健肾丸抑制小鼠T淋巴瘤细胞E.G7-0VA细胞增殖的实验研宄资料 1实验材料 I. 1实验用细胞株 小鼠T淋巴瘤细胞E.G7-0VA细胞增殖，上海酶联检测技术有限公司，DMEM+10%FBS常 规培养。
[0017] 1.2实验药物 研宄药物：本发明壮腰健肾丸：按实施例3方法制备。
[0018] 药液储液：称取IOOmg壮腰健肾丸，溶于5ml无水乙醇中，0.2ym滤器过滤， 500yIdoff管分装，-20°C存储，同时0. 2ym滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0019] 1.3实验试剂 DMEM(卡迈舒(上海）生物科技有限公司批号：20141102);胎牛血清FBS(广州蕊特 生物科技有限公司批号：20141005) ;NaHC03 (广州市昱浩贸易有限公司批号：20140505); Trypsin(上海雅心生物技术有限公司批号：20140401);EDTA(广州崇骏化工有限公司批 号：2012/10);PenicillinGSodiumSalt(大连美仑生物技术有限公司批号：20110214); StreptomycinSulfate(上海浩然生物技术有限公司批号：20130809);无水乙醇（南 阳市恒鑫光电物资有限公司批号：140910145);MTT(上海博谷生物科技有限公司批号： 20141023);PBS(实验室自配）； 1. 4实验器材 金相倒置显微镜（SEEPACK型号：L-323);可见-紫外光微孔板检测仪(德国Eppendorf型号：PlateReaderAF2200) ;C02培养箱(启前型号：QQ-80A-II);超净台（东莞市利安达环 境科技有限公司型号：LCJT-2A);纯水仪(超康型号：CK);精密移液器（BG-easyPIPET移 液器S1000);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BP211D);全自动高压灭菌锅(上海 博迅公司型号：YXQ-LS-75SII);台式电热鼓风干燥箱(苏州江东精密仪器有限公司型号： DHG-9123A);液氮罐（四川山立低温设备有限公司型号：CMSH100);低速离心机上海家舜玻 璃仪器有限公司型号：TDL-40B);0. 2ym滤器(密理博：MPGP02001);10cm培养皿（泰州市建 军医疗用品厂）、96孔培养板(泰州市建军医疗用品厂）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips 若干。
[0020] 2实验方法 I)E.G7-0VA细胞用DMEM+10%FBS于37 °C、5%C02进行常规培养（IOcm培养皿)，当 细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白 酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转 入离心管中，1000 rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。
[0021] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180y1，培养板放入细胞培养箱 中（37 °C，5%C02 )常规培养。
[0022] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入壮腰健肾丸溶液，继续培养24h。
[0023] 4 ) 24h后加入 20yIMTT溶液（5mg/ml，即 0? 5%MTT)，继续培养 4h。
[0024] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200y1二甲基亚砜，置摇 床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0025] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0026] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示： 细胞增值抑制率（％)=(对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值X100%。实验重 复3次。
[0027] 3统计处理 采用MicrosoftExcel2003软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean土S.D?表不。
[0028] 4实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对PC-3细胞增殖抑 制有差异（P〈〇. 05)，剂量在lOmg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂量达到15-20mg/ ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
注：与对照组比较，*P〈〇. 01 ;#P〈〇. 001 5实验结论 壮腰健肾丸可以抑制E.G7-0VA细胞增殖，减少E.G7-0VA细胞的细胞生长数目，该作用 呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种壮腰健肾丸的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成狗脊 1876g，黑老虎1125g，千斤拔450g，桑寄生563g，女贞子94g，千斤拔1125g，金樱子600g， 牛大力750g，菟丝子94g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取黑 老虎、桑寄生、女贞子加入到〇)2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为3 - 5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10 - 20MPa，萃取时间 30-60min，第二次萃取压力20 - 30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压力40 - 50Mpa， 萃取时间45-75min，温度45 - 55°C，CO2流量3 - 5ml/g生药.min,得超临界萃取物，备用； 取千斤拔、金樱子、菟丝子，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率500W，萃取2次，每次8-12分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上， 50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用； 其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次3h，合并煎液，真空减压浓缩至相对密度1. 05-1. 15 (50°C)，0. 22-1ym微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波提取物和滤液 混合，加入淀粉，混和，每100g粉末加炼蜜85g制成小蜜丸，即得。2. 根据权利要求1所述一种壮腰健肾丸的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%。3. 根据权利要求1所述一种壮腰健肾丸的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W，每次萃取10分钟。4. 根据权利要求1所述一种壮腰健肾丸的制备方法，其特征在于所述C02超临界萃取 的萃取采用等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间45min，第二次萃取压 力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间60min，萃取温度50°C，0)2流 量 4ml/g生药?min〇5. 根据权利要求1所述一种壮腰健肾丸的制备方法，其特征在于所述水煎煮工艺取8 倍水煎煮两次，每次3h，真空减压浓缩至相对密度1.10 (50°C)，0.45ym微孔滤膜滤过。6. 根据权利要求1所述一种壮腰健肾丸在制备抑制小鼠T淋巴瘤细胞E.G7-0VA细胞 增殖药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种壮腰健肾丸的制备方法，由狗脊1876g，黑老虎1125g，千斤拔450g，桑寄生563g，女贞子94g，鸡血藤1125g，金樱子600g，牛大力750g，菟丝子94g作为原料药制成，采用超临界萃取、微波萃取和微孔滤膜过滤制备而成，使得有效成分含量有很大提高，本发明还提供了壮腰健肾丸在制备抑制小鼠T淋巴瘤细胞E.G7-OVA细胞增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/738, A61K9/20
【公开号】CN104906221
【申请号】CN201510321563
【发明人】符正南, 张志涛, 汤小燕, 陈雨, 吴智斌, 李智洋
【申请人】广东恒诚制药有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月12日