防药或治疗药。
在此期间，发现众所周知用作凝血因子的维生素K也参予骨代谢并已经引起兴趣，导致维生素在K2制剂在日本的市场化，该制剂作为用于改善骨质量和骨质疏松症疼痛的药物。此外，其中包含或维生素K1或维生素K2的食品材料更多地投放到市场上。
考虑到上述情况，本发明的目的是提供一种用于代谢性骨病，特别是骨质疏松症的预防和/或改善的新颖食品材料。本发明的另一个目的是提供用于代谢性骨病的预防和治疗的药物。
发明概述为达到上述目的，本发明人对食品材料进行了广泛的筛选和研究。结果是，已经发现口服丙酸菌和/或乳酸菌培养物，可以增加骨质量和骨强度。已经发现包含有效量培养物的食品可有效预防或改善由骨质疏松症引起的代谢性骨病。也已经发现包含在培养物中的2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌及其类似物可有效促进成骨细胞的分化和功能表达，并且也可有效抑制破骨细胞的形成，导致这样的发现，即这些化合物可用作代谢性骨病的预防药和/或治疗药。
具体来说，本发明涉及(1)一种具有骨发生促进功能的饮料或食品，包括作为活性成分的丙酸菌和/或乳酸菌的培养物(此后它可称为“发酵产物”；和“丙酸菌的培养物”也可称为“BGS”)或选自如下物质的萘醌化合物2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐。
(2)如以上(1)描述的饮料或食品，其中活性成分是丙酸菌和/或乳酸菌的培养物。
(3)如以上(1)描述的饮料或食品，其中培养物是培养物上清液和/或细胞。
(4)如以上(1)描述的饮料或食品，其中活性成分是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌(此后它可称为“ACNQ”)。
(5)如以上(1)描述的饮料或食品，其中丙酸菌是费氏丙酸杆菌。
(6)如以上(1)描述的饮料或食品，其中乳酸菌是乳酸乳球菌乳亚种。
(7)丙酸菌和/或乳酸菌的培养物或选自如下物质的萘醌化合物用于生产具有骨发生促进功能的饮料或食品的用途2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐。
(8)如以上(7)描述的丙酸菌和/或乳酸菌的培养物的用途。
(9)如以上(7)描述的用途，其中培养物是培养物上清液和/或细胞。
(10)如以上(7)描述的用途，其中丙酸菌是费氏丙酸杆菌。
(11)如以上(7)描述的用途，其中乳酸菌是乳酸乳球菌乳亚种。
(12)一种用于代谢性骨病的预防药或治疗药，包括作为活性成分的萘醌化合物，它选自2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐，或丙酸菌和/或乳酸菌的培养物。
(13)如以上(12)描述的预防药或治疗药，其中萘醌化合物是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
(14)如以上(12)或(13)描述的预防药或治疗药，其中代谢性骨病是骨质疏松症。
13.萘醌化合物，它选自2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐，或丙酸菌和/或乳酸菌的培养物用于生产代谢性骨病的预防或治疗药物的用途。
(16)如以上(15)描述的用途，其中萘醌是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
(17)如以上(15)描述的用途，其中代谢性骨病是骨质疏松症。
(18)一种代谢性骨病的治疗方法，该方法包括给予萘醌化合物，萘醌化合物选自2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐，或丙酸菌和/或乳酸菌的培养物。
(19)如以上(18)描述的治疗方法，其中萘醌化合物是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
(20)如以上(18)描述的治疗方法，其中代谢性骨病是骨质疏松症。
附图简述
图1是在允许SD大鼠随意摄取包含2％或10％BGS粉末的精饲料之后，SD大鼠的胫骨矿物质密度(mg/cm2)图，图2是说明大鼠的股骨断裂能量(mJ)的图，和图3显示相对于大鼠股骨干重的钙数量(mg/g)。在
图1-3中，棒表示平均值±标准误差(p＜0.05)。
图4是在各种ACNQ浓度下将小鼠骨髓的基质细胞系ST-2细胞培养3天之后，衍生的碱性磷酸酶的活性图，和图5说明通过MTT测定细胞的有活力的细胞计数(在595nm处的吸光率)的图。
图6说明通过1α，25(OH)2D3，维生素K2，ACNQ，和1α，25(OH)2D3与ACNQ的结合积累的Ca对人体成骨细胞(SaM-1)的效果。
图7说明通过1α，25(OH)2D3，维生素K2，ACNQ，和1α，25(OH)2D3与ACNQ的结合积累的P对人体成骨细胞(SaM-1)的效果。
图8说明通过1α，25(OH)2D3，维生素K2，ACNQ，和活性1α，25(OH)2D3与ACNQ的结合对人体成骨细胞(SaM-1)的细胞毒性。
图9说明ACNQ和维生素K1对在人体骨髓细胞培养中TRAP-阳性多核细胞的作用。
图10说明当在1α，25(OH)2D3或ACNQ存在的情况下，将衍生自新生ddY小鼠颅骨的成骨细胞状间质细胞和衍生自相同品系小鼠的骨髓细胞共培养时，对破骨细胞形成的影响。
图11说明当在ACNQ存在的情况下，将衍生自新生ddY小鼠颅骨的成骨细胞状间质细胞和衍生自相同品系小鼠的骨髓细胞共培养时，破骨细胞的活性。
进行本发明的最好方式在根据本发明的药物和饮料或食品中，上述萘醌化合物，丙酸菌的培养物和乳酸菌的培养物都是可用的。在萘醌衍生物中，特别优选是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌(ACNQ)。这ACNQ已知是可得的，例如，来自丙酸菌的培养物(属于丙酸杆菌属的微生物)(JP-A-07-227207，JP-A-07-289273，JP-A-10-304871)。另一方面，不是ACNQ的萘醌化合物也可从丙酸菌的培养物得到(JP-A-08-98677)。已知这些萘醌衍生物和丙酸菌的培养物具有增生双歧杆菌属的活性，但完全不知道它们是否对代谢性骨病有效。
丙酸菌的示例是用于奶酪的丙酸菌，如费氏丙酸杆菌、梢氏丙酸杆菌、产丙酸丙酸杆菌和詹氏丙酸氏杆菌；贪婪丙酸杆菌；疮疱丙酸杆菌；嗜淋巴丙酸杆菌；和颗粒丙酸杆菌。费氏丙酸杆菌的例子可包括费氏丙酸杆菌IFO 12424和费氏丙酸杆菌ATCC 6207。
乳酸菌的示例是属于乳酸杆菌属、链球菌属、和乳球菌属、或明串珠菌属的细菌。乳酸杆菌可包括，例如，嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种；链球菌可包括，例如，嗜热链球菌；乳球菌可包括，例如，乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌乳亚种；明串珠菌可包括，例如，肠膜明串珠菌乳脂亚种和乳明串珠菌。
可以通过已知方法，获得丙酸菌或乳酸菌的培养物。例如，作为在高浓度下培养丙酸菌的方法，可以在介质上培养丙酸菌，该介质是通过将矿物质和单糖加入到浓缩乳清蛋白质(WPC)或其酶解产物上面制备的(JP-A-10-304871)。作为培养丙酸菌的有效方法，可以培养双岐菌和丙酸菌，同时通过不同的培养箱循环培养液。这些循环方法可用于本发明的实施。本领域技术人员也可以改进在这些已知方法中的介质的成分，培养条件等(溶解氧浓度等)，可以使方法进一步优化。关于氮来源，例如，通过特别进行除酪蛋白或WPC以外，来自各种氨基酸(及其盐)的作用的研究，和对培养条件(厌氧培养或需氧培养)的研究，优化(细胞计数的增加和BGS骨代谢活性的增加)是可行的。因此，这些改进方法也被本发明包括。
在通过从培养物中除去细胞获得的滤液中，也在细胞的甲醇提取物中，发现BGS的双岐杆菌增生活性(Kaneko，T.等J.DairySci.，77，393-404，1994)。也认为在培养物上清液和细胞中发现骨代谢活性。因此，在此使用的术语“BGS”，例如包括丙酸菌和/或乳酸菌的所有自身培养物，培养物上清液和细胞，和它们的提取物，干燥粉末，稀释液等。
BGS的加工形式物可以大致地分成粉末形式物和液体形式物。为将BGS转变成粉末形式物，将脱脂乳粉末、乳清粉末、原淀粉、糊精等作为赋形剂直接加入到培养物中，以将培养物中的固体含量调节到30-40wt.％，并将这样制备的培养物喷雾干燥；或将培养物和赋形剂的再构溶液混合在一起，浓缩混合物直到它的固体含量增加到30-40wt.％，将这样浓缩的混合物喷雾干燥。通过在填充(填充氮气，加入脱氧剂等)时施加脱氧处理，这样制备的BGS可以贮存较长的时间。作为赋形剂，除上述赋形剂以外，如需要，可以使用WPC、分离乳清蛋白质(WPI)和加工的淀粉(除糊精以外，溶解性淀粉、糊精(British gum)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)。此外，可以将BGS配制成磨碎的制剂(0.2％磨碎制剂)，以便于它在食品中使用。
另一方面，通过萃取和精制，可以从丙酸菌的培养物中收集萘醌化合物(JP-A-07-289273)。生产包含萘醌的发酵产物的微生物的例子，可以包括拟杆菌属细菌，如普通拟杆菌JCM5826T和脆弱拟杆菌ATCC 2375；芽孢杆菌；肠球菌属；拟杆菌科；链球菌科；和肠杆菌科。
此外，也可以通过化学合成获得萘醌化合物。例如，可以从市售的1，4-二羟基萘甲酸作为起始材料，通过四个步骤获得ACNQ(JP-A-10-36238)。
这些萘醌化合物的示例性盐是从制药和食品科学的观点可以接受的盐。代表性的盐可包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、乳酸盐、和柠檬酸盐。然而，应当说明的是这些盐仅是说明性的，本发明并不限于这些盐。
用于本发明的萘醌化合物可包括立体异构体和旋光异构体。这些异构体都可用于本发明。
上述萘醌化合物增强了成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，它是骨发生的指标，并促进了矿化。尽管抑制了破骨细胞的分化和成熟，它们即不抑制破骨细胞的活性，也不显示抗破骨细胞的细胞毒性。即，这些萘醌化合物和培养物用作代谢性骨病的预防药和/或治疗药，也用作用于代谢性骨病预防或改善的饮料或食品。这些预防药，治疗药，饮料和食品的特别独特之处在于它们以结合形式具有两种效果，促进骨形成和抑制骨吸收。
关于BGS和ACNQ，以下说明书会涉及骨代谢的某些方面，特别是对于在体外测定系统中和在体内测定系统中骨形成作用和骨吸收作用的研究结果。
在BGS的体内测定系统中，相对于对照组，口服摄取BGS显著地增加股骨矿物质密度和胫骨矿物质密度，股骨的破坏能量和股骨的Ca含量。具体来说，在体内试验中已经显示口服摄取BGS显著地增加骨质量和骨强度(
图1，2和3)。为分析BGS的这种骨发生促进效果，进一步的研究ACNQ对骨代谢的作用，ACNQ是用于双岐杆菌的增生活化成分。
骨骼由骨发生细胞如成骨细胞，骨吸收细胞如破骨细胞，各种间质细胞(成纤维细胞，脂肪细胞，网状细胞)，和造血干细胞组成。在这些细胞彼此合作的网络中，形成骨组织。
首先，进行ACNQ对骨发生的研究。在骨发生中，成骨细胞起主要的作用。在生长之后的骨骼中，成骨细胞移动到由破骨细胞形成的骨吸收腔隙中，并且骨发生开始以补充吸收的骨骼。前成骨细胞活跃地增生，并逐渐获得成骨细胞的分化特性。分化进一步进行，通过成熟的成骨细胞，发生已形成骨基质的矿化以完成骨发生。作为成骨细胞分化的指标，除各种基质蛋白质以外，ALP的表达和它的活性增加是最重要的。
因此，在其中加入ACNQ的介质中培养ST-2细胞(骨髓基质细胞建立的细胞)，和测量ALP活性，作为与成骨细胞分化有关的指标。ACNQ促进至多1μg/mL浓度的浓度依赖的成骨细胞的形成(图4)。即，ACNQ浓度依赖的促进从骨髓基质细胞分化成成骨细胞。此外，ACNQ在高达1μg/mL的浓度时并不显示细胞毒性(图5)。
尽管还没有说明在ALP活性和矿化之间的关系，由于此酶的遗传缺陷导致骨骼发育异常的发生，认为ALP在矿物中起重要的作用。因此，认为ALP活性的增加促进了成骨细胞的矿化。因此，根据人体成骨细胞(SaM-1)的矿化促进效果，测定ACNQ的骨形成效果。SaM-1细胞具有成骨细胞的所有特性，并已知在2mM的α-甘油磷酸存在的情况下钙化，该甘油磷酸依赖于1α，25(OH)2D3(活性维生素D3)的浓度(Koshihara，Y《生物化学与生物物理学研究通讯》Biochem.Biophys.Res.Commun.，145，651-657，1987)。因此，在各种浓度ACNQ存在的情况下，培养SaM-1细胞，和测量在基质上积累的Ca和P的数量。ACNQ在10-5M-10-7M下浓度依赖性的促进矿化(图6和7)。另一方面，根据在培养物上清液中游离LDH的测量结果，ACNQ在10-5M-10-7M下并不显示在细胞毒性(图8)。
从以上结果，已经发现在10-5M-10-7M的非常低浓度下，ACNQ促进了骨发生，和在这些浓度下并不显示细胞毒性。
下一步进行ACNQ对骨吸收的影响的另外研究。破骨细胞是骨吸收细胞，它来源于巨噬细胞系的造血干细胞，并在对于骨组织特异的环境下，由于骨吸收因子的刺激而形成。从前破骨细胞(存在于骨髓中)的破骨细胞的体外形成中，可以分析ACNQ的功能。可以使用骨髓细胞的培养物、骨髓细胞和成骨细胞的共培养物、脾细胞和成骨细胞的共培养物等，作为用于形成破骨细胞的培养系统。骨髓细胞与1α，25(OH)2D3一起的培养物导致多核破骨细胞的形成，多核破骨细胞对耐酒石酸盐的酸性磷酸酶成阳性，该磷酸酶是破骨细胞的标记酶。
因此，在1α，25(OH)2D3或ACNQ存在的情况下培养人体单核细胞，和研究ACNQ对TRAP-阳性多核细胞的形成的影响，该多核细胞由1α，25(OH)2D3诱导。在10-8M-10-5M下，ACNQ浓度依赖性抑制了破骨细胞的形成(图9)。在相同的浓度下，与从维生素K1得到的抑制效果相比，它的抑制效果显著更强。
也对TRAP-阳性细胞进行另外的研究，TRAP-阳性细胞由衍生自新生小鼠的颅盖骨的原发的成骨细胞样间质细胞和小鼠骨髓细胞共培养系统形成。在1.5μg/mL或更高的条件下，ACNQ极大地抑制破骨细胞的形成(
图10)。然后研究ACNQ对骨吸收系统活性的影响。通过衍生自新生小鼠的颅盖的原发成骨细胞样间质细胞和小鼠骨髓细胞的共培养物，测量破骨细胞形成系统中吸收腔隙的形成和对一片牙本质的细胞毒性，该间质细胞。ACNQ并不抑制分化和成熟的破骨细胞的骨吸收活性(
图11)。此外，ACNQ并不显示抗破骨细胞的细胞毒性(
图11)。这种情况表示ACNQ在功能上并不损害分化和成熟的破骨细胞。
从以上结果，已经发现，当口服摄取BGS时，它显示增加骨质量和增强骨强度的效果。另一方面，ACNQ，它被认为是BGS的主要活性成分之一，显示非常独特的骨代谢效果，该效果在于它增强了成骨细胞的形成和促进了骨发生，另一方面，它抑制破骨细胞的形成，但形成的破骨细胞功能正常(具有骨吸收活性)。认为BGS的上述骨发生促进活性得益于BGS中各种成分的结合效果，但毫无疑问地认为它的大多数依赖于ACNQ的效果，ACNQ以非常小的数量包含在BGS中。
在此期间，也发现维生素K与骨代谢有关系，维生素K作为凝血因子为人所熟知，导致对此维生素的兴趣增加。在本质上，维生素K1和K2一起存在。维生素K1和K2通常含有萘醌主链，不同之处仅在于键合到主链上3-位的侧链，和通常包含键合到主链1-位上的甲基。维生素K1是单一化合物，但依赖于键合到3-位上的异戊二烯数目，维生素K2包括14种同系物。其中，仅有包含4个异戊二烯单元的维生素K2-4(香叶基香叶醇)促进骨发生，抑制骨吸收，抑制骨质量的降低。研究维生素K1或K2的侧链对骨吸收的影响。结果是，确定香叶基香叶醇，维生素K2-4的侧链，具有和维生素K2-4相同程度的破骨细胞形成的抑制效果。伴随地，叶绿醇，它是维生素K1的侧链，具有较弱的抑制效果，维生素K2的侧链，该侧链包含2-7个异戊二烯单元(4个异戊二烯单元除外)，分别不显示抑制效果，但显示阳性效果(Hara，K.等《骨》(Bone)，16，179-184，1995)。
与维生素K1和K2相似，本发明中的ACNQ也含有萘醌主链。然而，氨基和羧基分别键合到主链的2-位和3-位上。考虑到维生素K1或K2的骨代谢活性依赖于它的上述侧链，认为它们彼此完全不同。
上述培养物和萘醌化合物每种都促进骨代谢，可以按有效量加入到每日摄取的食品中，用于生产用于骨质疏松症的预防或改善的食品。对于培养物和/或萘醌化合物要加入的食品，没有特别的限制。然而，在日本，可以采用被批准以要求卫生保健用途或限制用途的规定食品(用于伤残人的食品，用于老年人的食品，特定的卫生食品)作为优选的例子。在日本以外的国家，可以采用批准在标签上包括健康要求(保健食品)的食品。
在用于代谢性骨病的预防或改善的饮料或食品中，可以使用上述萘醌化合物。然而，从安全，健康和卫生的观点出发，优选使用衍生自天然材料的那些，特别优选的是丙酸菌的培养物。每种培养物不仅仅包括它自身，也包括它的溶剂提取物及其加工和处理产物(例如，其中包含细胞的培养物、细胞和培养物上清液的提取物；和它们的浓缩物、干燥产物、稀释液等)。
例如，为在每种食品中保留活性成分的活性，优选加入抗坏血酸钠作为稳定剂。根据作为活性成分的萘醌化合物的含量，计算要加入的培养物的数量(参见，例如参考例2)。例如，可以按0.5-10wt.％的数量，加入培养物。
根据本发明的组合物，它适用于饮料或食品，可以按自身使用。作为替代，组合物也可与如下物质一起加入从食品科学观点可接受的载体，和一种或多种食品营养物，例如，一种或多种维生素、矿物质、氨基酸等。在此使用的术语“从食品科学观点可接受的载体”包括粘合剂、赋形剂、防腐剂、和着色剂。
上述萘醌化合物和培养物一般可以按普通药物组合物的形式使用。
可以使用如下在制药上可接受的载体制备这些药物组合物例如，稀释剂、例如，填料、增充剂、粘合剂、润湿剂、分解剂、表面活性剂或润滑剂、或赋形剂。对于这些药物组合物，可以根据治疗目的选择各种形式物。这些形式物的代表性例子可包括片剂、丸剂、粉末、液体、悬浮液、乳液、颗粒、胶囊、阴道栓剂、和注射液(溶液、悬浮液)。
可以考虑到患者的情况，如他的或她的年龄和体重、给药路径、疾病的本质和严重程度等，而理想地确定用于代谢性骨病的预防药或治疗药的剂量。然而，一般情况下，按照萘醌化合物在口服给药情况下的数量，每日剂量可为0.5-100mg/kg。然而，在一些情况下，小于上述范围的剂量可能是足够的，或相反，可能要求大于上述范围的剂量。上述剂量可以每天以2-4次给予。
由于骨发生需要钙，可以使用钙制剂和在根据本发明药物的给药时，以结合的方式给予钙制剂。此外，也可以使用骨吸收抑制剂[例如，活性维生素D2、活性维生素D3、降钙素、雌激素、异丙氧黄酮(“Osten”，商品名)等]和将骨吸收剂结合给予。
实施例基于参考例和测试，此后描述本发明的某些具体实施方案。然而，本领域技术人员可以理解的是在本发明的范围之内，各种改进是可行的。
参考例1[BGS粉末的生产]在采用8N的NaOH将乳清粉末的10w/w％再构溶液调节到pH7.0之后，以每克乳清粉末6.79mg的比率加入蛋白酶(“Amano A”，Amano EnzymeInc.的产品)，随后在50℃下酶解2小时。在反应期间，用8N的NaOH将反应混合物保持在pH7.0。将反应混合物在85℃下加热10分钟，以使酶失活，然后冷却到35℃。在加入0.1w/w％酵母菌提取物之后，采用4N的HCl将获得的混合物调节到pH6.7，并在121℃下杀菌7分钟，以提供培养介质。
费氏丙酸杆菌株，ATCC6207(此菌株号是例子)，预先已经在TPY介质中定态孵化(参见JP-A-7-289273的实施例1)，作为接种物，以2％浓度接种到上述培养介质中。将培养温度设定为35℃，将细菌培养72小时，同时采用8N碳酸钾水溶液，将培养物保持在pH6.0。伴随地，采用氮气置换培养箱的顶部空间，和在100-150rpm条件下进行搅拌。在加入0.5w/w％抗坏血酸钠之后，将培养物121℃下杀菌15秒。以培养物固体含量四倍的数量，加入脱脂奶粉，随后进行喷雾干燥。这样干燥的粉末的含量是0.56μg/g。
参考例2[ACNQ的分析](1)培养物向其中包含细胞的培养物(0.5m)中，加入1N盐酸(0.05m)，纯净水(2mL)和丙酮(2.5mL)，将获得的混合物在200rev/min下摇动60分钟。加入乙酸乙酯(2.5mL)，并在200rev/min下摇动30分钟之后，进行离心(2,500rpm，4℃，5分钟)。此外，采用乙酸乙酯(7.5mL)萃取水层两次。将有机溶剂层浓缩，溶于甲醇(200μL)，并通过HPLC分析。如下是HPLC条件。
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测试1[BGS对骨质量和骨强度的影响(在体外测试中)]允许雄性SD大鼠随意摄取各自的精饲料(根据AIN-93G组成制备)-它分别包含2％和10％的参考例1的BGS粉末，时间为四周。在制备测试饲料时，考虑到源自于BGS粉末的蛋白质、乳糖、钙、磷和镁，在测试饲料之间进行平衡。根据AIN-93G组成，制备对照饲料，它包含20％的酪蛋白。
结果是，在这三组中，在后升高的体积增量或饲料效率中，没有发现差异。在这三组中，在股骨或胫骨干重中没有发现差异。考虑到骨密度，与对照组相比，以10％BGS粉末饲养的组显示显著更高的数值，以2％BGS粉末饲养的组显示较高数值的倾向，尽管与对照组相比，倾向不显著(
图1)。至于股骨的断裂能量，与对照和以2％BGS粉末饲养的组相比，以10％BGS粉末饲养的组显示显著更高的数值，与对照组相比，以2％BGS粉末饲养的组显示较高数值的倾向，尽管倾向不显著(图2)。至于股骨钙水平，另一方面，与对照组相比，以10％BGS粉末饲养的组显示显著更高的数值，与对照组相比，以2％BGS粉末饲养的组显示较高数值的倾向，尽管倾向不显著(图3)。
从那些体内测试的结果来看，已经发现口服摄取BGS可以增加骨矿物质密度，可以增强断裂能量并可以增加钙的积累。换言之，已经发现BGS具有这样的效果，当它口服摄取时，能促进骨发生以增加骨质量和骨强度。
测试2[ACNQ的骨发生促进效果]将衍生自小鼠骨髓的间质细胞系ST-2的细胞(Udagawa，N.等《内分泌学》125，1805-1813，1989)用作成骨细胞。对于作为成骨细胞的骨髓细胞，这些细胞具有相似的破骨细胞分化诱导能力。
将细胞在96-孔板中，以4×104细胞/孔接种，在RPMI1640介质中培养1天，该介质含10％FBS，青霉素G和链霉素。
将该介质以包含ACNQ的相同的介质替代，进一步培养3天。在培养之后，测定细胞的ALP活性。
以PBS洗涤细胞，然后采用乙醇固定1分钟。加入37℃的酶反应溶液(缓冲剂，包含对硝基苯基磷酸酯，0.1M甘氨酸，1mM的MgCl2和0.1mM的ZnCl2作为基质，pH10.5)，使细胞在37℃下反应30分钟。加入等量的0.05N NaOH以骤冷反应。ALP活性以单位表示，如根据在415nm处的吸光度测量，一个单位代表相对于每mg蛋白质，在1分钟内形成的对硝基苯酚量)。使用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Lab.的产品)，测量蛋白质含量。此外，通过MTT测定，测量ACNQ的细胞毒性(图5)。
细胞的ALP活性在至多1μg/mL的ACNQ浓度内浓度依赖性地增加，ALP活性达到大约1μg/mL浓度的峰值(图4)。在ALP活性的峰值浓度下，完全没有观察到细胞毒性(图5)。
采用的是培养的人体成骨细胞(SaM-1)，它是从20岁男性尺骨的骨膜建立起来，该骨膜在骨折的外科手术期间获得。这些SaM-1细胞具有成骨细胞的所有特征(Koshihara，Y等体外细胞，Dev，Biol.，25，37-43，1989)。已知在2mM α-甘油磷酸存在的情况下，根据1α，25(OH)2D3的浓度，SaM-1细胞促进矿化。
将18PDL(群体倍增浓度)的SaM-1细胞接种到12孔板中，培养到汇合态。然后加入α-甘油磷酸，一种矿化促进剂，达到2mM。向培养系统中，分别加入10-8M-10-9M的1α，25(OH)2D3，10-5M-10-6M维生素K2(2-甲基-3-全-反式-四苯基-1，4-萘醌；甲萘醌)，10-5M-10-7M的ACNQ，和10-9M的1α，25(OH)2D3+10-5M-10-6M的ACNQ，随后培养32天。向对照物中，加入溶剂，DMSO，使得它的含量基于培养物达到0.1％。通过等分的介质，在每个第二天更换培养物，该等分试样分别包含相应的测试物质。以作为羟磷灰石组分的Ca和P的数量表达矿化程度。
(1)细胞外基质中钙的定量化通过使用基于邻甲酚酞氨羧络合剂方法(OCPC方法)的试剂盒(“钙C测试Wako”)，将在每种细胞外基质中的Ca定量化。
在培养完成之后，采用Hanks溶液洗涤细胞。以0.5mL/孔的条件加入骤冷的5％高氯酸，随后在摇动条件下，在4℃下萃取15分钟。将每个萃取物(25μL)与缓冲剂(2.5mL)混合。加入包含OCPC(0.4mg/mL)和8-喹啉醇的染色溶液(250μL)，随后进行搅拌。五分钟之后，通过吸收比色仪(570nm)测量反应混合物(图6)。
(2)细胞外基质中磷的定量使用由Chen等人建议的方法，将在每种细胞外基质中的P定量化(Chen，P.S.等《化学年报》(Anal.Chem.)，28，1756-1758，1956)。
以3∶3∶1(体积比)的比例，混合0.84％钼酸铵，2N硫酸和10％抗坏血酸，以制备反应试剂。采用蒸馏水(800μL)，稀释在上述Ca定量化中获得的每个提取物(100μL)。向每个稀释液中，加入反应试剂(2.1mL)，随后在45℃下孵育20分钟。在采用水冷却之后，通过吸收比色仪(570nm)测量反应混合物(图7)。
从图6和图7中可以看出，已经肯定1α，25(OH)2D3在10-8M-10-9M浓度范围内浓度依赖性地促进矿化。另一方面，已经确定ACNQ在10-5-10-7浓度范围内浓度依赖性地促进矿化。
(3)ACNQ的细胞毒性使用“LDH-细胞毒性测试Wako”(细胞毒性测定试剂盒)，测量每种培养物上清液中的游离LDH，以研究ACNQ的细胞毒性。在培养的第32天，采集培养物上清液的试样，在染色反应之后，通过使用微量滴定板阅读仪(540nm)，测量它们的LDH浓度。
结果是，没有发现ACNQ在10-5M-10-7M下与对照物有显著性差异，并不确定在这些浓度下显示细胞毒性(图8)。
测试4[ACNQ的破骨细胞形成抑制效果](1)将在人造骨上端更换操作期间获得的人体骨髓细胞，进行密度-梯度离心以收集单核细胞。将那些单核细胞接种到α-MEM介质中，该介质包含20％孕马血清和10-8M的1α，25(OH)2D3，以得到8×105细胞/孔079cm2，然后培养17小时。将每种培养物每周更换两次，每次更换它的体积的一半。在开始进行ACNQ的加入。
在培养的第16天，采用链霉菌蛋白酶和EDTA处理培养物，以消除基质细胞。在第二天，将细胞以PBS(-)洗涤和然后采用福尔马林固定。将福尔马林固定的细胞进行TRAP染色，并测量各个孔的TRAP-阳性多核细胞计数。使用维生素K1作为对照物。
在10-8M-10-5M下，ACNQ浓度依赖性地抑制了破骨细胞的形成(图9)。
(2)采用酶的方式，处理新生ddY小鼠的颅盖(采用胶原酶和消散橙(disperse)的混合溶液)，以获得原发成骨细胞状间质细胞。另一方面，从相同品系的小鼠(6-9周龄雄性鼠)的股骨和胫骨分离骨髓细胞。在ACNQ存在的情况下，共培养原发成骨细胞状间质细胞和骨髓细胞，以研究ACNQ对破骨细胞的分化诱导效果。
使用添加10％FBS的αMEM，在10-8M-10-10M的1α，25(OH)2D3存在的情况下，将培养物共培养6-8天，培养物包含细胞计数比为约1∶20的原发成骨细胞状间质细胞和骨髓细胞。在培养时间期间，在培养介质更换时(更换一半体积的培养介质；每三天更换一次)，分别加入各种浓度的ACNQ溶液和作为用于比较的对照物，维生素K2(已知它抑制破骨细胞的形成)。
收集TRAP染色阳性和每个细胞内包含3个或更多个细胞核的细胞作为分化的破骨细胞。就在它的使用之前，通过在N，N-二甲基甲酰胺(约0.5mL)中溶解底物(萘酚AS-MX磷酸盐；5mg)和着色剂(坚牢红紫LBsat；25mg)，制备TRAP染色溶液，并将获得的溶液中加入包含50mM酒石酸钠的0.1M乙酸钠缓冲剂(pH5.0)。在从培养的细胞中除去培养介质之后，将细胞用PBS洗涤，采用包含10％福尔马林的PBS固定5分钟，然后采用乙醇-丙酮(1∶1)再固定1分钟。在空气中干燥之后，在室温下，将细胞与TRAP染色溶液反应10-15分钟。将这样反应的细胞以水洗涤，然后干燥。在显微镜下观察细胞以进行破骨细胞计数。在0.15-15μg/mL的浓度下，ACNQ浓度依赖地抑制存在于骨髓细胞中的单核细胞的分化和成熟为破骨细胞(
图10)。
测试5[ACNQ对骨吸收的影响]进行ACNQ对在一小片牙本质上骨吸收腔隙形成的影响，该腔隙是由破骨细胞形成的。
如在测试4的试验(2)中一样，在αMEM介质(其中已经加入10％FEB和10-8M的1α，25(OH)2D3)的胶原凝胶上，在100mm培养皿中，在1×106细胞-1×107细胞的比例下，将培养物共培养6-8天，培养物包含原发成骨细胞状间质细胞，它衍生自新生ddY小鼠的颅骨，和骨髓细胞，它从相同品系小鼠的股骨和胫骨分离得到。每三天更换一次介质。在培养之后，加入0.2％胶原酶溶液。在37℃下，将这样获得的混合物轻轻摇动20分钟，以消化胶原凝胶，并收集分化诱导的破骨细胞状多核细胞。由此方法获得的破骨细胞计数至多为4×104细胞/100mm-培养皿。
采用包含10％FBS的αMEM介质，将那些破骨细胞状多核细胞制备成4×103/mL，以100μL/孔下接种到孔(96孔)中，其中分别放置一片牙本质，在37℃下培养2小时。在培养之后，将单个培养物转移到24孔或48孔中，其中以0.5-1.5mL/孔放置培养介质。同时，分别将各种浓度的ACNQ溶液加入到孔中，随后在37℃下培养24小时。在培养之后，除去培养介质，采用Mayer’s酸性苏木精染色溶液，染色牙本质片较短的时间。在除去染色溶液之后，在显微镜下计数在每个牙本质片表面上形成的吸收腔隙，该吸收腔隙的形成是由于成骨细胞的结合。结果显示为基于对照物(未加入ACNQ)中吸收腔隙计数的吸收腔隙计数(％)，推想它为100％。即使在较高的浓度下，即7.5μg/mL浓度下，ACNQ并不降低破骨细胞的骨吸收活性(
图11)。这表示ACNQ并不抑制分化和成熟的破骨细胞的骨吸收活性，这样的指示也得到ACNQ并不显示抗破骨细胞的细胞毒性的事实支持。
工业实用性丙酸菌和/或乳酸菌的培养物，它用于本发明，可以加入到食品中，和希望食品的摄取能预防或改善代谢性骨病，特别是骨质疏松症。此外，2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌和萘醌衍生物，它们包含在培养物中，用作代谢性骨病的预防药或治疗药。
权利要求
1.一种具有骨发生促进功能的饮料或食品，包括作为活性成分的丙酸菌和/或乳酸菌的培养物或选自如下物质的萘醌化合物2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐。
2.根据权利要求1的饮料或食品，其中该活性成分是丙酸菌和/或乳酸菌的培养物。
3.根据权利要求1的饮料或食品，其中该培养物是培养物上清液和/或细胞。
4.根据权利要求1的饮料或食品，其中该活性成分是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
5.根据权利要求1的饮料或食品，其中该丙酸菌是费氏丙酸杆菌。
6.根据权利要求1的饮料或食品，其中该乳酸菌是乳酸乳球菌乳亚种。
7.丙酸菌和/或乳酸菌的培养物或选自如下物质的萘醌化合物用于生产具有骨发生促进功能的饮料或食品的用途2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐。
8.根据权利要求7的丙酸菌和/或乳酸菌的培养物的用途。
9.根据权利要求7的用途，其中该培养物是培养物上清液和/或细胞。
10.根据权利要求7的用途，其中该丙酸菌是费氏丙酸杆菌。
11.根据权利要求7的用途，其中该乳酸菌是乳酸乳球菌乳亚种。
12.一种用于代谢性骨病的预防药或治疗药，包括作为活性成分的萘醌化合物，它选自2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐，或丙酸菌和/或乳酸菌的培养物。
13.根据权利要求12的预防药或治疗药，其中该萘醌化合物是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
14.根据权利要求12或13的预防药或治疗药，其中该代谢性骨病是骨质疏松症。
15.萘醌化合物，它选自2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐，或丙酸菌和/或乳酸菌的培养物用于生产代谢性骨病的预防或治疗药物的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中该萘醌是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
17.根据权利要求15的用途，其中该代谢性骨病是骨质疏松症。
18.一种代谢性骨病的治疗方法，该方法包括给予萘醌化合物，萘醌化合物选自2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3-二氯-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘醌、8-羟基-1，4-萘醌、2-(α-羟基-δ-甲基戊烯基)-5，8-二羟基-1，4-萘醌及其盐，或丙酸菌和/或乳酸菌的培养物。
19.根据权利要求18的治疗方法，其中该萘醌化合物是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌。
20.根据权利要求18的治疗方法，其中该代谢性骨病是骨质疏松症。
全文摘要
本发明涉及具有骨发生促进功能的饮料或食品,每种饮料或食品包括作为活性成分的有效量的丙酸菌和/或乳酸菌的培养物,该培养物包含2－氨基－3－羧基－1,4－萘醌;和用于代谢性骨病的预防药和/或治疗药,每种药包括作为活性成分的萘醌化合物,萘醌化合物选自2－氨基－3－羧基－1,4－萘醌、1,4－萘醌、2－羟基－1,4－萘醌、2,3－二氯－1,4－萘醌、5－羟基－1,4－萘醌、8－羟基－1,4－萘醌、2－(α－羟基－δ－甲基戊烯基)－5,8－二羟基－1,4－萘醌及其盐。上述培养物和萘醌衍生物促进骨代谢,从而增加骨质量和骨强度。
文档编号A23L1/03GK1382043SQ00814566
公开日2002年11月27日 申请日期2000年10月18日 优先权日1999年10月19日
发明者永井和夫, 禹济泰, 佐藤吉朗, 桥本光一郎, 竹友直生, 依田伸生, 土田博 申请人:明治乳业株式会社